IHC påvisning af CD3 og F4/80 antigen i CIA musepotevæv

Transkript

1 IHC påvisning af CD3 og F4/80 antigen i CIA musepotevæv Bachelorprojekt af Mikkel Malik Høegh Nygaard Nielsen Kilde Billede fra laboratoriet på Novo Nordisk Bioanalytikeruddannelsen CVU Øresund Nordisk Projektperiode Februar til Juni 2009 Øresund Vejleder Pernille Autsen Usher, Novo Vejleder Lise Christine Hansen, CVU

2 Indholdsfortegnelse Forkortelser... 2 Resume... 3 Introduktion... 3 Problembaggrund... 3 Formål... 4 Problemformulering... 4 Begrebsdefinitioner... 4 Metodevalg... 4 Teori... 5 Forbehandling og demaskering Primær antistofbehandling... 8 Detektion og visualisering... 8 Materialer og metoder Materialer Metoder Resultater Diskussion Konklusion Perspektivering Referenceliste Bilag... 1

3 Forkortelser ABC: Avidin-biotin-kompleks BSA: bovint serum albumin CIA: collagen induced arthritis EDTA: Ethylendiamintetraacetat EGTA: Ethylenglycoltetraacetat Glas: Objektglas til lysmikroskopi. F.eks. Superfrost Plus glas fra Menzel. HIER: Heat Induced Epitope Retrieval- Varmeinduceret demaskering HRP: Horse Radish Peroxidase - peberrods peroxidase IHC: immunhistokemi MBO: Mikrobølgeovn NO: Natten over PIER: Proteolytic enzyme Induced Epitope Retrieval - Enzym induceret demaskering TBS: Tris buffer solution TEG: Tris EGTA buffer TNB: Tris NaCl Dupont blocking reagent TSA: Tyramid signal amplification 2

4 Resume CIA dyremodellen er en dyremodel for Rheumatoid artritis. CIA modellen er indtil nu kun blevet vurderet med histokemiske metoder. For at få et større indblik i sammensætningen af celler i det inflammatoriske væv i CIA modellen, forsøges en differentiering af cellerne ved hjælp at IHC. Indkøring af IHC protokoller på CIA musepotevæv med CD3 (SP7) og F4/80 [CI:A3-1] antistoffer til påvisning af T-lymfocytter og makrofager er formålet med denne rapport. Potevævet var fikseret i 4% paraformalin og afkalket i 7 dage i Immunocal. Demaskering med forskellige koncentrationer af Proteinase K, HIER i mikrobølgeovn med TEG ph9 og HIER ved 60 C i TEG ph9 natten over blev afprøvet. Påvisning af CD3 med det anvendte antistof viste sig særdeles vanskelig pga. at CIA potevævet faldt af objektglasset ved demaskering med mikrobølgeovn. Optimering af adhæsion blev forsøgt med forskellige metoder til tørring vævet på glassene og superfrost plus og superfrost ultra plus evne til adhæsion blev sammenlignet. Undersøgelsen fandt ikke en metode til påvisning af T-lymfocytter i CIA potevæv. Påvisning af makrofager med F4/80 [CI:A3-1] lykkedes ved brug af proteinase K til demaskering, Vectastain var detektionssystemet og den primære antistof koncentration var på 4µg/ml. Introduktion Problembaggrund Rheumatoid artritis (RA) er en systemisk autoimmun sygdom, den er karakteriseret ved at synovialvævet i led får en inflammation, der nedbryder brusk og senere hen knogle i leddet. 1 % af den danske befolkningen, ca mennesker menes ramt af sygdommen i Danmark, årligt opdages ca nye tilfælde. Årsagen til RA er ikke klarlagt, men det menes, at flere faktorer spiller ind bl.a. virus eller bakterier samtidig med en eksisterende inflammation. Der er forskellige former for behandling, der dog ikke kan kurere patienterne. Til fremstilling af nye lægemidler ses på rollerne for de forskellige leukocytter i inflammationen, bl.a. T-lymfocytter og makrofager. Collagen induced arthritis (CIA) er den mest benyttede dyremodel til undersøgelse af RA. Dyrene bliver immuniserede med bl.a. kollagen, der fremprovokerer et immunrespons i dyret. Responset kommer til udtryk ved dannelse af antistoffer imod 3

5 kollagen, og da kollagen er stærkt præsenteret i leddene vil antistofferne også binde sig der. Antistoffernes binding er starten på en inflammation i leddene, der ligner RA inflammation i humant væv. Nuværende end-point analyse af CIA forsøg er den kliniske score og histopatologisk evaluering. Ved at introducere immunhistokemiske analyser vil man dels kunne opnå en mere detaljeret end-point analyse med information om hvilke celletyper, der evt. er påvirket af en given behandling, og dels få øget viden om patogenesen i CIA. Formål Undersøgelsen skal finde frem til IHC-protokoller til påvisning af F4/80 positive celler og CD3 positive celler i CIA musepotevæv Problemformulering Hvilken epitopdemaskering, primær antistofkoncentration og detektionssystem giver en optimal immunhistokemisk visualisering af CD3 og F4/80 på afkalket, formalinfikseret og paraffinindstøbt CIA musepotevæv, visualiseret med DAB? Begrebsdefinitioner Optimal immunhistokemisk visualisering: Der sker kun en visualisering af CD3 og F4/80 antigen i vævet. Visualiseringen viser positive celler med både høj og lav koncentration af CD3 eller F4/80 antigen. Lokalisation og morfologi af cellerne stemmer overens med litteraturen. Metodevalg Der er rigtig mange muligheder ved immunhistokemiske metoder, det kan derfor være svært at begrænse sig. Laboratoriet undersøgelsen skal udføres kan sætte nogle begrænsninger i sig selv i forhold til apparatur. Valget af lysmikroskopi kom ud fra en større erfaring og lettere tilgængelighed i forhold til f.eks. fluorescensmikroskopi. Mikrobølgeovn blev valgt som varmekilde til HIER da det er en metode der er velkendt og der er mange erfaringer at arbejde ud fra. Vævet der arbejdes med var på forhånd valgt efter en længere tids inhouse afprøvning af præparationsmetode af musepotevævet. Valg 4

