Svar til Parvis Alignment øvelsen - Af: Rasmus Wernersson Q1: FASTA format. Q2: # Length: 361 # Identity: 176/361 (48.8%) # Similarity: 214/361 (59.3%) # Gaps: 92/361 (25.5%) # Score: 916.0 SUBS_BACLE 1 0 ELYA_BACHD 1 MRQSLKVMVLSTVALLFMANPAAASEEKKEYLIVVEPEEVSAQSVEESYD 50 SUBS_BACLE 1 AQSVPWGI 8 : : ELYA_BACHD 51 VDVIHEFEEIPVIHAELTKKELKKLKKDPNVKAIEKNAEVTISQTVPWGI 100 SUBS_BACLE 9 SRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQD 58.:... :. :.: ::.. :.... ELYA_BACHD 101 SFINTQQAHNRGIFGNGARVAVLDTGIASHPDLRIAGGASFISSEPSYHD 150 SUBS_BACLE 59 GNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQG 108. :..: :: : ELYA_BACHD 151 NNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSADLYAVKVLDRNGSGSLASVAQG 200 SUBS_BACLE 109 LEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGS 158 :.. :. :.. :...:. : :. : :... ELYA_BACHD 201 IEWAINNNMHIINMSLGSTSGSSTLELAVNRANNAGILLVGAAGNTGRQG 250 SUBS_BACLE 159 ISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTY 208 :: :.........::... :. ELYA_BACHD 251 VNYPARYSGVMAVAAVDQNGQRASFSTYGPEIEISAPGVNVNSTYTGNRY 300 SUBS_BACLE 209 ASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYG 258. :..:. ::...:....: ELYA_BACHD 301 VSLSGTSMATPHVAGVAALVKSRYPSYTNNQIRQRINQTATYLGSPSLYG 350 SUBS_BACLE 259 SGLVNAEAATR 269 : :.. : ELYA_BACHD 351 NGLVHAGRATQ 361 Q3: # Length: 269 # Identity: 176/269 (65.4%) # Similarity: 214/269 (79.6%) # Gaps: 0/269 ( 0.0%) # Score: 916.0
SUBS_BACLE 1 AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFV 50 : :.:... :. :.: ::.. : ELYA_BACHD 93 SQTVPWGISFINTQQAHNRGIFGNGARVAVLDTGIASHPDLRIAGGASFI 142 SUBS_BACLE 51 PGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSG 100..... :..: ELYA_BACHD 143 SSEPSYHDNNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSADLYAVKVLDRNGSG 192 SUBS_BACLE 101 SVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAA 150 :: : :.. :. :.. :...:. : :. ELYA_BACHD 193 SLASVAQGIEWAINNNMHIINMSLGSTSGSSTLELAVNRANNAGILLVGA 242 SUBS_BACLE 151 SGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQ 200 : :...:: :.........::.. ELYA_BACHD 243 AGNTGRQGVNYPARYSGVMAVAAVDQNGQRASFSTYGPEIEISAPGVNVN 292 SUBS_BACLE 201 STYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATS 250. :.. :..:. ::...:... ELYA_BACHD 293 STYTGNRYVSLSGTSMATPHVAGVAALVKSRYPSYTNNQIRQRINQTATY 342 SUBS_BACLE 251 LGSTNLYGSGLVNAEAATR 269.: : :.. : ELYA_BACHD 343 LGSPSLYGNGLVHAGRATQ 361 Da de to sekvenser er af forskellig længde (se også svaret på næste spørgsmål), giver det mest mening at bruge Smith-Waterman algoritmen ("local alignment"), da dette vil give en analyse af forskelle og ligheder for den del af sekvensen der faktisk er sammenlignelig. Bemærk: Ved local alignment skal man være opmærksom på længden af alignment'et. I dette tilfælde er det vigtigt at bemærke forskellen i starten af sekvense Q4: 1) P29600 - sekvensen er afledt af 3D struktur. P41363 - oversat fra DNA + information fra protein-sekventering. 2) SUBCELLULAR LOCATION: "Secreted protein" (for dem begge). 3) Svar: P29600 starter direkte med sekvensen af det mature protein. P41363 starter med et signal-peptid (pos: 1-24), derefter pro-peptid (25-93), og så først derefter kommer det mature protein. Bemærk at både signal-peptid (funktion: signal til eksport af proteinet) og pro-peptidet (funktion: hjælper protein med at folde korrekt) klippes af inden protein er "modent". Forskellen er her at P41363 er (primært) oversat fra DNA og derfor indeholder information fra hele den kodende sekvens, mens P29600 er afledt fra 3D struktur, som indeholder den mature sekvens. Savinase indeholder faktisk både signal- og pro-peptid (kan graves frem i databaserne). Q5:
Taler for: Samme type protease (serin-protease, S8 familie). Thermostabilt (!). Minder meget som Savinase på sekvens-niveau. Mulige problemer: Højt ph optimum - vil evt. kunne optimeres i laboratoriet. Q6: # Length: 1234 # Identity: 73/1234 ( 5.9%) # Similarity: 131/1234 (10.6%) # Gaps: 1005/1234 (81.4%) # Score: 158.5 Q7: # Length: 296 # Identity: 71/296 (24.0%) # Similarity: 129/296 (43.6%) # Gaps: 73/296 (24.7%) # Score: 173.0 SUBS_BACLE 23 GSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAA 72...: :..::.:.. :...... : AAA63263.1 179 GSFGTAEMLNYSVNIYDDGNLLSIVTSGGAHGTHVA-SIAA 218 SUBS_BACLE 73 LNNSIGVL-GVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGL 109... ::.:: :...: :.:.::.:.: AAA63263.1 219 --GHFPEEPERNGVAPGAQILSIKIGDTRLSTMETGTGLIRAMIEVI 263 SUBS_BACLE 110 EWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSAT-SRGVLVVAASGNSG 155 :...:.....:...:.:.:.....::. ::: : AAA63263.1 264 -NHKCDLVNYSYGEATHWPNSGRICEVINEAVWKHNIIYVSSAGNNG 309 SUBS_BACLE 156 --AGSISYP-ARYANAMAVGATDQNN--NRASFSQYGA 188..::.....::.:....: :.::... AAA63263.1 310 PCLSTVGCPGGTTSSVIGVGAYVSPDMMVAEYSLREKLPANQYTWSSRGP 359 SUBS_BACLE 189 GLDIVAPGVNVQSTYPGSTYAS--LNGTSMATPHVAGAAAL 227.... ::.:... : :: :.... AAA63263.1 360 SAD-GALGVSISA--PGGAIASVPNWTLRGTQLMNGTSMSSPNACGGIAL 406 SUBS_BACLE 228 V-KQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLY--GSGLVNAEAA 267 :....::...:.. :...:..::. ::..:. AAA63263.1 407 ILSGLKANNIDYTVHSVRRALENTAVKADNIEVFAQGHGIIQVDKA 452 Q8: Det ses tydeligt at den prokaryote protease kun matcher et enkelt område midt i den humane protease - det er ret nemt at se hvis kan som her først kører gobalt alignment, og derefter lokalt. Til fjern beslægtede sekvenser vil det være best at bruge lokalt alignment, idet man så faktisk får en analyse af den sammenlignelige del af sekvenserne (her kan det dog stadig være værd at bide mærke i, at kun en underdel af sekvenserne er med i alignment'et).
Q9: Global alinment: # Length: 334 # Identity: 22/334 ( 6.6%) # Similarity: 37/334 (11.1%) # Gaps: 258/334 (77.2%) # Score: 26.0 SUBS_BACLE 1 AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFV 50 HBA_PIG 1 0 SUBS_BACLE 51 PGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSG 100 HBA_PIG 1 0 SUBS_BACLE 101 SVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAA 150 HBA_PIG 1 0 SUBS_BACLE 151 SGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYG--AGLDI 192.:.. :..: ::.:. :. HBA_PIG 1 VLSAADKANVKAAWGKVGGQAGAHGAEALER 31 SUBS_BACLE 193 VAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRN 242 :..........:. ::. HBA_PIG 32 MFLGFPTTKTY--FPHF-NLSHGSDQVKA 57 SUBS_BACLE 243 HLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR 269.:...:...:......:.. HBA_PIG 58 HGQKVADALTKAVGHLDDLPGALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLV 107 SUBS_BACLE 270 269 HBA_PIG 108 TLAAHHPDDFNPSVHASLDKFLANVSTVLTSKYR 141 Q10: Local alignment: # Length: 60 # Identity: 17/60 (28.3%) # Similarity: 24/60 (40.0%) # Gaps: 17/60 (28.3%) # Score: 41.0 SUBS_BACLE 39 PDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSA-- 86.. :.. :.........::..... HBA_PIG 44 PHFNLSHGSDQVKAHGQKVADALTKAVGHLDDLPGALS 81 SUBS_BACLE 87 ELYAVKV 93 : :. : HBA_PIG 82 ALSDLHAHKL 91
