Disse instruktioner gælder Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP).

Transkript

1 Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-mouse Kode K ml Kode K ml Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik. Disse instruktioner gælder Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP). Dette produkt er beregnet til brug med primære antistoffer fra mus leveret af brugeren til kvalitativ identifikation af antigener ved hjælp af lysmikroskopi i normale og patologiske paraffinindstøbte væv, cryostatvæv eller cellepræparater. Der kan anvendes væv fikseret i forskellige fiksativer herunder ethanol, B-5, Bouins, zinkformalin og neutral bufferformalin. Se Generel vejledning for immunhistokemisk farvning eller detektionssystemets Brugsanvisning vedr. IHCprocedurer, for: 1) Procedurens princip, 2) Nødvendige materialer, der ikke medfølger, 3) Opbevaring, 4) Prøveklargøring, 5) Farvningsprocedure, 6) Kvalitetskontrol, 7) Fejlfinding, 8) Fortolkning af farvning, 9) Generelle begrænsninger. Resumé og forklaring EnVision+ System, HRP er en totrins, IHC farvningsteknik. Systemet er baseret på en HRP-mærket polymer, som konjugeres med sekundære antistoffer. Den mærkede polymer indeholder ikke avidin eller biotin. Derfor er uspecifik farvning på grund af endogen avidin-biotin-aktivitet i lever, nyre, lymfevæv og cryostatsnit elimineret eller væsentligt reduceret. Reagenset i Dako EnVision+, HRP er klar til brug. Dette system er en yderst følsom metode, hvorfor de optimale fortyndinger af det primære antistof er op til 20 gange højere end dem, som bruges ved den traditionelle PAP-teknik, og adskillige gange større end dem, som bruges ved traditionelle ABC- eller LSAB-metoder. Protokollen byder på et forbedret signalgenererende system til detektion af antigener, der er tilstede i små koncentrationer eller til lave titre af det primære antistof. Primære antistoffer produceret i mus fungerer godt med den mærkede polymer. Fortolkningen af enhver positiv farvning eller fravær af samme skal ledsages af morfologiske og histologiske undersøgelser med egnede kontroller. Procedurens principper Leverede reagenser Enhver endogen peroxidaseaktivitet stoppes ved at inkubere prøven med et passende endogen peroxidaseblokerende reagens. Prøven inkuberes herefter med et passende karakteriseret og fortyndet primært museantistof fulgt af en inkubation med den mærkede polymer i to sekventielle 30-minutters inkubationer. Det skal bemærkes, at det ved antistoffer, der kræver enzymatisk digestion eller målgenfinding, kan være nødvendigt at øge inkubationstiderne for det primære antistof og den mærkede polymer med 5 til 10 minutter. Farvningen afsluttes med 5 30 minutters inkubation med et passende substrat-kromogen. Kode K4000: Nedenstående materiale er tilstrækkeligt til 150 vævssnit, baseret på 100 µl pr snit: Mængde 1x15 ml Beskrivelse Mærket polymer Peroxidasemærket polymer konjugeret til gede-anti-museimmunglobuliner i Tris-HCl-buffer indeholdende stabiliserende protein og et antimikrobielt middel. Kode K4001: Nedenstående materiale er tilstrækkeligt til 1100 vævssnit, baseret på 100 µl pr snit: Mængde 1x110 ml. Beskrivelse Mærket polymer Peroxidasemærket polymer konjugeret til gede-anti-museimmunglobuliner i Tris-HCl-buffer indeholdende stabiliserende protein og et antimikrobielt middel. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Absorberende servietter Kontrolvæv, positivt og negativt Kontrastfarve, vandbaseret, såsom Mayers hæmatoxylin eller Lillies Modified Mayer's Hematoxylin (kode S3309) Dækglas Destilleret vand Ethanol, absolut 95% Lysmikroskop (20x 800x) ( ) DK_003 s. 1/6