6 af væv til positive kontroller blev valgt da lokalisationen af T-lymfocytter og makrofager er vel beskrevet i histologi litteraturen. Da det er musevæv der skal undersøges skulle der findes nogle antistoffer rettet imod mus. Thermo scientific der producerer det monoklonale kanin CD3 (SP7) antistof, skriver at de har afprøvet antistoffet på humant, bavian, abe, heste, hunde og kattevæv. Andre har dog afprøvet det på mus og det viser krydsreaktion med musevæv. Der var ikke mange antistoffer at vælge imellem til kanin IgG isotype kontrol, faktisk var det valgte antistof Rabbit (DA1E) mab IgG isotype kontrol lige kommet på markedet da forsøgene skulle til at påbegyndes. Den første protokol til F4/80 antistoffet blev sat sammen med inspiration fra et laboratorium der også arbejdede med musepotevæv. Denne protokol var årsagen til valget af F4/80 [CI:A3-1] antistoffet. Til indkøringen af F4/80 valgtes Vectastain som detektionssystem da valget stod mellem Envision+ og Vectastain. Fravalget af Envision+ skete kun fordi der på laboratoriet ikke fandtes et sekundært antistof kanin anti rotte eller mus anti rotte, da Envision kun findes som ged anti mus eller ged anti kanin. For at et forsøg kunne medtages i resultaterne skulle kontrollerne passe. Teori F4/80 antigenet findes i mus og er et medlem af EGF-TM7 familien. Epidermal growth factor. Denne familie repræsenterer receptorer i membranen på celler hovedsageligt fra immunsystemet. F4/80 udtrykkes af modne makrofager i forskellige væv, f.eks. kupfferceller i lever og Langerhanske celler i hud. Makrofager/kupffer celler i leveren ligger i sinusoiderne i mellem hepatocytterne. Makrofager/kupffer celler har uregelmæssige overflader, med størstedelen af overfladen ud mod blodet i sinusoiderne [1 og 2]. CD3 antigen præsenteres i membranen på T-lymfocytter og regnes for at være den mest specifikke T-cellemarkør [3]. Det tilhører immunglobulin superfamilien. En IHC farvning gennemgår en række trin for til sidst at ende med en visualisering af f.eks. et protein. Disse trin og deres formål beskrives nedenfor. Præparation demaskering Primært antistof detektion visualisering 5

7 Præparation Hvis væv skal mikroskoperes skal det skæres i tynde skiver. Skæringen gør at vævets celler ødelægges og dør. Da man ønsker at se vævet så nativt som muligt skal det stabiliseres. Dette gøres ved hjælp af fiksering. Formaldehyd fikserer vævet gelerende, hvilket vil sige at formaldehydet binder proteinerne i vævet sammen med methenbroer. Dette giver en moderat god histologisk bevaring med moderat grad af tværbinding [4]. Skæring af paraffinindstøbt væv kan give problemer hvis vævet indeholder knogle og brusk. Tilfredsstillende paraffinsnit af hårdt væv kræver forudgående fjernelse af mineralsaltene. Det opnås ved at fjerne calcium i vævet, f.eks. ved hjælp af myresyre. Hvis syre benyttes som afkalkningsmiddel kan der forekomme artefakter i vævet hvis ikke processen standses i tide [4]. Ligeledes kan antigener ødelægges under processen, det er dog ikke et udpræget problem ved brug af myresyre [5]. Formalin er hydrofilt og paraffin er hydrofobt. Væv fikseret i formalin skal derfor igennem en proces hvor vandet i vævet fjernes så paraffin kan trænge ind. Det kan gøres ved at køre vævet igennem en række af alkoholer i stigende koncentration. En vævspræpareringsmaskine har dette til formål, en Pathos er et eksempel herpå. Forbehandling og demaskering. Da det på forhånd ikke er til at sige, hvilken metode der er den bedste i forhold til antistoffet, må man prøve sig frem. I det efterfølgende beskæftiger opgaven sig udelukkende med formalinfikseret, parafinindstøbt væv. Når vævet er forbehandlet og skal have demaskeret antigenerne, er det svært, rent teoretisk, at sige hvilken demaskering der er bedst for det antistof der skal indkøres. Derfor prøver man sig frem. Fiksering af væv har til formål at bevare vævets morfologi bedst muligt. Formalin er et gelerende fiksativ, hvilket vil sige, at det bl.a. virker ved at etablere tværbindinger mellem visse aminosyreradikaler i proteinerne. Den mest brugte udgave af formalin er neutralt buffet formalin (NBF). Dette fiksativ bevarer vævsmorfologien på glimrende vis. Men i forhold til immunreaktion maskeres mange antigener ved formalinfiksering og derfor skal de fleste parafinpræparater demaskeres inden antistofbehandling. 6

8 Der findes forskellige former for demaskering og de to mest anvendte er enzym- og HIER-demaskering. De anvendte enzymer er proteolytiske enzymer. Enzymernes demaskerende effekt er noget uklar [3] Men nogle af de vigtigste faktorer er dog deres evne til at spalte peptidbindinger i umiddelbar nærhed af methenbroerne skabt ved formalinfikseringen. Dette åbner for nogle skjulte antigenepitoper. En anden faktor er enzymets evne til fraspaltning af blokerende nabomolekyler og en sidste er, at vævet bliver mere permeabelt gennem spaltningen af proteinerne. Ikke alle antigener her glæde af enzymbehandling og kan svækkes eller helt forsvinde. Virkningen må derfor komme an på en prøve. Der er forskellige faktorer der indvirker på enzymets demaskerende effekt. Temperaturen har en betydning for enzymets aktivitet, stigende temperatur giver stigende aktivitet indtil temperaturen bliver så høj at enzymet denaturer. Proteinase K er et meget anvendt enzym til demaskering. HIER er en forkortelse af Heat Induced Epitop Retrieval, på dansk varmeinduceret demaskering. Heller ikke denne tekniks præcise mekanisme er kendt [3, 4, 5, 6]. Meget tyder dog på at teknikken har følgende virkninger, formaldehydinducerede tværbroer brydes, kompleks bundne og epitopmaskerende Ca-ioner fjernes, vævet rehydreres med forbedret penetration til følge og en vis proteindenaturering sker med en blotlæggelse af skjulte epitoper til følge. Temperaturen har betydning for effektiviteten af demaskeringen og det samme har væsken præparaterne bliver opvarmet i, kogemediet. Der er to egenskaber for et kogemedie der har stor betydning, dets ph og dets evne til at kompliksbinde eller udfælde calciumioner. Til formålet er en del buffere afprøvet og fundet egnede til demaskering af antigener. Endnu engang kan det ikke siges på forhånd, hvilken buffer der passer bedst til hvilken antigen-antistof reaktion og det er derfor hensigtsmæssigt at opstille et testbatteri af buffere, for at for at finde den mest egnede. Demaskering kan udføres ved forskellige temperaturer [3,5,6]. HIER omkring C kaldes lav temperatur HIER. Denne metode kræver som regel også en lang inkubationstid, nogle antigener demaskeres først efter 12 timer. Den mest anvendte HIER er i MBO og derfor over kogepunktet. Med denne metode holdes tiden nede, mange antigener demaskeres efter min. Fordelen ved lav temperatur HIER er at vævet ikke koges, hvilket kan være hårdt med vævet og ødelægge antigenerne eller få vævet til at falde af glasset. 7

