EnVision G/2 dobbeltfarvning med antistofferne CD31 og DBA44.

Transkript

1 EnVision G/2 dobbeltfarvning med antistofferne CD31 og DBA44. Bachelorprojekt Projektperiode: November 2008 januar 2009 Forfatter: Winni Pedersen CPR nr Bivejleder: Lone Bojesen, Herlev patologi afdeling, Herlev Hospital. Hovedvejlder: Annette Stenlov, Rigshospitalets patologi afdeling, Rigshospitalet.

2 Resume I dag har lægerne meget svært ved at skelne mellem sygdommene Splenisk Marginal Zone Lymfom (SMZL) og Hårcelleleukæmi (HCL). Det er vigtigt at kunne skelne de to sygdomme fra hinanden, fordi behandlingen for HCL ikke har nogen virkning på SMZL. Og jo mere præcis diagnose jo bedre og mere præcis behandling vil man kunne give patienten. Jeg har derfor forsøgt om man kan opstille en immunhistokemisk dobbeltfarvningsprotokol, som gør at man vil kunne skelne mellem B-lymfocytter og endothelceller når disse ligger tæt eller når B-lymfocytterne vokser intrasinusoidalt. Til formålet hat jeg valgt at benytte Dako s Autostainer Universal Staining system sammen med DAKO s EnVision G2 doublestain system, Rabbit/Mouse (DAB+/Permanent Red) og med antistofferne CD31 og DBA44, da disse påviser henholdsvis endothelceller og B- lymfocytter. Forsøget køres ind på væv fra en multiblok indeholdende appendix og HCL og afprøves på patientmateriale som tidligere er diagnosticeret med SMZL eller HCL eller formentlig SMZL eller HCL. Resultaterne af forsøget er desværre meget nedslående. Det har vist sig at det virker ganske godt på multiblok vævet, mens det absolut ikke virker efter hensigten på patientmateriale. Et af de meget store problemer er, at man ikke altid vil kunne finde B-lymfocytter som vokser intrasinusoidalt, da det ikke er sikkert at sygdommen er nået til det stadie eller man simpelthen ikke har fået det med i sine snit. Et andet stort problem er at jeg ikke har kunnet få forstærket/optimeret farven DBA44/Permanent Red (PR) godt nok eller også er det simpelthen CD31/DAB+ som er for kraftig i forhold til PR. Forsøget her viser altså, at der desværre er lang vej igen, før man evt. vil kunne benytte en immunhistokemisk dobbeltfarvning til at stille en mere præcis diagnose ved disse to sygdomme.

3 Forord Dette bachelorprojekt er udført på Herlev Patologisk Afdelings immunlaboratorie. Jeg har fundet det yderst spændende og lærerigt at få lov til at arbejde med immunhistokemisk dobbeltfarvning i stedet for de enkeltfarvninger som vi laver i den daglige rutine. Projektet er lavet på opfordring fra Overlæge Helle Knudsen, som har ønsket at kunne stille en mere præcis diagnose hos patienter med Splenisk Marginal Zone Lymfomer og hårcelleleukæmi. Jeg vil derfor gerne i denne forbindelse takke mine to vejledere Lone Bojesen og Annette Stenlov for en god og konstruktiv vejledning gennem hele projektet. Samtidig vil jeg gerne takke Lotte Thyme og resten af personalet i immunlaboratoriet for deres velvilje, hjælpsomhed og tålmodighed. Desuden vil jeg gerne takke DAKO, som har været så venlige at give en klækkelig rabat, hvilket har gjort det muligt at nå så langt med dette projekt. Winni Pedersen

4 Indholdsfortegnelse Resume... 2 Forord... 3 Indholdsfortegnelse... 4 Introduktion... 6 Problembaggrund... 6 Problemformulering... 6 Teori... 7 Antistoffer... 7 CD Anti-Human Leukemia, Hairy Cell, klon DBA Blokering af uspecifik farvning... 8 Fiksering... 8 Afkalkning... 9 EnVision G/2 Doublestain systemet... 9 Forbehandling i HIER (manuelt trin) Forbehandling i HIER (manuelt trin) TBS vaskebuffer, skyl Dual endogenous enzyme block Metodevalg og afgrænsning Materialer og metode Materialer Metode Skæring, montering og tørring Afparaffinering Forbehandling Kernefarvning, dehydrering og montering Indkøring af fortyndinger til PR Indkøring af fortyndinger til DAB+D Indkøring af dobbeltfarvning på multiblok Afprøvning af dobbeltfarvning med rækkefølgen CD31/DAB+D og DBA44/PR på væv diagnosticeret med SMZL Indkøring af dobbeltfarvning med rækkefølgen DBA44/DAB+D og CD31/PR på de 5 resterende patientprøver Indkøring af dobbeltfarvning med nye fortyndinger af DBA Afprøvning af dobbeltfarvning på væv med diagnosen SMZL, HCL eller formentlig SMZL eller HCL Kontroller Mikroskopering og scoring Resultater Indkøring af PR på multiblok Indkøring af DAB+D på multiblok Indkøring af dobbeltfarvning på multiblok Afprøvning af dobbeltfarvning med rækkefølgen CD31/DAB+D og DBA44/PR på væv diagnosticeret med SMZL Indkøring af dobbeltfarvning med omvendt antistofrækkefølge på 5 udvalgte prøver Indkøring af dobbeltfarvning med nye fortyndinger af DBA

5 Afprøvning af dobbeltfarvning på væv med diagnosen SMZL, HCL eller formentlig SMZL eller HCL Diskussion Generelt om forsøget Fiksering CD31/DBA PR Farvekombination Inkubering Valg af kit Sygdomsstadiet Konklusion Perspektivering Litteraturliste... 36

6 Introduktion Problembaggrund Sygdommen HCL er en overproduktion af umodne hvide blodlegemer kaldet B-lymfocytter. 1 Navnet kommer af at de ser behårede ud under et mikroskop. 2 Denne behåring består af nogle cytoplasmatiske udløbere, som er meget typiske for denne form for leukæmi. I milten ses infiltrater af den røde pulpa og i knoglemarven vil det hæmatopoietiske væv være fortrængt og erstattet af diffuse infiltrater af hårceller. 3 Sygdommen SMZL er et lymfom som vokser intrasinusoidalt. Den ses som regel med et ubestemmeligt infiltrationsmønster, som består af neoplastiske B-lymfocytter meget lig de lymfocytter som normalt optræder i marginalzonen i milten. 3 Disse to sygdomme er meget svære at differentiere fra hinanden, både klinisk og morfologisk. Behandlingen af de to sygdomme er ikke ens og samtidig er det sådan, at behandlingen af HCL ikke har nogen effekt på SMZL. Det er derfor vigtigt at kunne skelne de to sygdomme fra hinanden. Til dagligt diagnosticeres disse to sygdomme ved et stort panel af immunhistokemiske farvninger. Men diagnosen bliver som regel knoglemarv med lavmalignt B-celle lymfom, formentlig SMZL eller HCL. Måske kunne man hjælpe lægen med at stille en mere præcis diagnose, ved hjælp af antistoffet CD31 som binder sig til endothelcellerne i sinusoiderne 3 og antistoffet DBA44 som binder sig til B-lymfocytterne. 4 Sammen med de to antistoffer benyttes en immunhistokemisk dobbeltfarvning med EnVision G/2 Doublestain System fra DAKO som muliggør en simultan detektion af to antigener i et vævssnit. Systemet fra DAKO anvender horseradish peroxidase (HRP) sammen med chromogenet DAB+ og alkalisk phosphatase (AP) sammen med Permanent Red (PR) til at visualisere reaktionen mellem væv (antigen) og antistof. 5 Herved skulle det blive muligt at se om B-lymfocytterne vokser intrasinusoidalt og derved afgøre hvilken en af sygdommene der er tale om. Problemformulering Hvorledes kan man få indkørt en immunhistokemisk dobbeltfarvningsprotokol med antistofferne CD31 og DBA44 på paraffin-indstøbt kontrolmateriale, indeholdende væv fra appendix og hårcelleleukæmi?