2 Monteringsmedier, såsom Glycergel Mounting Medium (kode C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting medium, Ready-to-use (kode S3025) eller ikke-vandigt permanent monteringsmedium, Ultramount (kode S1964) Primære antistoffer og negativ kontrolreagens Objektglas, Poly-L-lysin-coatede eller Silanized Slides (kode S3003) Farvningsglas eller bade Timer (med mulighed for intervaller på 3 40 minutter) Vaskeflasker Vaskebufferopløsning Xylen, toluen eller xylen-erstatninger Udover ovenstående liste er de følgende reagenser påkrævede for K4000 eller K4001 EnVision+, Peroxidase: Endogen peroxidase-blokerende reagens såsom Dual Endogenous Enzyme Block (kode S2003) Substrat-kromogen-opløsning såsom AEC+ Substrate-Chromogen, Ready-to-Use (kode K3469) 110 ml, eller Liquid DAB+ (kode S2002) Valgfrie, nødvendige materialer, der ikke medfølger Ammoniumhydroxid, 15 mol/l fortyndet til 0,037 mol/l PAP Pen (kode S2002). Forholdsregler Reagensklargøring 1. Anvendes af professionelle brugere. 2. Reagenserne må ikke bruges efter udløbsdatoen for den foreskrevne opbevaringsmetode. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de specificerede, skal brugeren verificere disse betingelser. 3. Udskift ikke reagenser med andre fra andre lot-numre eller andre producenter. 4. Enzymer og substrat-kromogener kan blive påvirket negativt, hvis de udsættes for stærke lyskilder. Undlad at opbevare kitkomponenter samt at udføre farvning i kraftig belysning, herunder direkte sollys. 5. Inkubationstider og temperaturer, der adskiller sig fra det specificerede, kan give anledning til fejlagtige resultater, enhver sådan ændring skal valideres af brugeren. 6. Som med alle produkter afledt ud fra biologiske kilder bør de korrekte håndteringsprocedurer følges. 7. Der skal anvendes personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med hud og øjne. 8. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i overensstemmelse med gældende lokal og statslig lovgivning. Det er en god idé at klargøre følgende reagenser forud for farvning. Vaskebufferopløsning TBST, 0,05 mol/l Tris-bufferjusteret saltvand med Tween (kode S3006) er den anbefalede vaskebuffer til automatisk og manuel IHC-detektion. TBS, 0,05 mol/l Tris-bufferjusteret saltvand (kode S1968) og PBS, 0,02 mol/l phosphatbufferjusteret saltvand (kode S3024) er også anvendelige vaskebuffere til manuel farvning. Vaskebufferopløsninger, der indeholder natriumazid, anbefales ikke. Natriumazid vil inaktivere peroxidasen (HRP), hvilket vil føre til negativ farvning. Opbevar ubrugt buffer ved 2 8 C. Bortskaf buffer som fre mstår uklar. Destilleret vand kan anvendes til afvaskning af peroxidaseblokering, substrat og kontrastfarve. Primært antistof NP-Series "Plus" klar-til-brug antistofferne er optimeret og anbefalet til brug sammen med Dako "Plus" højfølsomme detektionssystemer. Koncentrerede antistoffer fås også fra Dako. Det er nødvendigt, at brugeren udfører optimering af koncentrerede antistoffer. Fortyndinger skal klargøres under anvendelse af Antibody Diluent (kode S0809), eller en diluent der indeholder 0,05 mol/l Tris-HCl-buffer med 1% bovint serumalbumin (BSA). Dako N-Series klar-til-brug antistoffer er ikke optimeret til brug sammen med Dako "Plus" detektionssystemer. En inkubationstid på 30 minutter er tilstrækkelig for de fleste af de primære antistoffer, der bruges med dette kit. Negativ kontrolreagens Ved anvendelse af Dako NP-Series Plus klar-til-brug antistoffer, anbefales Universal Negative Control+ optimeret til brug med NP-Series Plus (kode NP015) klar-til-brug museantistoffer, som negativ kontrolreagens. Ideelt indeholder den negative kontrolreagens et antistof, som ikke udviser nogen specifik reaktivitet med humane væv eller normal/ikke-immun serum i samme matrix/opløsning som det fortyndede antistof. Den negative kontrolreagens skal være af samme underklasse og dyreart som det primære antistof, og den skal fortyndes til samme immunglobulin- eller proteinkoncentration som det fortyndede antistof med den samme diluent. Inkubationstiden for den negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof. Kontrastfarve Det farvede slutprodukt fra farvningsreaktionen er opløseligt i alkohol og bør kun bruges sammen med vandbaserede kontrastfarvestoffer såsom Mayers hæmatoxylin eller Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kode S3309). Kontrastfarvning med hæmatoxylin skal efterfølges af en grundig vask i destilleret vand, hvorefter objektglassene dyppes i et bad af 0,037 mol/l ammoniak eller lignende blåfarvningsmiddel. 0,037 mol/l ammoniakvand klargøres ved at blande 2,5 ml koncentreret (15 mol/l) ammoniumhydroxid med 1 liter vand. ( ) DK_003 s. 2/6

3 Ubrugt 0,037 mol/l ammoniak kan opbevares i op til 12 måneder ved stuetemperatur (20 25 C) i en tæt tillukket flaske. Se producentens retningslinier for alternative farvningsprocedurer. Monteringsmedier Glycergel Mounting Medium (Kode C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kode S3025) anbefales til vandig montering. Glycergel skal opvarmes til mindst 50 C umiddelbart før brug. D et ikke vandige, permanente monteringsmedium Ultramount (kode S1964) kan også anvendes. Opbevaring EnVision+, HRP skal opbevares ved 2 8 C. Må ikke fr yses. Må ikke anvendes efter udløbsdatoen på reagensflasker og produktetiketter. Ændringer i et reagens' udseende som f.eks. præcipitation, kan betyde, at produktet er ustabilt eller nedbrudt. I disse tilfælde må reagenset (-rne) ikke bruges. Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Der bør derfor udføres positive og negative kontroller samtidigt med patientprøver. Kontakt vores tekniske service, hvis der observeres uventet farvning, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med kittet. Klargøring af prøve Paraffinindstøbte væv Se Generel vejledning for immunhistokemisk farvning og/eller antistoffets specifikationsark. Forud for IHC-farvning skal vævene fikseres og behandles. Fiksering forhindrer autolyse og putrefaktion af udskårne væv, konserverer antigeniciteten, forøger vævskomponenternes refraktionsindeks og øger de cellulære elementers modstandsdygtighed mod vævsbehandling. Vævsbehandling omfatter dehydrering, fjernelse af dehydreringsmidler, infiltrering af indstøbningsmedier, indstøbning og udskæring af væv. De mest almindelige fiksativer til IHC-vævspræparater er omtalt i Generel vejledning for immunhistokemisk farvning. Dette er blot en rettesnor. De optimale procedurer skal bestemmes og verificeres af brugeren.(for specifik information vedr. vævsfiksering og -behandling, se reference 1 og 2.) Farvningsprocedure Proceduremæssige bemærkninger Brugeren skal læse disse instruktioner omhyggeligt og lære produktindholdet at kende forud for dets anvendelse. De leverede reagenser og instruktioner er designet med henblik på optimal effektivitet. Yderligere fortynding af produktreagenset eller ændringer af inkubationstider eller -temperaturer kan medføre fejlagtige resultater. Alle reagenser skal bringes op på stuetemperatur (20 25 C) forud for immunfarvning. Alle inkuberinger skal ligeledes foregå ved stuetemperatur. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise en øget uspecifik farvning. Dækglas udsat for træk. Hvis der anvendes lange inkubationstider, skal vævene placeres i et fugtigt miljø. Følsomheden for EnVision+, HRP kan øges yderligere ved at forlænge inkubationstiderne i trin 2 og 3 med 5 10 minutter. Farvningsprotokol TRIN 1 PEROXIDASEBLOKERING Overskydende buffer hældes fra. Med en fnugfri serviet (som f.eks. Kimwipe eller gaze) tørres der forsigtigt omkring præparatet for at fjerne eventuel resterende væske og for at holde reagenset på det foreskrevne areal. Der tilføres tilstrækkeligt med peroxidaseblokering til at dække præparatet. Der inkuberes i 5 (±1) minutter. Præparatet skylles forsigtigt med destilleret vand eller bufferopløsning fra en vaskeflaske (ret ikke væskestrømmen direkte mod vævet) og placeres i et frisk bufferbad. TRIN 2 PRIMÆRT ANTISTOF ELLER NEGATIV KONTROLREAGENS Overskydende buffer hældes fra og objektglassene aftørres som før. Der tilføres tilstrækkeligt med optimalt fortyndet primært antistof eller negativ kontrolreagens til at dække præparatet. Der inkuberes i 30 (±1) minutter. Præparatet skylles forsigtigt med bufferopløsning fra en vaskeflaske (ret ikke væskestrømmen direkte mod vævet) og placeres i et frisk bufferbad. Hvis det er nødvendigt at afbryde farvningsproceduren, kan objektglassene opbevares i et bufferbad efter inkubation af det primære antistof (trin 2) i op til én time ved stuetemperatur (20 25 C) uden a t påvirke farvningseffektiviteten. ( ) DK_003 s. 3/6

4 TRIN 3 TRIN 4 TRIN 5 TRIN 6 MÆRKET POLYMER-HRP ANTIMUS Overskydende buffer hældes fra og objektglassene aftørres som før. Der tilføres tilstrækkeligt med polymer til at dække præparatet. Der inkuberes i 30 (±1) minutter. Objektglassene skylles som i trin 2. SUBSTRAT-KROMOGEN Objektglassene aftørres som før. Der tilføres tilstrækkeligt med substrat-kromogen-opløsning til at dække præparatet. Der inkuberes i 5 30 minutter. Præparatet skylles forsigtigt med destilleret vand vaskeflaske (ret ikke væskestrømmen direkte mod vævet). Substrat-kromogen-affald opsamles i en beholder beregnet til farligt affald med henblik på korrekt bortskaffelse. HÆMATOXYLIN KONTRASTFARVNING (tilvalg) Objektglassene dyppes i et bad bestående af vandig hæmatoxylin (kode S3309). Varigheden af inkubationen afhænger af styrken på den anvendte hæmatoxylin. Der skylles forsigtigt i et bad bestående af destilleret vand. Objektglassene dyppes 10 gange i et bad bestående af 0,037 mol/l ammoniak eller tilsvarende blåfarvningsmiddel. Objektglassene skylles i et bad bestående af destilleret eller deioniseret vand i 2 5 minutter. MONTERING Præparater kan monteres og forsynes med dækglas under anvendelse af et vandigt monteringsmedium såsom Glycergel Mounting Medium (kode C0563) eller Faramount (kode S3025) eller ikke-vandigt permanent monteringsmedium, Ultramount (kode S1964). Bemærk: Objektglassene kan aflæses, når det er belejligt. Der kan dog forekomme en vis falmning, hvis objektglassene udsættes for kraftigt lys over en periode på en uge. For at minimere falmning opbevares objektglassene mørkt og ved stuetemperatur (20 25 C ). Kvalitetskontrol Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer i brugerens laboratorium kan medføre betragtelige forandringer i resultaterne, hvilket kan nødvendiggøre regelmæssig udførelse af internkontroll ud over de her beskrevne procedurer. Se retningslinierne for kvalitetskontrol fra College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry og referencerne 3 til 5 for yderligere information. Se specifikationsarkene for hvert af de anvendte primære antistoffer for detaljer vedrørende følsomhed og immunoreaktivitet. Se Generel vejledning for immunhistokemisk farvning for