9 Primær antistofbehandling Når forbehandlingen og demaskeringen er færdig er det tid til at inkubere vævet med det primære antistof. Her er der også forskellige parametre der spiller ind. Disse parametre er temperatur, inkubationstid og antistof koncentration. Temperaturen hænger sammen med inkubationstiden på den måde at jo højere temperatur jo kortere inkubationstid. Inkubationstiden hænger sammen med fortyndingen på den måde at jo længere tid der inkuberes jo lavere koncentration er nødvendig for at antistoffet når at binde til antigenet. Antistoffer deles op i om de er polyklonale eller om de er monoklonale. Polyklonale antistoffer reagerer med flere forskellige epitoper på antigenet. Monoklonale antistoffer reagerer kun med en epitop på antigenet. Polyklonale antistoffer regnes for at være mere sensitive end monoklonale og monoklonale regnes for at være mere specifikke end polyklonale. Et andet emne er blokering af uspecifik antistofadhæsion. Når antistoffer kommer i kontakt med væv, kan der opstå uspecikke bindinger f.eks. gennem elektrostatisk tiltrækning og hydrofob interaktion. Disse kan blokeres ved at præinkubere med en proteinopløsning, der konkurrerer med antistofferne med hensyn til hydrofob interaktion. Det kan være med serum, f.eks. bovint serum albumin og/eller et detergent, f.eks. Tween 20. Skummetmælk har også vist sig som en effektiv bloker. Proteinopløsningen bruges ikke kun som forbehandling, men også som tilsætning til fortynderbuffere. Der skal også tages hensyn til en anden uspecifik antistofadhæsion, nemlig Fcreceptorer på celler i vævet. Antistoffernes Fc-del vil binde sig til receptorerne hvis ikke de bliver blokeret. I formalinfikserede paraffin indstøbte væv er dette dog ikke noget problem, da det lader til at denne forbehandling i sig selv blokerer receptorerne på cellerne. Detektion og visualisering Efter det primære antistof er inkuberet i vævet er det tid til at detektere det. Dette gøres ved indirekte teknik eller direkte teknik. Direkte teknik vil sige, at det primære antistof er mærket og derfor kan visualiseringen ske efter inkubationen af det primære antistof. Det er en simpel og hurtig teknik, men den er dog ikke særlig sensitiv. Den indirekte teknik sker ved inkubation med et mærket sekundært antistof. Et eksempel på en indirekte teknik er detektionssystemet Envision+. Det er en indirekte 8

10 polymerforstærkningsteknik, hvilket vil sige at antistoffer der binder sig til Fc-delen af det primære antistof er fastgjort til dextran, der er en fleksibel polymer. Sammen med antistofferne, er Horse Radish peroxidase(hrp) også bundet til dextranen. Når det sekundære antistof har bundet sig til det primære antigenet visualiseres. Et andet indirekte detektionssystem er Vectastain, som er en avidin-biotin-kompleks(abc) teknik. Denne teknik benytter sig af avidins og biotins store affinitet for hinanden. Avidin har fire bindings steder for biotin. I ABCteknikken bruges en biotinyleret label som f.eks. HRP, og avidin. Avidin og den biotinylerede label blandes sammen og herved dannes komplekser med avidin og biotinen på labelen (ABC). Det er vigtigt at der stadig er frie bindingssteder på avidinen. Et biotinyleret sekundært antistof bindes til det primære antistof og herefter tilsættes ABC hvor de frie bindingssteder på avidinen binder med biotinen på det sekundære antistof. Ved tilsætning af kromogen vil HRP reagere med kromogenet, hvorved det oxideres til et tungtopløseligt farvet produkt. Et eksempel på et meget anvendt kromogen er, 3,3'-Diaminobenzidin (DAB). Kromogen udfældningen er synlig i et lysmikroskop. Biotin er et protein findes i varierende mængder i cellerne i vævet. Det er derfor ABC-teknik (Vectastain) Envision+ TSA: signal forstærkning nødvendigt at blokere for den endogene biotin inden man detekterer det biotinylerede sekundære antistof. En teknik til det er at tilsætte avidin til vævet så det binder sig til den endogene biotin og derefter tilsætte biotin i en stor nok mængde til at alle bindingssteder på avidinen bindes med biotin og derefter skylles evt. overskydende biotin ud af vævet. 9

11 Et HRP baseret detektionssystem kan forstærkes yderligere ved brug af Tyramid Signal Amplifikation (TSA). Først detekteres med et HRP baseret detektionssystem f.eks. Vectastain. Så tilsættes biotinyleret tyramid og H 2 O 2. HRP fra detektionen katalyserer aktiveringen af tyramidet der bliver til et fri radikal. Det frie radikal vil så bindes til elektronrige aminosyreradikaler. Da det frie radikal er uhyre reaktivt vil reaktionen ske i umiddelbart nærhed af HRP. Biotinen kan så detekteres med et avidin biotin baseret detektionssystem, f.eks. Vectastain igen. Hele detektionssystemet bliver så Vectastain- TSA-Vectastain. Kernefarvning benyttes i IHC for bedre at kunne bedømme hvor præcis immunreaktionen er i vævet i forhold til vævs og cellemorfologien. En typisk anvendt kernefarvning er Mayers Hæmatoxylin. Koncentrationen i farveopløsningen er afgørende for hvor længe et snit skal have. Materialer og metoder Materialer Væv Alt benyttet væv er murint. Bagpoter fra inhouse eksperimenter blev benyttet.. 2 CAIA poter og 24 CIA poter med forskellige kliniske score (se bilag). Poterne er forskåret mellem tredje og fjerde finger, fikseret i 10% paraformalin i 48 timer. Derefter afkalkning i Immunocal (myresyre) i 7 dage. Poterne er overført til 70% ethanol indtil vævsfremføring. Vævsfremføring til paraffin er udført på Pathos (se program i bilag). Milt og colon er fra inhouse eksperimenter, fikseret 48 timer i 10% paraformalin. Levervævet er fra inhouse eksperiment og perfusionsfikseret med 10 %formalin. Milt, colon og levervæv er vævsfremført til paraffin på en TP

12 Reagenser Kode Lot koncentration Firma Blokering uspecifik antistof adhæsion: BSA 30% A K7552 Sigma Skim milk JA DIFCO Do serum mg/ml Jackson Biotin: Biotin blocking system X DAKO Endogen peroxidase: H 2 O zu Merck Antistoffer Primære, monoklonale: F4/80 [CI:A3-1] (Rotte) mg/ml Abcam CD3 (SP7) (kanin) RM-9107-S0 9107S806E 200ug/ml Thermo Scientific Sekundære: Æsel anti kanin Biotinyleret ,4mg/ml Jackson Æsel anti rotte Biotinyleret ,4mg/ml Jackson Isotype kontrol: Kanin (DA1E) mab IgG Iso #3900S 5 2,5mg/ml Cell Signaling Tech. Rotte A95-1 IgG2b ISO mg/ml BDPharm. 11

13 Detektion/forstærkning Vectastain HRP PK-6100 Envision+ HRP K DAKO TSA indirecte biot NEL KT Perkin Elmer Demaskering TEG ph9 LAB K Bie og Berntsen Citrat ph6 08I ,01 mol/l Bie og Berntsen Proteinase K mg/ml Roche Visualisering DAB tablets D K8205 Sigma Kernefarvning Mayers hæmatoxylin LAB F Bie og Berntsen Buffere TBS ph 7,6 (opskrift bilag) TNBbuffer ph x (opskrift bilag) TNTbuffer ph x (opskrift bilag) 12

14 Apparatur-nr.-firma Objektglas: Superfrost plus Superfrost ultra plus Mikrobølgeovn Whirlpool JT 359ix, 6th sense Mikroskop Olympus Provis AX70 apparatnr Ovn Memmert UE 200 Finnpipetter-Gilson-BIOLAB: µl Nr. 0,2-2 BK J21544E S64610E E12746N Q59822C P54887E CG