7 Og vil en sådan protokol kunne anvendes på væv som tidligere er diagnosticeret med sygdommene Hårcelleleukæmi og Splenisk Marginal Zone Lymfom, således at man her kan skelne mellem B-lymfocytter og endothelceller når de ligger tæt eller når B-lymfocytterne vokser intrasinusoidalt. Teori Antistoffer De to antistoffer (CD31 og DBA44) som benyttes i dette forsøg, er begge et monoklonalt muse-antistof. Det vil sige det er udvundet af kun en celleklon. Ved at det kommer fra kun en celleklon, har man et antistof som kun er rettet mod én epitop på antigenet. Antistoffet binder sig ved hjælp non-kovalente bindinger, elektrostatiske kræfter (ion-dipol-bindinger) hydrogenbindinger, hydrofobe interaktioner og London kræfter, til den antigen determinant som det er rettet imod. 7 CD31 CD31 (Se bilag 1) er et enkeltkædet membrane glykoprotein som er medlem af immunglobulin superfamilien. Det er kraftigt udtrykt i endothelceller men svagere udtrykt i mange hæmopoietiske celler som: lymfocytter i perifert blod, plasmaceller, visse T- lymfocytter m.v. samt i B-lymfocytterne, især dem i marginal zonen (milten). Ved brug af CD31 ses farvning af endothelcellerne samt B-og T-cellerne i mantlezonen. Øvrige celletyper viser kun positiv reaktion ved optimal demaskering og visualisering. 8 Anti-Human Leukaemia, Hairy Cell, klon DBA44 DBA44 (Se bilag 2) er klonen for et Anti-Human Leukemia, Hairy Cell. Den er stadig ikke CD klassificeret, 7 og det har på nuværende tidspunkt heller ikke været muligt at bestemme dets molekyl vægt. Antistoffet påviser et ukendt fikseringsresistent antigen, som er udtrykt af kantzone lymfocytter, monotoide B-celler, reaktive immunoblaster samt en lille del af High- og Low grade lymfomerne. DBA44 påviser 97,6 % af hårcelleleukæmierne, 4 men man har senere fundet ud af, at den ikke er helt så specifik for HCL som først antaget. Ved brug af DBA44 vil der sammen med HCL-diagnosticeret væv, ses en kraftig positiv reaktion af overflade membranens hårede karakteristik, og lymfekar.

8 Blokering af uspecifik farvning Immunglobuliner kan ud over at binde sig til sit tilsvarende antigen, godt binde sig til andre vævsproteiner. Dette kan give problemer i form af meget baggrundsfarvning som kan virke forstyrrende på den rigtige farvning. For at forhindre disse uspecifikke bindinger kan man tilsætte bovint serum albumin (BSA). I dette forsøg benyttes BSA til at fortynde antistofferne med og derved blokeres for uspecifikke bindinger. 7 Se figur 1 og 2. Figur 1 9 Figur 2 9 Fiksering Der findes flere forskellige former for fiksativer, men immunhistokemi foretages oftest på Neutral buffet formaldehyd (NBF) fikseret væv. Ved fiksering forstås en kemisk behandling som stabiliserer vævets og cellernes bestanddele. Dette kan imidlertid give visse problemer, da NBF påvirker antigenisiteten på flere måder. Maskering af epitoper Ved dannelse af methenbroer mellem naboproteiner og polypeptidsegmenterne i det samme proteinmolekyle. Ved at ændre antigenets form Ved immobilisering nabomakromolekyler Ved at kompleksbinde metal-ioner især Ca-ioner Ved at modificere de reaktive aminosyrer i epitopen eller gennem ekstraktion af antigenet under fikseringen Fikseringen er derfor et meget vigtigt led i de immunhistokemiske farvninger.

9 Den ideelle fikseringstid er timer. Der findes dog ingen standardisering inden for området på nuværende tidspunkt. 7 For kort fikseringstid medfører koagulation under dehydrering. For lang fikseringstid medfører tiltagende maskering. 9 Afkalkning De fleste af de patientprøver som er benyttet i dette forsøg, er lavet på crista biopsier (knogle). Knogler er et hårdt væv, som ikke uden videre kan skæres på en mikrotom. Derfor skal det blødgøres. Det kan gøres ved en kemisk afkalkningsproces med en passende syre. For det her benyttede væv gælder det, at det er afkalket i 4 % myresyre i 6-8 timer. Ved en afkalkning i en svag myresyre fjerner man det calsium som er i knoglen og får det over i opløsningen i form af Ca ++ -ioner, hvilket gør at vævsstykket nu er blødgjort, således at man kan skære nogle fine snit på mikrotomet. 7 EnVision G/2 Doublestain systemet EnVision G/2 doublestain systemet (Se bilag 3), er et visualiseringssæt som er baseret på HRP sammen med kromogenet DAB+ og AP sammen med kromogenet PR. Det er velegnet til detektering af to forskellige antigener i et præparat også når antigenerne kun forefindes i lave koncentrationer. 5 EnVision/HRP er det ene detektionssystem. Det består af en dextranpolymer konjugeret med peberodsperoxidase og affinitetsisolerede immunglobuliner. 5 Dette er i sig selv usynligt, men kan visualiseres ved hjælp af kromogen substrat opløsningen DAB+. DAB+ er elektrondonor i denne proces og bliver til et tungtopløseligt farvet produkt, som udfælder ved antigen/antistof komplekset. DAB + 2H 2 O 2 Peroxidase 2H 2 O + O 2 + oxideret DAB polymeriserer 7. Herimellem påføres en doublestain block. Den blokerer for en eventuel krydsreaktion mellem den første og anden farvning. Mekanismen bag blokeringen er en forretningshemmelighed, men menes at bero på et reagens med høj salt koncentration og ekstrem ph (sur typisk) som fjerner antistoffer i overskud i vævet og kun efterlader kromogenet. 10 EnVision/AP er det andet detektionssystem. Det består af en dextranpolymer som er konjugeret med basisk fosfatase og affinitetsisolerede immunglobuliner. 5 PR er

10 chromogen/substrat opløsningen som bruges til at fremkalde farven på vores antigen/antistof kompleks. AP katalyserer fraspaltningen af phosphat fra en naphtholphosphatester forbindelse. Derefter kobler naphtholforbindelsen sig til kromogenet som er tilsat substrat opløsningen. Koblingsproduktet er farvet og tungtopløseligt i vand. 7 Kanin/mus linkeren er en brugsklar dextranpolymeropløsning, hvorpå der er koblet sekundære antistoffer mod kanin- og museimmunglobuliner. 5 Kanin/mus linkeren påføres efter det andet antistof. Linket virker som et led mellem det primære antistof og polymer-konjugatet og menes at indeholde et sekundært antistof (Ged anti-mus) og et tertiært antistof (Ged antikanin) koblet til en polymer med AP-molekyler. På den måde vil det kunne binde det primære og sekundære led sammen og der vil ske en forstærkning. 10 Se figur 3. DAB+ visualisering AP visualisering Ved brug af dette system sammen med DAKO Double Autostainer, block Universal Staining System sker der Ged anti-kanin følgende: Polymer Forbehandling i HIER (manuelt trin) HIER (Se bilag ) er en varmeinduceret epitop Ged demaskering. anti-mus Der er 2 egenskaber ved HIERkogemediet, som er af stor betydning Kanin anti-mus for hvor godt det virker. Det er kogemediets ph og evne til at HRP Kanin anti-mus Antistof Antistof Ved brug af dette system sammen med DAKO Autostainer, Universal Staining System sker der følgende: Figur 3 Forbehandling i HIER (manuelt trin) HIER (Se bilag 4) er en varmeinduceret epitop demaskering. Der er 2 egenskaber ved HIERkogemediet, som er af stor betydning for hvor godt det virker. Det er kogemediets ph og evne til at binde Ca-ioner. I dette forsøg er der brugt en TEG-buffer ph 9 (Se bilag 5), hvilket er godt, da denne ph værdi er god til de fleste antistoffer, 7 og den indeholder stoffet EGTA, som er godt til at binde Ca-ioner. Mekanismen bag HIER er ikke kendt, men menes at være en kombination af følgende:

11 Methenbroer brydes, fordi fikseringen er reversibel, og vi tilsætter varme, for at få processen til at løbe hurtigere. R-NH 2 + HCOH + H 2 N-R R-NH-CH 2 -NH-R + H 2 O Komplekstbundne og epitop maskerende Ca-ioner fjernes, ved chelatisering med EGTA Vævet rehydreres, hvilket giver en bedre penetration (gennemtrængelighed) Lidt denaturering af proteinet, blotter skjulte epitoper TBS vaskebuffer, skyl Efter påføring af blokering, antistof og visualisering skylles der 1-2 gange med TBS vaskebuffer for at fjerne eventuelle overskydende og ubundne stoffer. Vaskebufferen er en tris buffet saltvand med Tween 20 (Se bilag 5). TBS er den rene buffer, som alle reagenserne er opløst i. Tween 20 er en sæbe som dels nedsætter risikoen for uspecifik binding, forbedrer penetrationen af reagenserne og nedsætter overfladespændingen på glassene. Dual endogenous enzyme block De detektionssystemer der benyttes i dette forsøg indeholder peroxidase og alkalisk phosphatase. Disse to stoffer forekommer naturligt i granulocytter, makrofager og monocytter i humant væv, hvilket kan give falske positive reaktioner. Det er derfor nødvendigt at blokere for disse to stoffer. Dual Endogenous Enzyme block hæmmer den endogene peroxidase og pseudoperoxidase ved hjælp af H 2 O 2. Se figur 4 og 5. Figur 4 9 Figur 5 9 Mens alkalisk phosphatase hæmmes effektivt med Levamisol. 7

12 Metodevalg og afgrænsning Til dette forsøg er der valgt en multiblok indeholdende appendix og hårcellelymfom. Appendix er valgt fordi den indeholder mange lymfolikler, B-lymfocytter og endothelceller som kan påvises med CD31og Hårcellelymfom er valgt fordi DBA44 påviser B-lymfocytterne i et hårcellelymfom og lymfekar (endothelceller). Jeg har valgt at benytte DAKO s EnVision G/2 doublestain system, Rabbit/Mouse (DAB+/Permanent Red), da Herlev Patologi Afdeling (HPA) tidligere har benyttet dette system og derfor har gode erfaringer med det og da jeg selv har arbejdet en del med DAKO s produkter, føler jeg mig tryg ved det. Dertil har jeg valgt at benytte DAKO s Autostainer, Universal Staining System (DAUSS), da man får en mere ensartet farvning og procedure ud af at benytte denne metode, desuden bruges denne metode i den daglige rutine, hvor det fungerer godt. De Autostainere som er til rådighed på HPA er godt nok ikke optimeret til at kunne køre en hel dobbeltfarvning og jeg må derfor stoppe maskinen efter den første farvning for at sætte den nye farvning i gang. Desuden har jeg valgt at afparaffinere i tissueclear, rehydrere i en faldende koncentration af alkohol, forbehandle i HIER, dehydrere i stigende koncentrationer af alkohol, kernefarve i Mayers, og til sidst montere dækglas med Xylen på dækglasmaskine. Ovenstående er de forog efterbehandlingsmetoder som benyttes i den daglige rutine på HPA og de er valgt fordi de til dagligt fungere tilfredsstillende og at det vil gøre en evt. implementering meget lettere, da alle arbejdsgangene er lette at udføre og kendt af de medarbejdere, som er i den daglige rutine. Den ene del af doublestain kittet består af HRP/DAB+. Dette detektions/visualiseringssystem benyttes på HPA i dag, hvor man har gode erfaringer med det. Jeg har også selv brugt det i forsøg, hvorfor jeg også selv har gode erfaringer med dette system. Den anden del består af detektions/visualiseringssystem AP/PR, hvilket benyttes fordi det automatisk følger med kittet. PR benyttes ikke i den daglige rutine på HPA, derfor vides det ikke hvilken antistofkoncentration der skal benyttes for CD31 og DBA44. Det bevirker at jeg er nødt til at lave en fortyndingsrække (indkøre) PR. HPA har erfaringer med at PR giver et svagere farvningsresultat end DAB+, derfor har jeg valgt at tage udgangspunkt i fortyndingsgraden 1:80 for CD31 og 1:20 for DBA44, da det er disse fortyndingsgrader der anvendes i den daglige rutine, hvorefter jeg halverer disse fortyndingsgrader flere gange. Indkøring af PR sammenligner jeg med to snit fra rutinekørslen indeholdende CD31/DAB+ og DBA44/DAB+,

13 for at sikre mig at intensitet og antal B-lymfocytter er nogenlunde ens. Herefter scores de efter Nordiqc s scorings system (Se side 18). DAB+ bliver kun brugt i den daglige rutine til enkeltfarvninger og bliver indkøbt som et enkelt reagens. Til dobbeltfarvningen følger DAB+ (DAB+D) med kittet og det vides derfor ikke om der er forskel på de to DAB+ produkter, derfor skal DAB+D fra kittet også indkøres. Der opsættes derfor en fortyndingsrække magen til indkøringen for PR, men med andre fortyndinger. Disse vurderes og scores på samme måde som indkøringen af PR. Da jeg heller ikke ved hvilken rækkefølge DAB+D og PR skal have, er jeg nødt til at prøve mig frem. Jeg ved ikke hvilken kombination, der vil være pænest/lettest at se på og om det kromogen der farves med først, har en indvirkning på det andet kromogen. Derfor opsætter jeg et forsøg hvor dette indkøres. Resultatet vurderes og scores ud fra et nyt scoringssystem lavet til dette forsøg. Til sidst vil jeg afprøve dobbeltfarvningen på malignt væv, for at se om det så også har den tilsigtede virkning, altså om man vil kunne finde B-lymfocytter som vokser intrasinusoidalt og om man derved vil kunne skelne mellem sygdommene HCL og SMZL. Til dette har jeg fundet nogle prøver som er diagnosticeret med HCL, SMZL eller hvor der er tvivl om det er HCL eller SMZL. Her skal man dog være opmærksom på, om patienten har nedlagt forbud mod brug af deres væv til kliniske forsøg. Dette skal kontrolleres i vævsanvendelsesregisteret (VAR). Resultaterne vurderes og scores ud fra et nyt scoringssystem som er lavet til dette forsøg (Se side 18). Materialer og metode Materialer - Dako autostainer, Universal Staining System (DAUSS) - DAKO Envision G/2 Doublestain system, Rabbit/Mouse (DAB+/Permanent Red). K Monoclonal Mouse Anti-Human CD31, Endothelial Cell, klon JC70A fra DAKO, M Monoclonal Mouse Anti-Human Leukaemia, Hairy Cell, klon DBA44 fra DAKO, M Til indkøring af PR, DAB+D og til indkøring af dobbeltfarvningen anvendes væv fra en multiblok, som består af et snit med Appendix og HCL og til afprøvning af