BEMÆRK: Dette alignment matcher kun en underdel af det match vi have i det globale alignment - det er meget kort. Alignment er _alt_ for kort og alignment score alt for dårligt til at vi vil konkludere at disse to sekvenser er beslægtede (meget mere om signifikans når vi kommer til BLAST). Q11: Når vi sammenligner vores Savinase/Human paptidase alignment (score: 173 - længde: 296) med det "bevidst dårlige" Savinase/Alpha globin alignment (score: 41 - længde: 60) ser det slet ikke så tosset ud længere. Som vi vil se når vi kommer til BLAST handler der her om at holde sin aligment score op mod en reference af scores fra ikke-relaterede sekvenser (i dagens øvlse har vi dog kun et enkelt datapounkt). Q12: Når man slår entry'et op i GenBank kan man se følgende i FEATURE tabellen: /gene="tripeptidyl petidase II" CDS 1..3585 /gene="tripeptidyl petidase II" /codon_start=1 /product="tripeptidyl peptidase II" /protein_id="aaa63263.1" /db_xref="gi:339878" Man kan så her klikke videre på referencen til protein produktet (AAA63263.1). Her kan man så læse følgende: Protein 1..1194 /product="tripeptidyl peptidase II" Region 188..445 /region_name="peptidase_s8" /note="subtilase family; pfam00082" /db_xref="cdd:109150" Altså at proteinet indeholder et Peptidase S8 domæne. Da Savinase er en S8 Peptidase er det en meget kraftigt styrkelse af formodningen om at de to sekvenser er (fjernt) beslægtede). Q13: # 1: SUBS_BACLE # 2: HBA_PIG # Matrix: EBLOSUM62 # Gap_penalty: 1.0 # Extend_penalty: 0.1 # # Length: 304 # Identity: 66/304 (21.7%) # Similarity: 88/304 (28.9%) # Gaps: 198/304 (65.1%)
# Score: 289.5 SUBS_BACLE 1 A-Q-SV--PWGISRV--QAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPD 40 : :. :. : : : HBA_PIG 1 VLSAADKANVKAAWG--KVGGQA-GAH--GA--E-A-LE-- 30 SUBS_BACLE 41 LNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVL--GV 82 : :. HBA_PIG 31 RMFLGF-PTTKTYFPH-FN--LSHG- 51 SUBS_BACLE 83 APSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGL-EWA-GNNGMHVANL-SLGSPSP 129 :.... :. :. HBA_PIG 52 --S-D--QVKAHGQ-KVAD-A--LTK-AVG-HLDDL-P 77 SUBS_BACLE 130 SATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNN 179. : : : :.: HBA_PIG 78 GA-L--SA--L-S-D--L--HAHKL- 91 SUBS_BACLE 180 RASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAA 226 : :. ::.. HBA_PIG 92 RVDP-VNF-KL-LS--HCLLVT-LAA 111 SUBS_BACLE 227 --LVKQKNPSWSNVQIRNH--L-KNTATSLGSTNLYGSGLVNAE 265..:. :. HBA_PIG 112 HHPDDF-NPSV-HASLDKFLANVSTVL--TSKY-- 140 SUBS_BACLE 266 AATR 269 HBA_PIG 141 R 141 Bemærk hvorledes sekvenserne bliver strukket ud hver gang aminosyrerne ikke lige passer. Dette giver naturigvis ingen biologisk mening. Hvis gaps er (næsten) gratis kan ALT align'es. Q14: (IKKE MULIG - Ebi har fjernet PAM100 matricen). Q15: # Length: 302 # Identity: 76/302 (25.2%) # Similarity: 148/302 (49.0%) # Gaps: 74/302 (24.5%) # Score: 346.0 SUBS_BACLE 16 AHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTH 65..... ::.: :..::.:.. :. :...: AAA63263.1 175 AQEYGSFGTAEMLNYSVNIYDDGNLLSIVTSGGAHGTH 212 SUBS_BACLE 66 VAGTIAALNNSIGVL-GVAPSAELYAVKVLG-ASGSGS 101 :.:. ::.:: :.: :. AAA63263.1 213 VA-SIAA--GHFPEEPERNGVAPGAQILSIKI-GDTRLSTMETGTGL 255
SUBS_BACLE 102 VSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPS--P-SATLEQAVNSAT-SRGVLV 147 :.::.:.: :...:.....: :.:.:.:. :...::. AAA63263.1 256 IRAMIEVI-NHKCDLVNYSYGEATHWPNSGRICEVINEAVWKHNIIY 301 SUBS_BACLE 148 VAASGNSG--AGSISYP-ARYANAMAVGA-TDQNNNRASF--SQ 185 ::: :..::.. :..::.:: :.:.:...: : AAA63263.1 302 VSSAGNNGPCLSTVGCPGGTTSSVIGVGAYVSPDMMVAEYSLREKLPANQ 351 SUBS_BACLE 186 Y-GA-GLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHV 221 :....:. :..... : :: :. AAA63263.1 352 YTWSSRGPSADGALGVSISAPGGAIASV-PNWTLRGTQLMNGTSMSSPNA 400 SUBS_BACLE 222 AGAAALV-KQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLY--GSGLVNAE 265. :. :....::..::.. : :...:..::. :::.: AAA63263.1 401 CGGIALILSGLKANNIDYTVHSVRRALENTAVKADNIEVFAQGHGIIQVD 450 SUBS_BACLE 266 AA 267. AAA63263.1 451 KA 452 Alignmentet er blevet længere, score væsnetligt højere og "similarity" er blevet højere.dette skyldes ændringer i matricen (henunder hvilke aminosyrer der tæller som "similar").