15 Metoder Præparation demaskering Primært antistof detektion visualisering Præparation Skæring af væv og overføring til glas blev foretaget af en erfaren bioanalytiker. Glassene blev afparaffineret 20 minutter i to bade xylen og fremføres igennem faldende koncentrationer af ethanol til vand. Skyllebuffer TBS Demaskering Forskellige demaskeringsmetoder blev benyttet. HIER blev udført i Mikrobølgeovn i 15 min med 6th sense (se bilag). Og i ovn ved 60 C NO, snittene var i beholder med låg på. HIER buffere var TEG ph 9 og Citrat ph 6. PIER blev foretaget med Proteinase K, opløsningsmiddel var TBS-buffer, tiden var 5 minutter og temperaturen var stuetemp. (ca. 21 C). Ved CD3 undersøgelsen var Proteinase K koncentrationen 5 µg/ml og ved F4/80 undersøgelsen var koncentrationerne 5, 10 og 20 µg/ml. Blokering Detektionssystemerne Envision+, Vectastain og signal forstærkningssystemet TSA er baseret på HRP. Blokering af endogen peroxidase udførtes med 0,5% H 2 O 2 i TBS i 20 min. ved stuetemperatur. Blokering af uspecifik antistofadhæsion skete med en blokeringsbuffer indeholdende serum fra samme dyr som det sekundære antistof, BSA, TBS og skummetmælk (opskrift i bilag). Snittene inkuberedes i 60 minutter i denne blokeringsbuffer umiddelbart inden inkubation med primært antistof. Det primære antistof opløstes i en buffer med samme sammensætning som blokeringsbufferen, dog med andre 14

16 koncentrationer (se bilag). Detektionssystemet Vectastain og signal forstærkningssystemet TSA er begge biotin baseret og en endogen biotin blokering var nødvendig. Blokeringen udførtes med Biotin blocking system fra DAKO efter deres forskrift. Primært antistof De primære antistoffer, monoklonalt kanin anti mus CD3 (SP7) og rotte anti mus F4/80 [CI:A3-1], opløstes i en buffer bestående af BSA, æselserum, skummetmælk og TBS (se bilag). De anvendte koncentrationer kan ses i tabellerne i resultatafsnittet. Valg af antistof koncentration var fra forsøg til forsøg i forhold til ønske om tydelig forskel på det visuelle signal glassene imellem, eller forstærkning af signal indtil evt. uspecifik farvning. Detektion Under CD3 indkøring benyttedes Envision+, Vectastain til detektion og TSA til forstærkning af signalet. Antistoffet i Envision+ er ged anti kanin, hvilket gjorde et sekundært antistof unødvendigt, metoden blev derfor to-lags. Glassene blev inkuberet i 30 min. ved stuetemperatur. Vectastain er en ABC-metode og et sekundært biotinyleret anti kanin antistof blev benyttet til sammenkobling af primært antistof og ABC komplekset, en trelags metode. Vectastains ABC-kompleks blev opløst i 2,5ml TBS-buffer med 1 dråbe af reagens A og 1 dråbe af reagens B en halv time før brug. Inkubationstiden ved brug af Vectastain var 30 min. ved stuetemperatur. Det sekundære antistof blev opløst i samme type buffer som det primære(se bilag). TSA benyttedes ved et af forsøgene til at forstærke Vectastain signalet. Efter inkubation og skylning af det sekundære antistof inkuberedes med Vectastain opløst i TNB-buffer i 30 min. ved stuetemperatur. Efter skylning kom glassene i TNT-buffer i 5 min. ved stuetemp. Derefter inkuberedes med TSA i amplificationsbuffer i 6 min. ved stuetemperatur. Efter skylning detekteredes igen med Vectastain opløst i TNB-buffer ved stuetemperatur i 30 min. F4 indkørtes med Vectastain som detektionssystem. Metoden var som ved CD3 indkøringen, dog var det sekundære antistof et æsel anti rotte antistof. 15

17 Visualisering Da detektionen var HRP baseret skulle et chromogen benyttes, hvilket var DAB. Fremgangsmåden var ens for alle forsøg. Efter detektionen og skylning. DAB opløses i TBS i forholdet 1 tablet pr. 20 ml TBS. Glassene sættes i opløsningen og prævisualiserer i 5 min. Herefter tilsættes H 2 O 2 i forholdet 6,7 µg/ml H2O2 pr. 20 ml TBS. Efter 2 minutter tages glassene over i TBS og farvningen vurderes vådt under mikroskop. I forhold til vurderingen kommes glassene igen i DAB opløsningen i et antal minutter, kan ses i resultatafsnittet. Kernefarvning Kernefarvningen var med Mayers hæmatoxylin. Glassene dyppes i ca. 2 sekunder i farven og kommes derefter i vand. Så vurderes farvningen under mikroskop og gives derefter ekstra dyp i hæmatoxylinen hvis det fandtes nødvendigt. Monteringsmidlet ved montering af dækglas var pertex. Resultatvurdering Resultaterne vurderes ved hjælp af lysmikroskopi. Lokaliseringen af lymfocytter i milten er i den hvide pulpa. I colon findes lymfocytter i lamina propria. CD3 antigenet sidder i lymfocytternes membran. Makrofager/kupffer celler i leveren ligger i sinusoiderne. F4/80 antigenet sidder makrofagernes/kupffer cellernes membraner. I potevævet forventes lymfocytter og makrofager at ligge i de inflammatoriske områder. Udfældningen af DAB ses som en brun farve i snittene. Celler betragtes som positive hvis deres membran er farvet og cellerne er lokaliseret hvor forventet. Intensiteten af farvningen vurderes ud fra hvor kraftig farvningen i cellernes membran er. 0 = ingen farvning, + = lav intensitet, ++ = moderat intensitet, +++ = høj intensitet. Uspecifik farvning bedømmes i forhold til mængden med farvekode. Grøn=ingen uspecifik farvning, gul farve=en del uspecifik farvning, rød farve=meget uspecifik farvning. 16

18 Adhæsion bedømmes i forhold til hvor meget væv der sidder tilbage på glasset i forhold og mængden af foldet væv. A = næsten alt væv er faldet af glasset/alt væv er foldet. AA = ca. halvdelen af vævet er faldet af/ca. halvdelen af vævet er foldet. AAA = næsten intet væv faldet af glasset/næsten intet væv er foldet. Udregninger Udregning af sekundær antistof fortynding A B C 1 Do-a-Rt 0,47 ug/ml, 1: antal glas 12 3 mængde opløsning pr glas 200 µl 4 Antistof forfortynding 1: 2 5 Antistof brugsfortynd. 1: Do-a-Rt mængde 1,6 µl 7 Primær buffer 2398,4 µl 8 Total mængde 2400,0 µl =(B4*B3)/(B6/B5) = (B4*B3)-B7 17