14 dobbeltfarvningerne anvendes crista biopsier og koagel fra patienter diagnosticeret med HCL eller SMZL. Metode Skæring, montering og tørring Der anvendes en multiblok indeholdende væv fra appendix og hårcellelymfom til indkøring af PR, DAB+D og til indkøring af dobbeltfarvningen. Snittene skæres på en rotationsmikrotom med vandfald, i 2µm tykkelse og snittene strækkes i varmt vand. Når man skærer på denne måde, giver det nogle mere ensartede snit, som derfor er lettere at sammenligne. Til afprøvning af dobbeltfarvningerne anvendes crista biopsier og koagel fra patienter diagnosticeret med HCL eller SMZL. Alle patientprøver skæres på slædemikrotom i 2-3 µm tykkelse, da der kun skal bruges nogle få snit af hver patientprøve. Alle snit bliver monteret på elektrostatisk behandlede super frost+ glas, som nedsætter risikoen for at man mister snittene i den efterfølgende farvningsprocedure. Derpå er de sat til tørring i varmeskab i 30 minutter ved 60 ºC. Og opbevares i køleskab (+4 ºC) indtil brug. Afparaffinering Snittene er afparaffineret i tissue clear og en faldende koncentration af alkohol. (Se bilag 6). Dette er nødvendigt fordi vores farvning foregår i vandigt miljø, hvilket ikke er blandbart med paraffin. 8 Forbehandling Forbehandlingen (Se bilag 4) sker i TEG-buffer ph9 i mikrobølgeovn ved 100 ºC i 15 min. Derefter står snittene på bordet i bufferen og køler af i 15 min. hvorefter man yderligere køler dem ned med ioniseret vand. Vandet hældes fra og erstattes med skyllevæske med Tween 20, hvilket gør at man undgår udtørring. En eventuel udtørring af snittene kan medføre en øget uspecifik farvning. Nu er snittene klar til at blive sat i Autostaineren. Kernefarvning, dehydrering og montering Alle snit er kerne/kontrast farvet i Mayer s i 2 min. Dette gør man for at kunne se den mere præcise placering af reaktionsproduktet i en immunfarvning. 7 Dehydrering er nødvendig fordi der bruges xylen som monteringsmiddel, hvilket ikke er blandbart med vand. Ved dehydring føres snittene gennem en stigende koncentration af

15 alkohol, således at vandet i vævet bliver udskiftet med alkohol og dermed bliver blandbart med monteringsmidlet. 7 Monteringen af film foregår på en Sakura, Tissue-Tek SCA maskine. (Se bilag 7). Alle snit er dehydreret, kernefarvet og monteret på denne måde. Indkøring af fortyndinger til PR Til indkøring af PR er der lavet 6 glas med snit fra multiblokken som nedenstående, disse farves på en gang og på samme maskine. Der er desuden kørt to glas DBA44/DAB+ og CD31/DAB+ som alm. rutinesnit, som er kørt på en anden maskine sammen med rutinekørslen. Antistof Glas 1/PR Glas 2/PR Glas 3/PR CD31 1:20 1:40 1:80 Antistof Glas 4/PR Glas 5/PR Glas 6/PR DBA44 1:5 1:10 1:20 På baggrund af resultaterne er to af fortyndingerne udvalgt til videre forsøg. Der fortsættes med de to udvalgte i kørslen Indkøring af dobbeltfarvning på multiblok. Indkøring af fortyndinger til DAB+D Til indkøring af DAB+ laves der 6 glas med snit fra multiblokken som nedenstående, disse farves på en gang og på samme maskine. Antistof Glas 9/DAB+D Glas 10/DAB+D Glas 11/DAB+D CD31 1:20 1:40 1:80 Antistof Glas 12/DAB+D Glas 13/DAB+D Glas 14/DAB+D

16 DBA44 1:5 1:10 1:20 På baggrund af resultaterne er to af fortyndingerne udvalgt til videre forsøg. Der fortsættes med de to udvalgte i kørslen Indkøring af dobbeltfarvning på multiblok. Indkøring af dobbeltfarvning på multiblok Indkøring af dobbeltfarvning på multiblok sker ud fra nedenstående skema. Glas 15 og 17 køres sammen, da der her skal påføres DAB+D først og glas 16 og 18 køres sammen, da der her skal påføres PR først. Glas nr. 1. visualisering 2. visualisering 15 CD31/PR 1:20 DBA44/DAB+D 1:5 16 CD31/DAB+D 1:20 BLOKERING DBA44/PR 1:5 17 DBA44/PR 1:5 CD31/DAB+D 1:20 18 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:20 Da jeg kun har fået én flot visualisering ud af denne indkøring, har jeg valgt at afprøve den udvalgte fortynding og påføringsrækkefølge på væv diagnosticeret med SMZL eller formentlig SMZL. Afprøvning af dobbeltfarvning med rækkefølgen CD31/DAB+D og DBA44/PR på væv diagnosticeret med SMZL Her er der valgt at afprøve rækkefølgen CD31/DAB+D og DBA44/PR på væv diagnosticeret med SMZL. Til denne kørsel er der fundet 7 patientprøver frem, med diagnosen SMZL eller formentlig SMZL. Nedenstående skema viser hvilken visualiseringsrækkefølge og hvilke fortyndinger der er anvendt. Patient nr. 1. visualisering 2. visualisering 1 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 2 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 3 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 4 CD31/DAB+D 1:20 BLOKERING DBA44/PR 1:5 5 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 6 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5

17 7 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 Da denne dobbeltfarvning ikke virkede som jeg troede, har jeg valgt at gå tilbage til at indkøre dobbeltfarvningen igen, men denne gang på malignt væv. Og på baggrund af resultaterne har jeg valgt kun at tage 5 af patientprøverne med til dette videre forsøg. Årsagen til at to af patientprøverne er valgt fra er, at der simpelthen ikke var væv nok i prøverne. Indkøring af dobbeltfarvning med rækkefølgen DBA44/DAB+D og CD31/PR på de 5 resterende patientprøver I denne kørsel afviger jeg fra mit metodevalg, da jeg vælger at indkøre igen men på det maligne væv. Det gør jeg ved at afprøve den modsatte rækkefølge af antistofferne, således at der nu køres med DBA44/DAB+D og CD31/PR og samtidig vil jeg prøve med en højere koncentration af antistoffet CD31 (1:10 og 1:5). Det betyder at der laves to snit for hver patientprøve. Grunden til at jeg har valgt at ændre på 2 parametre på en gang og at jeg indkører på malignt væv er, at jeg er ved at løbe tør for antistoffer, hvorfor jeg er nødt til at rationalisere. Patient nr. 1. visualisering 2. visualisering 1 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:5 1 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:10 3 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:5 3 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:10 5 DBA44/DAB+D 1:5 BLOKERING CD31/PR 1:5 5 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:10 2 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:5 2 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:10 6 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:5 6 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:10 På baggrund af resultaterne er der udvalgt en patientprøve til videre forsøg.