yderligere information vedrørende positive og negative kontroller. Fortolkning af farvning Begrænsninger Se Generel vejledning for immunhistokemisk farvning for retningslinier for fortolkning. Se Generel vejledning for immunhistokemisk farvning for generelle begrænsninger. Brug af gamle fiksativer eller fiksativer uden buffer eller udsættelse af vævene for overdreven varme (højere end 60 C) under behandlingen, kan medføre nedsat fa rvningsfølsomhed. Endogen peroxidase- eller pseudoperoxidaseaktivitet kan optræde i hæmoproteiner såsom hæmoglobin, myoglobin, cytokrom og katalase såvel som i eosinophiler. 6,7 Denne aktivitet kan hæmmes ved at inkubere præparaterne med peroxidaseblokering i fem minutter, før det primære antistof tilføres. Blod- og knoglemarvsudstrygninger og frosne væv kan også behandles med dette reagens. Men denne procedure fjerner ikke de rødbrune pigmenter i hæmoproteinerne. Alternativt kan man anvende en opløsning af methanolhydrogenperoxid. Visse antigener denaturerer muligvis i denne procedure. Væv fra personer, der er inficeret med hepatitis B-virus og som indeholder hepatitis B overfladeantigen (HBsAG), kan udvise uspecifik farvning med peberrodperoxidase. 8 Normale/ikke-immune sera fra den samme dyrekilde som de sekundære antisera, der anvendes i blokeringstrinene, kan medføre falsk negative eller falsk positive resultater på grund af autoantistoffer eller naturlige antistoffer. Reagenserne i dette kit er optimalt fortyndet. Yderligere fortynding kan føre til tab af antigendetektion. ( ) DK_003 s. 4/6

5 Fejlfinding Problem Sandsynlig årsag Forslag til handling 1. Ingen farvning af 1a. Reagenserne ikke brugt i 1a. Kontrollér anvendelsen af objektglassene rette rækkefølge. reagenser. 2. Svag farvning af alle objektglassene 3. Overdreven baggrundsfarvning af alle objektglassene. 1b. Natriumazid. 2a. Snittene tilbageholder for meget væske efter vaskebad. 2b. Objektglassene ikke inkuberet længe nok. 3a. Præparaterne indeholder høj endogen-peroxidaseaktivitet. 3b. Paraffinen er ikke ordentligt fjernet. 3c. Objektglassene er ikke skyllet ordentligt. 3d. Hurtigere end normal substratreaktion, f.eks. på grund af for høj stuetemperatur. 3e. Snittene tørret under farvningsproceduren. 3f. Uspecifik binding af reagenser til vævssnit. 3g. Antistof for koncentreret. 1b. Brug frisk azid-fri buffer. 2a. Overskydende væske bankes forsigtigt af, før der tørres omkring snittet. 2b. Kontrollér de anbefalede inkubationstider. 3a. Brug længere inkubation for peroxidaseblokeringen. 3b. Brug friske xylen- eller toluenbade. Hvis der farves flere objektglas samtidigt, skal det andet xylenbad bestå af frisk xylen. 3c. Brug friske opløsninger i bufferbade og vaskeflasker. 3d. Brug kortere inkubationstid med substrat-kromogenopløsningen. 3e. Brug et fugtighedskammer. Aftør kun tre til fire objektglas før reagenspåføring. 3f. Påfør en blokeringsopløsning indeholdende et irrelevant protein. 3g. Anvend en større fortynding af det primære antistof. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til nogen af ovennævnte årsager, eller hvis de foreslåede handlinger til fejlretning ikke løser problemet, kontaktes Dako teknisk service for yderligere assistance. Yderligere information om farvningsteknikker og præparatklargøring kan findes i Handbook -Immunochemical Staining Methods 2 (fås hos Dako), Atlas of Immunohistology 9 og Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 10 Referencer 1. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Yderligere referencer Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct ( ) DK_003 s. 5/6

6 Edition 11/12 ( ) DK_003 s. 6/6