19 Resultater Figurer viser eksempler fra tabellerne og de hænger sammen talmæssigt, figur 1 hører til tabel 1 o.s.v. Kontrolsnit nævnes kun hvor det findes relevant. Hvis ikke de nævnes har de reageret som forventet. Tabel scorings forklaringer Farveintensitet IHC 0 = ingen IHC farvning, + = lav intensitet af IHC farvning, ++ = moderat intensitet af IHC farvning, +++ = høj intensitet af IHC farvning. Uspecifik farvning Grøn=ingen uspecifik farvning. Gul farve=en del uspecifik farvning, rød farve=meget uspecifik farvning. Adhæsion A = næsten alt væv er faldet af glasset/alt væv er foldet. AA = ca. halvdelen af vævet er faldet af/ca. halvdelen af vævet er foldet. AAA = næsten intet væv faldet af glasset/næsten intet væv er foldet. Test af CD3 (SP7) antistof på kontrol væv Envision eller Vectastain 18

20 Test af Envision+ og Vectastain viste størst farveintensitet ved brug af Envision+. I tabel 1 ses at ved en CD3 antistof koncentration på 0,8 µg/ml, 0,4 µg/ml og 0,1 µg/ml giver Envision+ en grad højere farveintensitet end Vectastain. Kun ved en koncentration på 0,2 µg/ml giver de to detektionssystemer samme farveintensitet og den er lav. Den største forskel på detektions systemerne kunne observeres i milten som det ses på figur 1, billede 3 og 4. Der ses ikke den store forskel i farve intensiteten i de positive celler i colon, udbredelsen af positive celler viste dog en stor forskel hvilket illustreres i figur 1. Envision+ giver den største intensitet ved 0,8 µg/ml CD3 (SP7) antistof koncentration og falder i intensitet indtil 0,2 µg/ml koncentration. 0,2 µg/ml og 0,1 µg/ml antistof koncentration giver samme farveintensitet, hvilken er den laveste. De negative kontroller viste ingen positive reaktioner. Ingen af snittene viste uspecifik farvning. Som forventet ses positive celler i den hvide pulpa i milten og i lamina propria i colon. Den positive reaktion ses i cellernes membran. Se figur 1. Væv: Milt og colon Adhæsion: 1 x 60min. 60 C, Glas; Superfrost Plus Demaskering: MBO 15 min, TEG ph 9. Kontroller: Negativ; Colon minus primært antistof. Sekundær antistof konc. til Vectastain: 0,47 µg/ml Fremkaldelse: DAB 10 min. Konc. CD3 (SP7) Detektion 0,1 µg/ml 0,2 µg/ml 0,4 µg/ml 0,8 µg/ml Envision Vectastain Tabel 1 Her vises intensiteten af CD3 (SP7) farvning på milt og colon ved forskellige titere og detekteret med Envision+ eller Vectastain. 19

21 Figur 1 Billederne viser colon og milt inkuberet med 0,8 µg/ml CD3 (SP7) antistof. Nr 1 og 3 er detekteret med Envision+ og 2 og 4 er detekteret med Vectastain. Demaskering Demaskeringsmetoder blev testet. Her viste demaskering med HIER MBO i TEG ph9 at give den største farveintensitet. Ingen demaskering og demaskering med Proteinase K 5 µg/ml gav ingen positive reaktioner i hverken milt eller colon vævet. HIER MBO i Citrat ph6 viste positive reaktioner som det ses i tabel 2, en grad lavere ved alle tre CD3 (SP7) antistof koncentrationer end med TEG ph9 bufferen. TEG ph9 viste samme og højeste farveintensitet ved CD3 antistof koncentrationer på 2 µg/ml og 4 µg/ml. Citrats farveintensitet er en grad lavere end TEG s ved samme koncentrationer. Og begge falder en grad ved en koncentration på 0,8 µg/ml. Eksempler på demaskeringer ved antistof koncentration på 4µg/ml ses på figur 2. ISO type kontrollen var negativ som forventet. Ingen af snittene viste uspecifik farvning. Som forventet ses positive celler i den hvide pulpa i milten og i lamina propria i colon. Den positive reaktion ses i cellernes membran. 20

22 Væv: Milt og colon Adhæsion: 1 x 60min. 60 C, Glas; Superfrost Plus Glas; Superfrost Plus Detektion: Envision+ Kontroller: Colon, IgG ISOtype kontrol Fremkaldelse: DAB 10 min. Konc. CD3 (SP7) Demaskering 0,8 µg/ml 2,0 µg/ml 4,0 µg/ml HIER MBO TEG ph HIER MBO Citrat ph Proteinase K Ingen demaskering Tabel 2 Her vises resultaterne af de af CD3 (SP7) antistoffet hvor forskellige demaskeringsmetoder blev afprøvet. HIER MBO TEG ph9 viste den største farveintensitet. Figur 2 Venstre side viser colon billeder og højre side viser milt billeder. Alle snittene er inkuberet med 4 µg/ml CD3 (SP7) antistof. Demaskerings metoder: 1 og 2 MBO i TEG ph9, 3 og 4 MBO i Citrat ph6, 5 og 6 med Proteinase K 5 µg/ml, 7 og 8 uden demaskering. 21

23 Test af CD3 (SP7) antistof på musepotevæv Testen på CAIA pote vævet førte til at vævet foldede på glasset og en del faldt af. Alle typer af væv, knogle, hud, brusk, inflammationsvæv foldede og faldt af glasset. Som det fremgår af tabel 3 findes enkelte stykker væv der viste celler med positiv reaktion i membranen, ved alle tre koncentrationer af CD3 antistof. Uspecifik farvning ses i det foldede væv og andre steder hvor morfologien i vævet ikke kan identificeres. Positiv colon kontrol og colon ISOtype kontrol viste forventede resultater. Væv: 2 CAIA poter Adhæsion: 1 x 60min. 60 C, Glas; Superfrost Plus Glas; Superfrost Plus Demaskering: MBO 15 min, TEG ph 9. Kontroller: Colon, IgG ISOtype kontrol Fremkaldelse: DAB 10 min. Konc. CD3 (SP7) Demaskering 4 µg/ml 2 µg/ml 1 µg/ml HIER MBO TeG ph Tabel 3 Alle snit var præget af foldet væv og væv der var faldet af glassene. + = der ses positiv reaktion enkelte steder i vævet 22

24 Figur 3 Billeder fra Test af CD3 (SP7) antistof på musepotevæv. Billede 1 til 4 viser væv inkuberet med 4 µg/ml CD3 (SP7). Billede 1-3 viser eksempler på foldet væv og væv faldet af glasset. Billede 4 viser et eksempel på at der er positive reaktioner i noget af vævet. 23

25 Optimering af protokol på musepotevæv Adhæsion Superfrost Ultra Plus glas viste en større adhæsions evne end Superfrost Plus glas ved demaskering i TEG ph9 ved 60 C NO. Desværre viste Superfrost Ultra Plus ikke en forbedring ved demaskering i MBO i forhold til Superfrost Plus glas. Vævet foldede og en del faldt stadig af. Demaskering ved 60 C NO viste stærkere adhæsion end demaskering med MBO, dog faldt en del væv stadig af på Superfrost Plus glassene. Vævet blev på Superfrost Ultra Plus glassene ved demaskering ved 60 C NO. Se tabel 4. Billede eksempler ses i figur 4. Superfrost Ultra Plus glas og demaskering ved 60 C NO i TEG ph9 Væv: CAIA poter og CIA poter (klinisk score: 4 og 5) Tørring: 2 x60 min. Demaskeringsbuffer: TEG ph9 Objekt glas Demaskering Superfrost Ultra plus Superfrost plus MBO A A 60 C NO AAA AA Tabel 4 A = næsten alt væv er faldet af glasset. AA = halvdelen af vævet er faldet af. AAA = intet væv faldet af glasset. 24