18 Indkøring af dobbeltfarvning med nye fortyndinger af DBA44 Med udgangspunkt i det forrige resultat, har jeg valgt at prøve med fortyndingerne 1:10 og 1:20 for antistoffet DBA44. Grunden til at jeg kun har valgt at gå videre med en patientprøve er, at jeg er ved at løbe tør for antistoffer og derfor stadig prøver at rationalisere således at jeg kan komme så langt som muligt med dette forsøg. Patient 1. visualisering 2. visualisering nr. 6 DBA44/DAB+D 1:10 BLOKERING CD31/PR 1:5 6 DBA44/DAB+D 1:20 CD31/PR 1:5 På baggrund af resultaterne er der udvalgt en patientprøve til videre forsøg. Afprøvning af dobbeltfarvning på væv med diagnosen SMZL, HCL eller formentlig SMZL eller HCL På baggrund af resultaterne fra forrige kørsel, har jeg udvalgt 10 patientprøver (det bliver dog til 12 snit, da 2 af prøverne er på både crista biopsi og på koagel) som tidligere er diagnosticeret med SMZL eller HCL, som jeg her til slut vil afprøve med dobbeltfarvningen DBA44/DAB+D i fortyndingen 1:10 som den første visualisering og CD31/PR i fortyndingen 1:5 som den anden visualisering. Samtidig køres der 2 kontroller. Patient nr. 1. visualisering 2. visualisering 1 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 2 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 3 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 8 DBA44/DAB+D 1:10 BLOKERING CD31/PR 1:5 9 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 9 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5

19 10 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 10 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 11 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 12 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 13 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 14 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 Da denne kørsel var færdig og der skulle mikroskoperes opdagede jeg, at jeg har glemt at tage patientprøve nr. 6 med en gang til. Det er rigtig ærgerligt, da det betyder at jeg ikke har noget at sammenligne mit slutresultat med. Kontroller Der er i den sidste kørsel medtaget en kontrol, hvor det ene antistof er udeladt for at sikre, at detektionssystemet/hrp ikke reagerer med noget uspecifikt i vævet og en hvor det andet antistof er udeladt for at sikre, at detektionssystemet/ap ikke reagerer med noget uspecifikt i vævet. Kontrol Multiblok - /DAB+D CD31/PR 1:5 Kontrol Multiblok DBA44/DAB+D 1:80 - /PR Mikroskopering og scoring Al Mikroskopering er fortaget på et Olympus BX40 lysmikroskop. Til indkøring af PR, DAB+D er der scoret ud fra Nordiqc s scoringssystem, som siger følgende: Nordiqc s scoringssystem 3 = Optimal, perfekt, intens og distinkt i alle relevante vævsstykker svarende til afsnittets optimering. 2 = God, fuldt acceptabel, knap så intens, baggrund/overfarvning kan ses, alle relevante vævsstykker er farvet. 1 = Borderline, svag farvning, falsk neg. eller falsk pos. reaktion. 0 = Dårlig, Uacceptabel, falsk neg. eller falsk pos. reaktion. Samtidig med indkøringen af PR og DAB+D, er der kørt to snit med rutine CD31/DAB+ og DBA44/DAB+. Disse to snit er brugt til at sammenligne de to nye snit med. På den måde kan

20 jeg se om intensiteten og antallet af celler er nogenlunde det samme på den nye indkøring af PR og DAB+D som der er på rutinesnittene. Ved indkøring af dobbeltfarvningen på multiblok og farvning af patientprøverne, har det dog ikke været muligt at benytte Nordiqc s scoringssystem i sin nuværende form. Jeg har derfor tilladt mig at ændre lidt på det, hvilket kom til at se således ud: Eget scoringssystem 3 = Perfekt, intens og optimal farvning i alle relevante celler, ingen baggrund/overfarvning. 2 = OK, knap så intens farvning, lettere baggrund/overfarvning, uspecifik farvning. 1 = Dårlig, moderat baggrund/overfarvning, svag farvning, falsk positiv eller falsk negativ reaktion, Uspecifik farvning, let blandingsfarve. 0 = Meget dårlig, kraftig baggrund/overfarvning, ingen farvning, kraftig blandingsfarve, falsk Positiv eller falsk negativ reaktion. Resultater Indkøring af PR, DAB+D, indkøring af dobbeltfarvningen på multiblok og kontroller er foretaget på multiblok væv. Indkøring af PR på multiblok Glas nr. Antistof Fortynding Score 1 CD31 1: CD31 1: CD31 1:80 2

21 4 DBA44 1:5 3 5 DBA44 1: DBA44 1: CD31 Rutine 1: DBA44 Rutine 1:20 3 Glas 1: Flot visualisering af endothelcellerne (karrene) i HCL, men svag endothel farvning i appendix. Er udvalgt til videre forsøg (Se billede 1). Glas 4: Flot visualisering af B-lymfocytterne i HCL, men svag B-lymfocyt farvning i appendix. Er udvalgt til videre forsøg (Se billede 2). Billede 1. Farvet med CD31/PR 1:20 Billede 2. Farvet med DBA44/PR 1:5 Indkøring af DAB+D på multiblok Glas nr. Antistof Fortynding Score 9 CD31 1: CD31 1:40 2

22 11 CD31 1: DBA44 1: DBA44 1: DBA44 1:20 2 Glas 9: Flot visualisering af endothelcellerne (karrene) i HCL, men svag endothel farvning i appendix. Er valgt til videre forsøg (Se billede 3). Glas 12: Flot visualisering af B-lymfocytterne i HCL, men svag B-lymfocyt farvning i appendix. Er valgt til videre forsøg (Se billede 4). Billede 3. Farvet med CD31/DAB+D 1:20 Billede 4. Farvet med DBA44/DAB+D 1:5 Indkøring af dobbeltfarvning på multiblok Glas 1.visualisering 2. visualisering nr. Score Kommentar DAB+D PR 15 CD31/PR 1:20 DBA44/DAB+D 1:5 0 0 Overfarvning 16 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1: DBA44/PR 1:5 CD31/DAB+D 1: Blandingsfarve 18 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1: Overfarvning

23 I denne kørsel er det kun fortyndingerne CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5 (snit 16) (Se billede 5) som viser en rigtig flot visualisering af endothelceller og B-lymfocytter. Dette snit er derfor valgt til videre forsøg. Se også billede 6 af snit 18, som viser en overfarvning. Billede 5. Snit 16. Farvet med Billede 6. Snit 18. Viser en overfarvning CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5 med DBA44/DAB+D 1:5; CD31/PR 1:20 Afprøvning af dobbeltfarvning med rækkefølgen CD31/DAB+D og DBA44/PR på væv diagnosticeret med SMZL Patient 1. visualisering 2. visualisering Score Kommentar nr. DAB+D PR 1 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 0 1 Kraftig overfarvning/ svag farvning 2 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 0 2 Kraftig overfarvning/ knap så intens farvning 3 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 0 1 Kraftig overfarvning/ svag farvning 4 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 0 0 Få celler 5 CD31/DAB+D 1:20 DBA44/PR 1:5 0 2 Kraftig overfarvning/ knap så intens farvning 6 CD31/DAB+ 1:20 DBA44/PR 1:5 0 2 Kraftig overfarvning/ knap så intens farvning

24 7 CD31/DAB+ 1:20 DBA44/PR 1:5 0 0 Få celler På baggrund af resultaterne er patientprøve 1 (CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5) (Se billede 7), patientprøve 2 (CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5), patientprøve 3 (CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5), patientprøve 5 (CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5) og patientprøve 6 (CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5) udvalgt til næste dobbeltfarvning, da patientprøve 4 (Se billede 8) og 7 indeholder for få celler til at man kan udlede noget af resultatet. Billede 7. Patient 1. Viser en overfarvning/svag Billede 8. Patient 4. For få celler farvet med farvning med CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5 CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5