26 Figur 4 Adhæsion/Glas. Billede 1 er CIA potevæv på Superfrost Ultra Plus glas demaskeret i MBO TEG ph9. Billede 2 er CAIA potevæv på Superfrost Plus glas demaskeret i MBO TEG ph9. Billede 3 er CIA potevæv på Superfrost Ultra Plus glas demaskeret ved 60 C NO. Billede 4 er CAIA potevæv på Superfrost Plus glas demaskeret ved 60 C NO. 25

27 CD3 IHC-farvning Tørring af glas til IHC farvning Tørring af glas ved 37 C NO + 2 timer ved 60 C viser svagere farvning end med tørring ved 60 C i 2 timer, demaskeret med MBO. Vævets tilstand er foldet og en del faldet at glassene med MBO. Den eneste forskel på tørringerne når der demaskeres ved 60 C NO er en del uspecifik farvning i vævet med tørring ved 37 C NO + 2timer ved 60 C, hvilket ikke er tilfældet med tørring ved 60 C i 2 timer. Demaskering med 60 C NO viser høj vævs adhæsion og en lav intensitet af CD3 farvning i enkelte celler. Se tabel 5 og figur 5. Væv: CIA poter (klinisk score: 4 og 5) Adhæsion: Glas; Superfrost Ultra Plus CD3 (SP7) koncentration: 4µg/ml Detektion: Envision+ Kontroller: Colon, IgG ISOtype kontrol Fremkaldelse: DAB 15 min. Tørring af glas Demaskering 37 C NO + 2 timer 60 C 2 timer 60 C MBO TEG ph9 ++ / A +++ / A 60 C NO TEG ph 9 + / AAA + / AAA Tabel 5 Snittene demaskeret i MBO havde en del foldet væv og væv var faldet af glasset. 0 = ingen CD3 farvning, + = lav intensitet af CD3 farvning, ++ = moderat intensitet af CD3 farvning, +++ = høj intensitet af CD3 farvning.. Grøn=ingen uspecifik farvning. Gul farve=en del uspecifik farvning, rød farve=meget uspecifik farvning. 26

28 Figur 5 Billede 1 viser et snit demaskeret med MBO TEG ph9 og tørret ved 37 C NO + 2 timer 60 C. Billede 2 viser et snit demaskeret med MBO TEG ph9 og tørret ved 60 C i 2 timer. Billede 3 viser et snit demaskeret ved 60 C i TEG ph9 NO og tørret ved 37 C NO + 2 timer 60 C.. Billede 4 viser et snit demaskeret ved 60 C i TEG ph9 NO og tørret ved 60 C i 2 timer. 27

29 Forstærkning af farvning Positive colon kontroller var positive og uden uspecifik farvning. Colon isotype kontrol var negativ. Potevæv detekteret med Envision+ viste en del uspecifik farvning mens potevæv detekteret med TSA-forstærkning viste meget uspecifik farvning, se billede 3 figur 6. Der fandtes ingen farvning af celler der positivt kunne identificeres som en reel CD3 membranfarvning, detekteret med Envision+. Væv: CIA poter (klinisk score: 6 og 7) Adhæsion: 2 x 60 min. ved 60 C Glas; Superfrost Ultra Plus Demaskering: HIER 60 C NO i TEG ph 9 Kontroller: Colon, IgG ISOtype kontrol Fremkaldelse: DAB, Envision+ 10 min., TSA 4 min. Konc. CD3 (SP7) Detektion 4 µg/ml 8 µg/ml 20 µg/ml Envision Vecta.-TSA-Vecta Tabel 6 Resultater fra sammenligning af detektion, med Envision+ og Vectastain-TSA-Vectastain på CIA potevæv. Figur 6 Billede 1 og 2 viser uspecifikke pletter på væv detekteret med Envision+. Billede 3 viser væv detekteret med Vecta.- TSA-Vecta. med 20 µg/ml CD3 (SP7) antistof fortyndning. 28

30 F4/80 Proteinase K koncentration DAB farvningen ses i cellers membraner beliggende mellem hepatocytterne i leveren og i inflammationsvævet i poten. Ved PIER med 20µg/ml Proteinase K ses en svagere farve intensitet og mindre udbredelse af positive celler end ved PIER med 5 og 10µg/ml Proteinase K koncentration, se figur 7. Snittet demaskeret med 10 µg/ml proteinase K og inkuberet med 2 µg/ml F4/80 antistoffet viser lige så stor intensitet som snittene inkuberet med 10 µg/ml F4/80 antistof og demaskeret med 5 og 10 µg/ml Proteinase K koncentration. Væv: lever, CIA pote (klinisk score: 6) Adhæsion: 2 x 60 min. ved 60 C Glas; Superfrost Ultra Plus Demaskering: Proteinase K 5 min. Sekundær antistof koncentration: 1,0 µg/ml Kontroller: IgG2b ISOtype kontrol Fremkaldelse: DAB 10 min. Konc. F4/80 [CI:A3-1] Proteinase K konc. 1 µg/ml 2 µg/ml 10 µg/ml 5 µg/ml µg/ml µg/ml Tabel 7 Resultater fra forsøg med forskellige fortyndninger af Proteinase K og F4/80 [CI:A3-1] antistof på lever og potevæv. Figur 7 Vævet på alle billederne er inkuberet med 2 µg/ml F4/80 antistof. 29

31 Billede 1-3 er levervæv, 1 er demaskeret med 20 µg/ml, 2 er demaskeret med 10 µg/ml, 3 er demaskeret med 5 µg/ml. Billede 4 og 5 er CIA potevæv. 4 er demaskeret med 10 µg/ml, 5 er demaskeret med 5 µg/ml. Sekundær antistof koncentration Ved alle koncentrationer af F4/80 antistof viser 1 µg/ml sekundær antistof koncentration en kraftigere farvning end 0,47µg/ml sekundær antistof koncentration, se Tabel 8. Leverkontrollen er positiv og ISOtypen er negativ. Væv: CIA poter, lever Adhæsion: 2 x 60 min. ved 60 C Glas; Superfrost Ultra Plus Demaskering: Proteinase K 10 µg/ml, 5 min. Kontroller: IgG2b ISOtype kontrol på lever og poter. Lever positiv kontrol. Fremkaldelse: DAB 10 min. Konc. F4/80 [CI:A3-1] Sek. Antistof konc. 2 µg/ml 4 µg/ml 8 µg/ml 1,0 µg/ml ,47 µg/ml Tabel 8 Resultater fra forsøg med forskellige fortyndinger af sekundært antistof og forskellige fortyndinger af F4/80 antistof. 30

32 Figur 8 CIA potevæv inkuberet med 4 µg/ml f4/80 antistof. Billede 1 viser positiv reaktion med en sekundær antistof konc. på 1 µg/ml. Billede 2 viser positiv reaktion med en sekundær antistof konc. på 0,47 µg/ml. Diskussion Indkøringen af CD3 (SP7) og F4/80 [CI:A3-1] lagde vægt på demaskerings metode, detektionssystem og primær antistofkoncentration. Men et par andre faktorer sneg sig ind. Ved CD3 (SP7) indkøringen viste den først afprøvede metode ikke at virke på potevæv og adhæsion blev derfor en faktor. Ved Indkøring af F4/80 [CI:A3-1] blev en forkert indtastning i et regneark afgørende for den sekundære antistof koncentration. Milt væv er cellerigt og tæt ligesom noget af det inflammatoriske væv i CIA poterne, mens colon vævet i lamina propia, hvor lymphocytterne befinder sig, ikke har samme tætte struktur. Det gav derfor mening at benytte disse to vævstyper til at afprøve CD3 antistoffet, da det forventes at inflammationensvævet både er cellerigt og mindre cellerigt. Kupffer celler/makrofager i lever er let genkendelige i histologisk væv med deres beliggenhed i sinosoiderne. Derfor valgtes levervæv til at være kontrol for F4/80 31

33 påvisningen i potevævet. Kontrolvævet og potevævet havde den svaghed at potevævet havde gennemgået en afkalkningsproces, det kontrolvævet ikke. Potevævet var overført til paraffin på en Pathos der benytter mikrobølger. Kontrolvævet var overført til paraffin på en maskine der ikke benyttede mikrobølger. Disse forskelle blev dog ikke taget i betragtning som værende oversag til nogle uoverensstemmelser, som det ses nedenfor. Demaskering Ved demaskeringssammenligningen afprøvedes PIER med proteinase K ved en koncentration på 5 mg pr ml i 5 minutter ved stuetemperatur. Denne koncentration valgtes ud fra et tidligere inhouse forsøg. Den benyttede koncentration kunne have været højere da man indenfor immunhistokemien normalt bruger en koncentration på mellem 10 og 20 mg pr ml. Snittene viste ingen antydninger af positiv reaktion. Et forsøg med påvisning af CD3 antigen med et polyklonalt antistof fra DAKO på formalin fikseret paraffin indstøbt humant væv af forskellige typer, viste positiv svag reaktion i alle celler, der forventedes at være positive. Fikseringenstiden var mellem 24 timer og en uge. Vævet var demaskeret med 0,05% protease XIV ved 37 C i 5 min [7]. En årsag til at det omtalte forsøg viste positiv reaktion med enzym forbehandling, kan være den større sensitivitet ved et polyklonalt antistof. På den måde at den epitop der påvises med det monoklonale CD3 (SP7) antistof ikke bliver demaskeret med enzymbehandling, i mens at andre epitoper på CD3 antigenet demaskeres. Nogle af antistofferne i det polyklonale antistof vil bindes til de demaskerede epitoper og CD3 vil hermed blive påvist. En anden mulighed er de to forskellige enzymer. De virker på hver sin måde på vævet ved at skære proteiner forskellige steder, hvilket fører til forskellig demaskering. Tiden for demaskeringen var den samme. Temperaturen var ca. 21 C for proteinase K og 37 C for protease XIV. Stigende temperatur har en stigende effekt på effektiviteten på enzymet. Men selvom proteinase K ville være mere effektivt ved 37 C end ved 21 C har det stadig en demaskerende effekt ved 21 C.. Koncentrationen af enzymet er en fjerde mulighed for at der ikke fandtes positiv reaktion i milt og colon vævet. Eller det kan være en kombination af de fire muligheder, eller måske en femte. Hvis man sammenligner forsøget af påvisning af CD3 og forsøget med påvisning af F4/80, udelukkes nogle af mulighederne. Ved indkøring af F4/80 blev proteinase K afprøvet ved samme temperatur 21 C, samme 32

34 enzymkoncentration og samme primær antistof fortynding som ved CD3 indkøringen. Og her udtryktes moderat intensitet i positive celler i lever og potevævet. Eneste forskel på metoderne var detektionssystemerne, Envision+ ved CD3 og Vectastain ved F4/80. Demaskering med MBO og TEG ph9 viste sig at virke på colon og milt væv. Andre undersøgelser med brug af CD3 (SP7) med HIER demaskering har også haft brugbare resultater [8,9,10] Fælles for disse undersøgelser er at de udførtes på væv der ikke havde brug for afkalkning. MBO viste sig dog ikke brugbar på potevævet da en stor del væv foldelde eller faldt af glassene. Dog kunne positive reaktioner opserveres i det tilbageværende væv. HIER demaskering ved 60 C i TEG ph9 NO viste positive celler i colon kontrol væv ved CD3 antistof koncentration på 4 og 8 µg/ml og når Vectastain signalet forstærkedes med TSA. Ved CD3 antistof koncentration på 20 µg/ml kom der en del uspecifik farvning. Så en koncentration på 20µg/ml lader til at være så høj at antistofferne binder uspecifikt i vævet. Denne metode gav ikke tilfredsstillende resultater på potevæv selvom vævet blev siddende på glasset. Positive reaktioner kunne findes i vævet men der var meget uspecifik farvning der gjorde at celler ikke kunne identificeres som positive. Den uspecifikke farvning kunne ses som farveklatter der var større end cellerne i vævet. Ved CD3 antistof koncentration på 20 µg/ml ses meget mere uspecifik farvning i potevævet end ved 4 og 8 µg/ml. Ved lysmikroskopi lader det til at de uspecifikke farveklatter ligger i og over vævet på objektglasset når CD3 antistof koncentrationen er 4 og 8 µg/ml, mens den uspecifikke farvning ved 20 µg/ml antistof koncentration både ses som klatter og at den nærmest har fungeret som en kernefarvning, hvilket kan ses på figur 6 billede 3 i resultatafsnittet. Det samme kunne observeres på ISOtype kontrol snittene. Koncentrationen lader til at være så høj at antistoffet har fundet noget i vævet at binde sig til. At der ses uspecifik farvning i potevævet ved 4 og 8 µg/ml antistof koncentration og ikke i colon vævet, kan skyldes præparationen af vævet da de ellers har fulgt samme IHC protokol. Den største forskel i præparationen er afkalkningen af potevævet. Størrelsen på vævet kan måske også have en betydning da colon snittene var cirka en tiende del størrelse af potesnittene. Ved afprøvning af protokollen på musepoter opstod et lidt uventet problem. Nemlig at vævet foldede og en del faldt af glasset. Specielt knogle- og bruskvæv røg helt af glasset mens meget af det resterende væv dannede folder. Dette adhæsionsproblem vurderedes til at stamme fra en utilstrækkelig påsætning af vævet på objektglasset. Derfor afprøvedes 33