25 Indkøring af dobbeltfarvning med omvendt antistofrækkefølge på 5 udvalgte prøver Patient nr. 1. visualisering 2. visualisering Score Kommentar DAB+D PR 1 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:5 1 1 Blandingsfarve 1 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1: Blandingsfarve 2 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:5 2 3 Let overfarvning 2 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1: Let overfarvning 3 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:5 2 3 Let overfarvning 3 DBA44/DAB+D 1:5 intens farvning Let CD31/PR 1: overfarvning/knap så 5 DBA44/DAB+D 1:5 intens farvning Moderat CD31/PR 1:5 1 2 overfarvning/ knap så 5 DBA44/DAB+D 1:5 intens farvning Moderat CD31/PR 1: overfarvning/ knap så 6 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1:5 2 3 Let overfarvning 6 DBA44/DAB+D 1:5 CD31/PR 1: Let overfarvning/svag farvning På baggrund af resultaterne er patientprøve 6 (DBA44/DAB+D 1:5; CD31/PR 1:5) (Se billede 9) udvalgt til videre forsøg. Billede 9. Patient 6. Farvet med DBA44/DAB+D 1:5; CD31/PR 1:5

26 Indkøring af dobbeltfarvning med nye fortyndinger af DBA44 Patient 1. visualisering 2. visualisering Score Kommentar nr. DAB+D PR 6 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1: DBA44/DAB+D 1:20 CD31/PR 1:5 2 3 For svag Resultatet her viser en meget flot visualisering af B-lymfocytter og endothelceller, ved dobbeltfarvning med DBA44/DAB+D 1:10 og CD31/PR 1:5 (Se billede 10). Denne patientprøve er derfor valgt til den næste dobbeltfarvning. Billede 10. Patient 6. Farvet med DBA44/DAB+D 1:10 og CD31/PR 1:5

27 Afprøvning af dobbeltfarvning på væv med diagnosen SMZL, HCL eller formentlig SMZL eller HCL Patient 1. visualisering 2. visualisering Score Kommentar nr. DAB+D PR 1 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 0 0 Kraftig overfarvning 2 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 0 3 Kraftig overfarvning 3 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 1 2 Moderat overfarvning/ uspecifik 8 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 1 0 Moderat overfarvning/ ingen kar 9 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 1 0 Moderat overfarvning/ få celler

28 9 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 0 0 For få celler 10 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 0 1 Kraftig overfarvning/ svag farvning 10 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 0 1 Kraftig overfarvning/ svag farvning 11 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 0 0 Få celler 12 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 1 2 Svag farvning/ knap så intens 13 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 1 1 Meget svag farvning 14 DBA44/DAB+D 1:10 CD31/PR 1:5 0 1 Kraftig overfarvning/ svag farvning Resultatet af denne dobbeltfarvning viser at jeg stadig ikke har fået optimeret mine farvninger rigtigt, da der ikke er kommet bare en patientprøve ud af det, med en flot visualisering. Og jeg vil derfor ikke kunne fortsætte forsøget, ud fra disse farvninger. Se billede 11, af patient 9, og billede 12, af patient 14, som viser et generelt billede af hele denne kørsel. Billede 11. Patient 9. Farvet med Billede 12. Patient 14. Farvet med DBA44/DAB+D 1:10; CD31/PR 1:5 DBA44/DAB+D 1:10; CD31/PR 1:5

29 Diskussion Generelt om forsøget Der findes rigtig mange artikler omkring emnet Dobbeltfarvning og det lader til at mange af dem ikke har de store problemer med disse farvninger. 11,12,13,13 og 14 Mit forsøg viser dog et noget andet billede. Der er og opstår rigtig mange problemer, såvel i planlægningsfasen som i selve indkørings/afprøvningsfasen. Der er således undervejs i forsøget, sket et par ting som kræver yderligere forklaringer og den kommer så her. Hele indkøringen af PR/DAB+D og indkøring af dobbeltfarvningen på multiblok væv gik rigtig fint. Derfor vælger jeg at afprøve dobbeltfarvningen CD31/DAB+D 1:20; DBA44/PR 1:5 på 7 maligne patientprøver. De 7 patientprøver (patientprøve 1-7) indeholder kun sygdommen SMZL fordi det er her jeg vil kunne påvise B-lymfocytter som vokser intrasinusoidalt, hvilket jeg ikke har kunnet påvise i mine indkørsler, som jo har været på multiblok væv. Resultatet viser sig desværre ikke at være særlig godt. Det er derimod så ringe, at jeg er nødt til at gå tilbage til indkøring af farvningerne, hvilket er en afvigelse fra mit metodevalg. Jeg har valgt at fortsætte min indkøring på malignt væv fordi det har vist sig at være her der er problemer. Og selvom jeg har fået fine resultater på multiblok vævet, har det vist sig ikke at kunne overføres direkte til det maligne væv. Jeg vælger derfor at gå videre med forsøget på følgende måde. Jeg fravælger patientprøve 4 og 7, fordi der ikke er væv nok på de prøver. Samtidig bytter jeg om således at CD31 kører sammen med PR i fortyndingerne 1:10 og 1:5 og DBA44 køres sammen med DAB+D i fortyndingen 1:5. Normalt må der ikke ændres på flere parametre ad gangen, fordi man så ikke vil kunne tage stilling til hvilket parameter der gør hvad, men jeg er temmelig begrænset i mængden af antistoffer til min rådighed, så derfor er jeg nødt til at gøre det således. Den nye kørsel viser nogle middelmådige visualiseringer, men når DBA44 kører sammen med DAB+D, kan den nok godt fortyndes yderligere. I det nye forsøg køres der med DBA44/DAB+D i fortyndingerne 1:20 og 1:10 og med CD31/PR i fortyndingen 1:5. Her vælger jeg igen at afvige fra mit metodevalg, da jeg stadig er begrænset hvad antistoffer angår. Derfor har jeg valgt kun at udtage en patientprøve, nemlig patientprøve 6, til dette nye forsøg, da det er den patientprøve jeg synes er flottest

30 visualiseret. Det var dog nok ikke det klogeste valg, fordi jeg har en farvning på patientprøve 2 og 3 som er scoret lige sådan, så dem kunne jeg jo godt have valgt at tage med, men det gjorde jeg altså ikke. Resultatet viser en meget flot visualisering af patientprøve 6 farvet med DBA44/DAB+D 1:10 og CD31/PR 1:5 og den bliver så udvalgt til næste kørsel. Denne nye kørsel bliver også den sidste, da jeg nu er meget tæt på at løbe tør for antistoffer. Jeg vælger derfor nok engang at tage patientprøve 1, 2 og 3 med på ny, men samtidig tager jeg nogle nye patientprøver 8, 9, 10, 11, 12, 13 og 14 med, fordi jeg indtil nu kun har haft patientprøver diagnosticeret med SMZL med i forsøget. Disse nye prøver er diagnosticeret med SMZL, HCL eller formentlig SMZL eller HCL, så jeg tager altså først nu sygdommen HCL med ind i forsøget. Hvilket er nødvendigt, da det er de to sygdomme lægerne ønsker at kunne skelne fra hinanden. Grunden til at jeg atter har taget patientprøve 1, 2 og 3 med, er for at se om man får de samme snit fra gang til gang, det vil sige om man kan finde de samme celler og om de ser ens ud. Jeg har desværre måttet erfare, at det kan man ikke, jeg har flere gange prøvet om jeg kunne finde de samme celler i efterfølgende snit, men uden held. Det skyldes, at de dele i snittet jeg ønsker at se, er så små, at jeg meget let får skåret dem væk allerede ved det første snit og det er ikke så godt, for det vil sige jeg risikerer at finde B- lymfocytter som vokser intrasinusoidalt på det første snit, men ikke på det næste, hvilket jo så giver en stor usikkerhed i tolkningen af sygdommene. Desuden er de taget med fordi jeg så havde noget at sammenligne med, men jeg måtte desværre revidere mine tanker omkring dette, da de ikke har været med i alle kørsler og derfor ikke kan sammenlignes. Den patientprøve som udvælges fra den forrige kørsel, tages altid med i den næste kørsel. Men da jeg er færdig med denne sidste kørsel, opdager jeg, at jeg har glemt at tage patientprøve 6 med igen. Dette var ellers den eneste patientprøve jeg ville kunne lave en sammenligning på, da den så havde været med i alle kørsler. Man kan nemlig ikke sammenligne forskellige patientprøver, fordi der er forskel på det humane væv. Men jeg synes ikke det betyder så meget i det her tilfælde, da ét snit, er for lidt at tolke noget på. Her burde jeg have taget patientprøve 1, 2 og 3 med, dels for at se om patientprøve 1 stadig havde vist en blandingsfarve eller om der her var tale om noget dag til dag variation, da HPA har erfaringer med, at et af de største problemer med dobbeltfarvninger netop er dag til dag variationer, men også fordi jeg så havde haft en patientprøve mere at sammenligne på. Og havde jeg taget patientprøve 2 og 3 med, havde jeg haft endnu flere sammenligningsgrundlag.