35 en længere tørring af vævet på glassene samt objektglas der skulle give en bedre adhæsion, nemlig superfrost ultra plus glas. Superfrost ultra plus glassene viste sig at være superfrost plus glas overlegne. Desværre ville potevævet stadig ikke hænge tilstrækkeligt fast ved demaskering i mikrobølgeovn til at give et acceptabelt resultat, colonvævet viste ingen adhæsionsproblemer med demaskering i MBO. Et andet forsøg med humant endometrium væv demaskeret ved C i DAKO retrieval solution ph 9 i 20 minutter viste ingen problemer ved brug af superfrost ultra plus glas [11] Ved HIER med lav temperatur og lang inkubations tid, 60 C i TEG ph9 NO, blev vævet siddende på superfrost ultra plus glassene, mens det faldt af på superfrost plus glassene. Hvordan den større adhæsions evne opnås oplyser firmaet Menzel ikke. Tættere på en demaskerings og adhæsions metode kom indkøringen af CD3 (SP7) antistoffet ikke. F4/80 antistoffet blev kørt ind med PIER som eneste afprøvede demaskerings metode. Udgangspunkt for sammensætning af den første protokol var en protokol fra et laboratorium der havde afprøvet antistoffet på musepotevæv med PIER som demaskeringsmetode (se bilag). Første forsøg viste gode resultater med PIER og derfor blev ikke andre demaskeringsmetoder afprøvet. Koncentrationen af proteinase K viste som forventet en forskel i intensiteten af farveresultatet. 20 µg/ml viste at antigenerne begyndte at blive ødelagt, da farveintensiteten ved denne koncentration var svagere end ved 10 µg/ml. 5 µg/ml viste også svagere farve intensitet end ved 10 µg/ml, hvilket må skyldes at ikke lige så mange antigener var blevet demaskeret. Databladet til F4/80 antistoffet siger at PIER skal benyttes hvis vævet er fikseret under 24 timer og HIER hvis det er fikseret over 24 timer. CIA potevævet er fikseret i 48 timer hvilket så skulle have resulteret i brugen af HIER. Men PIER resultaterne viste sig meget tilfredsstillende så HIER blev ikke afprøvet. Detektion Ved sammenligning mellem Envision+ og Vectastain blev udgangspunktet laboratoriets rutine mht. sekundær antistof fortynding. Ved brug af Envision blev det til en tolags metode da Envision+ binder sig direkte til CD3 antistoffet. Mens at brugen af 34

36 Vectastain var en trelagsmetode, da Vectastain binder ved hjælp af avidin biotin reaktion er det derfor nødvendigt at anvende et sekundært antistof der er biotinyleret. Rutinebrug i laboratoriet af sekundært antistof er en fortynding på 1:3000, hvilket svarer til 0,47 µg/ml. Ved undersøgelsen af F4/80 skete en fejl mht. udregningen af den sekundære antistof koncentration der i stedet for 0,47 µg/ml blev til 1,0 µg/ml. Denne fejl viste sig dog, at give et langt kraftigere signal end ved koncentrationen på 0,47µg/ml, ved samme primære antistof koncentration. Sammenligningen af Envision og Vectastain ved CD3 antistof, er derfor ikke hel reel, da det tyder på, at den sekundære antistof fortynding kunne have givet et kraftigere signal ved en større koncentration. Også en længere inkubationstid af det sekundære antistof vil give mere tid til at antistoffet kan reagere med antigenet, dette kunne give et kraftigere signal. En forhøjet koncentration hæver risikoen for uspecifik antistof adhæsion. Farvningerne af colon og miltvæv viste dog ingen tegn på dette, da fremkaldelsen med DAB viste tydelige membran farvninger i celler i lamina propria i colon og i den hvide pulpa i milten, hvilket stemmer overens med teorien om lokalisationen af lymfocytter i disse to væv. Baggrunden i de to væv var meget rene både ved brug af Envision og Vectastain. Dette tyder på en god blokering af endogen peroxidase, endogen biotin og af uspecifk antistof adhæsion. F4/80 indkøringen viste at den sekundære antistof koncentration på 0,47 µg/ml med en inkubations tid på 60 minutter ikke var tilstrækkelig til at binde til alt det bundne F4/80 antistof i potevævet. En koncentration på 1,0 µg/ml gav kraftigere signal uden at der kom uspecifik farvning i vævet. En tolagsmetode siges, at være mere sensitiv end en trelagsmetode, mens en trelagsmetode siges, at være mere specifik end en tolagsmetode [3]. Primær antistof koncentration Valget af koncentrationen af CD3 antistoffet faldt på 0,8, 0,4, 0,2 og 0,1 µg/ml. for at give et bedre billede af sensitiviteten af Envision+ og Vectastain. Da ved en lav primær antistofkoncentration vil der kunne ses tydeligere forskel i farveintensiteten, i forhold til hvis man benyttede en høj primær antistofkoncentration ville have sværere ved at se en forskel da den formentlig først vil vise sig ved at differentieringen mellem cellernes membraner ikke ville være til at skelne. Det virkede efter hensigten som det kan ses i tabel 1 i 35

37 resultatafsnittet. Som det kan ses i figur 1 viste de positive celler i miltvævet ikke lige så høj farve intensitet som i colonvævet. Det kan skyldes at lymfocytterne i colon har en større koncentration af CD3 i deres membran end koncentration i milten, derfor forskellen i intensitet. Eller også bliver antigenerne i milten ikke demaskeret lige så nemt som i colon pga. den tætte celle koncentration. F4/80 antistoffet blev kørt ind med koncentrationer fra 1 til 10 µg/ml og alle koncentrationer viste positive reaktioner i lever og potevæv. På potevævet viste det sig tilstrækkeligt at anvende en koncentration på 4 µg/ml. De højere koncentrationer viste ikke en højere farveintensitet, de viste dog heller ingen uspecifik farvning. Konklusion F4/80 i CIA musepotevæv kan visualiseres ved demaskering med en proteinase K koncentration på 10µg/ml, en primær antistof koncentration på 4 µg/ml og detektering med Vectastain. Perspektivering Perspektivering. CD3 indkøringen nåede ikke frem til en brugbar protokol på CIA potevæv. Det største problem var at finde en demaskeringsmetode der ikke fik potevævet til at falde af glassene og samtidig virkede demaskerende på CD3 antigenerne. Andre enzymer end proteinase K bør afprøves, nu da den omtalte undersøgelse havde held med et andet enzym, dog også et polyklonalt antistof. Det vil også være hensigtsmæssigt at afprøve HIER ved en temperatur lige under kogepunktet, da det tyder på, at det er selve kogningen af potevævet, der får vævet til at falde af. Og da HIER ved 60 grader ikke gav et tilfredsstillende farveresultat, mens demaskering med mikrobølgeovn gav gode resultater på colon og milt, er det sandsynligt at HIER ved en så høj temperatur, uden at koge, vil resultere i en demaskering af CD3 antigenerne. En kombination af PIER og HIER skal også overvejes. Andre adhæsions metoder bør afprøves til at få potevævet til at blive siddende på glassene under HIER. Måske er det nok bare at følge den præcise opskrift fra Menzel ved brug af Superfrost Ultra Plus glas. Måske kan Silaneglas gøre en forskel, i flere 36

38 diskussioner på immunhistokemiske hjemmesider bliver dette omtalt som en mulighed med knoglevæv. Adhæsion foreslås kan gøres med coatede glas og med tørring ved 65 C i 12 timer [6]. F4/80 antistoffet blev ikke afprøvet på samtlige CIA poter så de kunne sammenlignes med de histopatologiske HE snit. En sådan sammenligning vil hjælpe med forståelsen af CIA-musemodellen. 37