31 Fiksering Et andet meget stort problem jeg stødte på, er manglen på standardisering inden for fikseringstiderne. I alle multisnit er der fundet svag farvning i appendix, som kan skyldes fikseringstiden. Det anbefales at fiksere i timer. 8 Derved undgår man koagulation under dehydreringen, som kan forekomme ved for kort fikseringstid eller den tiltagende maskering, som kan forekomme ved for lang fikseringstid. Men da HPA udvælger sine multiblokke således, at de ikke er fikseret i for kort eller for lang tid og da det er i alle appendix snit, tvivler jeg på at det er årsagen her og kan i øvrigt ikke give nogen forklaring på dette. Samtlige appendix snit fra multiblokken er svagt visualiseret, men jeg har alligevel scoret dem 3, det har jeg fordi den viser den samme svage farvning i alle snit og fordi jeg hovedsagligt har set på hvordan HCL snittene så ud, og da de var flot visualiseret, lod jeg stå til med appendix farvningen. I multiblokke kan man dog ikke sige noget om fikseringstiden for HCL, da det er sygdomsvæv og jeg derfor ikke ved med sikkerhed hvor lang tid det har været fikseret, desuden kan det være meget svært at få fat i, så man kan være nødt til at gå på kompromis, når det skal udvælges. Det er dog noget andet når man så kikker på patientprøver, for her kan man ikke være sikker på fikseringstiden. I patientprøve 13 i den sidste kørsel er der fundet svag visualisering for begge farvninger, dette kan skyldes fikseringstiden, men da jeg ikke kender fikseringstiden, kan jeg ikke sige om det er for kort eller forlang fikseringstid. Der er ligeledes fundet en del dobbeltfarvninger hvor den ene farvning er svag eller helt manglede (patientprøve 1, 8, 10, 12, 13 og 14), det er dog kun i patientprøve 12 at DAB+D er svag, resten af patientprøverne er det PR den er gal med. Det kan også skyldes fikseringstiden, da der jo er forskel på de to farvninger i form af de enzymer de benytter, og der kan også godt være forskel på, hvor følsomme de forskellige farvninger er over for fikseringstiden. CD31/DBA44 I dette forsøg er det også et spørgsmål om valget af de to antistoffer er særlig god. Det bunder sig i at de faktisk påviser de samme ting, nemlig endothel og B-lymfocytter, hvilket jo godt kunne give problemer. Der kan f.eks. forekomme lymfatiske kar (endothel) i appendix, som her vil blive påvist med DBA44, hvilket er en af de ting jeg er stødt på, i indkøringen af PR/DAB+D. For at være sikker på at det nu også var lymfekar, er der kørt en immunfarvning med D2-40 plus en kontrol på denne, for at be- eller afkræfte om der er tale om lymfekar, da

32 D2-40 netop påviser lymfekar. Resultatet viste da også at der var tale om lymfekar. Se billede 12 og 13. Billede 12. Kar farvet med DBA44/PR, det er formentlig lymfekar. Billede 13. Lymfekar farvet med D2-40. Problemerne med at begge antistoffer påviser det samme kunne vel i virkeligheden f.eks. være, at jeg fik farvet både de raske og de syge B-lymfocytter i HCL. Jeg kunne vel også få en blandingsfarve, som ville gøre det endnu mere umuligt at se, om der er tale om kar neden under B-lymfocytterne. Der har dog ikke vist sig nogen problemer, som munder sig ud i at antistofferne sådan overlapper hinanden i dette forsøg. Men jeg vil da sige, at man skal prøve og finde et andet antistof end CD31, så man kommer ud over denne overlapning og således at der absolut ikke opstår tvivlsspørgsmål. PR Mine resultater viser at PR er lidt mere diffus (udtværet, vattet) end DAB+D. Årsagen til dette skal findes i, at der er forskel på de enzymer som benyttes til henholdsvis PR og DAB+D. Desuden vil man næsten altid ved dobbeltfarvninger, finde at den ene farvning er mere diffus end den anden, hvilket skyldes at der er mangel på passende kromogener når man laver dobbeltfarvninger. 14 Farvekombination Som det vil fremgå af nedenstående, er der vist lidt tvist om, hvorvidt de to farvninger påvirker hinanden og hvordan.

33 Hvad angår valget af farvekombinationen, siges det at DAB+D har en beskyttende effekt mod krydsreaktioner, men så skal den påføres som den første farvningssekvens. 13 og 14 Men samtidig siges det at AP skal påføres først, da DAB+D aktiviteten kan have en ødelæggende virkning på AP aktiviteten, 12 det er bare ikke det jeg er nået frem til. Mine resultater viser at hvis CD31/DAB+D visualiseres som den første farvning og DBA44/PR visualiseres som farvning nummer to (snit 16), får jeg et rigtig flot resultat, mens de øvrige kombinationer (CD31/PR; DBA44/DAB+D, DBA44/PR; CD31/DAB+D og DBA44/DAB+D; CD31/PR) giver et meget rodet billede med overfarvninger og blandingsfarver. DAB+D har altså ikke i dette forsøg, haft en ødelæggende virkning på AP 12. Jeg har godt nok fået nogle flotte resultater under indkøringen af PR og DAB+D, men her var det jo kun som enkelt farvninger, hvilket godt kan ændre sig meget drastisk, når man går over til at køre dobbeltfarvninger. Inkubering Måske har inkuberingstiderne også en stor betydning. Jeg har fulgt anbefalingerne i DAKO s datasheed for EnVision G2 systemet 5 og inkuberet som følgende: Reagens Proceduretrin Egen Dual Endogenous Enzyme Block inkubationstid Gennemsnitlige inkubationstider for 11, 12, 13 og 15 artiklerne End. Enz. Block 5 minutter 15 minutter DBA44 Primært antistof 10 minutter minutter eller natten over

34 Polymer HRP Sekundært 10 minutter 30 minutter reagens DAB+ Substrat 10 minutter 5-10 minutter Doublestain Block Ekstra 3 minutter 15 minutter CD31 Primært antistof 10 minutter minutter eller natten over Rabbit/Mouse link Sekundært 10 minutter - reagens Polymer AP Tertiært reagens 10 minutter - Permanent Red Substrat 10 minutter 5-20 minutter Som ovenstående skema viser, har jeg inkuberet i meget kortere tid (10 min.) end man gør i den daglige rutine (30 min.) og end de fleste af artiklerne 11,12,13 og 14. Samtidig kan man læse i DAKO s datasheed 4, 5 for de enkelte antistoffer at de anbefaler at inkuberer i 30 minutter. Jeg har ligeledes benyttet DAKO s EnVision Flex system i mit 6. semester projekt, her inkuberede man i 20 minutter. Derfor har jeg da undret mig over at man ved brug af kittet kun skal inkuberer i 10 minutter. Ved inkubering i længere tid, kunne man måske opnå en langt højere intensitet, hvilket måske ville have givet et noget andet resultat. Eller måske skulle det kun have været PR som skulle have haft en længere inkuberingstid, hvilket måske ville gøre at den blev visualiseret lidt kraftigere, så den var nemmere at skelne neden under B-lymfocytterne. Det kunne man jo overveje til et nyt forsøg. Valg af kit Jeg synes bestemt også man kan diskutere hvor godt et valg jeg har gjort, med valget af DAKO s kit, da den rød/brune farvning ikke har en god kontrast 14 og kun er god til visualisering af antigener på forskellige steder og ikke ved co-lokalisering, 13 hvilket jo egentlig er det vi prøver på. I den forbindelse kan man så også diskutere hvorvidt det er DAB+D der er for kraftig eller om det i virkeligheden er PR som er for svag? Personligt tror jeg at PR er for svag, da jeg er helt nede i en fortynding 1:5 og har været vidt omkring ud i fortyndinger, som gør at man hele tiden ledes hen mod tanken på, at den ikke er kraftig nok. Men et nyt forsøg med f.eks. Fast Red eller New Fuchsin eller en af de blå farver vil kunne

35 vise om de er bedre og måske kraftigere end PR. Men det er ikke kun denne kombination af farver, der ikke er god, der findes jo mange forskellige farvekombinationer, men der er ulemper ved dem alle. 12 Det kan jo også tænkes at være linkeren i kittet som ikke er så god som jeg tror. Jeg har tidligere lavet et forsøg med DAKO s EnVision Flex+ system, som skulle indeholde en linker magen til den i EnVision G2 systemet. Her viste det sig at linkeren ikke levede op til den forstærkning på 4-5 gange, som DAKO ellers lover. Og hvis det ellers forholder sig som jeg tror det gør med linkeren, så kan det jo også være tilfældet her, at den slet ikke forstærker så meget som DAKO siger, og det er der altså noget der tyder på, da den ikke formår at gøre PR særlig kraftig. Eller er det i virkeligheden en kombination af alle disse ting? Det vil kun et nyt forsøg kunne give svar på. Sygdomsstadiet Sygdommen SMZL har forskellige stadier. Det er derfor ikke sikkert man vil kunne finde B- lymfocytter som vokser intrasinusoidalt. Det er en af de ting jeg har observeret i mine resultater, der er rigtig mange patientprøver hvor jeg slet ikke finder det som jeg ellers rigtig gerne vil, nemlig B-lymfocytter som vokser intrasinusoidalt. Men det kan som sagt også skyldes at vævsdelene er så små at man får skåret dem væk allerede efter det første snit. Konklusion Ved at benytte detektions- og visualiseringssystemet HRP/DAB+D sammen med antistoffet CD31 i fortyndingen 1:5 efterfulgt af detektions- og visualiseringssystemet AP/PR sammen med antistoffet DBA44 i fortyndingen 1:10, kan man få indkørt en optimal immunhistokemisk dobbeltfarvning, på paraffinindstøbt kontrolmateriale indeholdende appendix og HCL. Men protokollen vil ikke kunne benyttes på væv, som tidligere er diagnosticeret med sygdommene SMZL og HCL, da man ikke kan skelne mellem eller finde B-lymfocytter og endothelceller når de ligger tæt eller når B-lymfocytterne vokser intrasinusoidalt.

36 Perspektivering Hvis jeg engang i fremtiden skulle afprøve en ny dobbeltfarvning, så ville jeg vælge DAB+ men sammen med et andet kromogen end PR. Ifølge Van der Loos et al. 2007, er der masser af muligheder. Desuden ville jeg ikke vælge et kit, men selv sammensætte forløbet. Det ville nok blive som følgende: Jeg ville se om ikke jeg kunne finde et andet antistof end CD31, så jeg får fjernet eventuelle problemer med overlapning. For der må findes et antistof som kun påviser endothelcellerne. Indkøring på multiblok væv Afprøvning på malignt væv Som farvekombination ville jeg nok vælge en af de blå farver og DAB+ 15 Den HIER forbehandling som benyttes i dette forsøg, virker jo godt i den daglige rutine og jeg har selv gode erfaringer med den, så den ville jeg nok vælge igen. Endogen blokering, her ville jeg også bare vælge den man benytter i den daglige rutine, da den fungerer fint. Der er tvist om hvad der er godt og skidt til blokering af den første farvning, 12, 13 og 15 men jeg tror jeg ville prøve med et HIER trin, da det er let at udføre. Dehydrering og kernefarvning fungere jo fint, så det ville bare være som det har været i dette forsøg. Litteraturliste 1. Cancerbackup. (4. juli. 2008). MacMillan cancer support. Lokaliseret d. 21. december 2008 på 2. National Cancer Institute. (8. januar. 2008). General Information About Hairy Cell Leukaemia. Lokaliseret d. 21. december 2008 på

37 3. Hansen, Niels E. et al. (2004). Medicinsk compendium, Bind 2. (16 udg.), København: Nyt Nordisk Forlag, Arnold Busck. 4. DAKO. (6. februar. 2003). Monoclonal Mouse Anti-Human CD31, Endothelial Cell. Kode nr. M0823. Lokaliseret d. 21. december 2008 på 5. DAKO. (19. december. 2002). Monoclonal Mouse Anti-Human Leukaemia, Hairy Cell Clone DBA.44. Kode nr. M Lokaliseret d. 21. december 2008 på 6. DAKO. (13. oktober. 2006). EnVision G 2 Doublestain System, Rabbit/Mouse (DAB+/Permanent Red). Kodenr. K5361. Lokaliseret d. 21. december 2008 på 7. Hallager, Kirsten. (1997). Histokemi og histologisk teknologi. Århus: Bioanalytiker uddannelsen. 8. Vyberg, Mogens. (2005). Anvendt Immunhistokemi. (6 udg. 2. reviderede oplag 07/2005). København: Bioanalytiker uddannelsen 9. Inger Holm. Bioanalytiker uddannelsen, forelæsning PBL 404. (2008). Immunhistokemi. Lokaliseret d. 21. december på de=thread&order=0&thold=0&menuid=m Søren Nielsen, Region Nordjylland. 11. Chaubert, Pascal. et al. (1997). Simultaneous Double Immunenzymatic Labelling: A New Procedure for the Histopathologic Routine. Modern Pathology, 10(6), Van der Loos, Chris. Et al. (1992). Practical suggestions for successful immunoenzyme double-staining experiments. Histochemical Journal, 1993 (25), Falini, Brunangelo. et al. (1986). Description of a sequential staining procedure for double immunoenzymatic staining of pairs of antigens using monoclonal antibodies. Journal of Immunological Methods, 1986 (93), Teramoto, Norihiro. et al. (1998). Simultaneous detection of two independent antigens by double staining with two mouse monoclonal antibodies. Journal of Virological Methods, 1998(73),

38 15. Van der Loos, Chris. (2007). Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 56(4),

39 Bilag 1

40

41

42 Bilag 2

43

44

45 Bilag 3

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60 Bilag 4

61

62 Bilag 5

63

64 Bilag 6

65

66 Bilag 7