INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail

INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 800-4422 05899826001 Indholdsfortegnelse TILSIGTET ANVENDELSE...2 SAMMENDRAG OG REDEGØRELSE...2 PROCEDURENS PRINCIP...2 MATERIALER...3 Leverede reagenser...3 Rekonstitution, blanding, fortynding og titrering...3 Nødvendige materialer og reagenser, som ikke medfølger...3 Opbevaring og håndtering...3 Prøvetagning og forberedelse til analyse...3 ADVARSLER OG FORSIGTIGHEDSREGLER...4 BRUGSANVISNING...4 Fremgangsmåde trin for trin...4 Start af en kørsel på BenchMark Series automated slide stainers...4 Dehydreringsprocedure...4 Metoder til kvalitetskontrol...5 Præparatkontroller...5 Positiv reagenskontrol...5 Uforklarede uoverensstemmelser...5 Verifikation af analyse...5 Fortolkning af resultater...5 Definitioner...5 Yderligere observationer for HER2 og Chr17...5 Visualisering af signal og krav til objektglas...5 Tælling af SISH og Red ISH signalerne for at fastslå HER2-genstatus...6 Kriterier for cellevalg...6 HER2-genstatus: Scoringsalgoritme for HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail...7 Kontroller...8 BEGRÆNSNINGER...8 Generelle begrænsninger...8 Specifikke begrænsninger...8 KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNE...8 FEJLFINDING...9 HENVISNINGER...10 OPHAVSRET...11 KONTAKTINFORMATIONER...11 Bilag A: Fortolkning af resultater, scoringsark...12 2010-08-23 1 / 12 1008041DA Rev B

INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 800-4422 05899826001 TILSIGTET ANVENDELSE INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er beregnet til at detektere HER2- genamplifikation kvantitativt med lysmikroskopi ved hjælp af tofarvet kromogen in situ hybridisering (ISH) i formalinfikserede, paraffinindstøbte vævspræparater fra human brystkræft og gastrisk kræft, inklusive den gastroøsofageale overgang, efter farvning på Ventana automated slide stainers. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er angivet som en hjælp ved vurderingen af patienter, som det overvejes at behandle med Herceptin (trastuzumab). Dette produkt skal fortolkes af en kvalificeret læser sammenholdt med histologisk undersøgelse, relevante kliniske oplysninger og korrekte kontroller. Denne reagens er beregnet til in vitro diagnostisk (IVD) brug. SAMMENDRAG OG REDEGØRELSE HER2/neu (HER2) er medlem af familien af fire transmembrane receptor tyrosin-kinaser, som fremmer cellers vækst, differentiering og overlevelse. 1,2 HER2-genet afkoder HER2- proteinet, 2,3, og overudtrykkelse af HER2-proteinet, amplifikation af HER2-genet eller begge forekommer i ca. 15 til 25 procent af brystkræft og er associeret med aggressiv udvikling af tumor. 4,5 INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail indeholder en HER2 probe (mærket med hapten dinitrophenyl eller DNP) og en kromosom 17 probe (mærket med hapten digoxigenin eller DIG) formuleret med humant placentablokerings-dna i en formamidbaseret buffer. Proberne er beregnet til at detektere amplifikation af HER2-genet i bryst- og gastrisk karcinom. HER2 DNA Probe dækker ca. 200.000 basepar langs genregionen, der indeholder HER2-genet (også kendt som ERBB2 og NEU), som er placeret det humane kromosom 17 (17q11.2-q2) (1). Kromosom 17-proben dækker alfasatellitsekvenser inden for den centromere region og anvendes som reference for aneusomi. Kopiantal af begge prober optælles i tumorkerner, resultaterne rapporteres som et forhold mellem HER2/kromosom 17 for at fastlægge HER2-amplifikationsstatus (forhold HER2/Chr17 2,0 er forstærket, mens et forhold <2,0 er ikke-forstærket). I mange kliniske undersøgelser har amplifikation og/eller overudtrykkelse af HER2 vist sig at være associeret med et dårligt klinisk resultat for kvinder med invasiv brystkræft og korreleret med flere negative prognostiske variabler, inklusiv negativ status for østrogenreceptor (ER), høj S-fase fraktion, positiv nodal status, muteret p53 og højt udviklingsstadium af kernen. 6,7 I flere undersøgelser har patienter med invasiv brystkræft (både med og uden knuder) med en forstærket HER2-genstatus udvist generelt nedsat overlevelse og en højere frekvens af nye anfald. 1,8,9,10,11 Resultater af kliniske undersøgelser, der målte HER2-proteinets overudtrykkelse med immunhistokemi, svarede til resultaterne, der blev opnået ved HER2-genamplifikation. 9,11,12,13 Viden om HER2- genet og/eller proteinstatus i invasiv brystkræft gør det muligt for læger at tage mere velinformerede beslutninger for at forbedre den generelle behandling af disse patienter. Trastuzumab (Herceptin) er et humaniseret monoklonalt antistof mod det ekstracellulære domæne for HER2 og er blevet påvist at være til fordel for patienter med HER2-positiv brystkræft. 14 19 Påvisning af HER2-genamplifikation og/eller proteinoverudtrykkelse er væsentlig i forbindelse med valg af patienter til behandling med trastuzumab. Kliniske undersøgelser har vist, at patienter med brystkræft med høj overudtrykkelse af HER2- protein og/eller genamplifikation drager mest fordel af trastuzumab. 20 Påvisning af HER2- genamplifikation og/eller overudtrykkelse af protein er nødvendig for patienter med invasiv brystkræft, som det overvejes at behandle med trastuzumab, og når det er klinisk indikeret. En procentdel af gastriske patienter udviser HER2-genamplifikation og kan have fordel af behandling med Herceptin. 27 Farvningsprotokollen, der anbefales i INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysen, retningslinjerne for fejlfinding og scoringsalgoritmen gælder både for bryst- og gastriske karcinompræparater. PROCEDURENS PRINCIP INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er optimalt formuleret til brug med Ventana ultraview SISH DNP Detection Kit, Ventana ultraview Red ISH DIG Detection Kit og ekstra reagenser på Ventana automated slide stainers. Under den dobbelt in situ hybridisering (Dual ISH) farvningsproces-, co-hybridiseres DNP- og DIG-mærkede prober i forhold til deres respektive specifikke mål-dna-sekvenser i cellekernerne. Detektion af den DNP-mærkede HER2-probe forekommer først ved hjælp af ultraview SISH DNP Detection Kit, som indeholder følgende dispensere: En Rabbit anti-dnp Monoclonal Antibody, Multimer-opløsning, som indeholder et sekundært gede-anti-kanin-antistof, der er konjugeret til peberrods-peroxydase (HRP), Silver ISH DNP Chromogen A (Silver A), Silver ISH DNP Chromogen B (Silver B) og Silver ISH DNP Chromogen C (Silver C). Efter inkubation med primært Rabbit anti-dnp Antibody og derefter sekundært gede-anti-kanin- HRP-antistof-konjugat forekommer SISH-reaktionen. Kort beskrevet drives denne reaktion af sekventiel tilsætning af Silver A (sølvacetat), Silver B (hydroquinon) og Silver C (H2O2). Her er sølvionerne (Ag+) reduceret til metalliske sølvatomer (Ag 0 ) af hydroquinon. Denne reaktion får næring fra substratet for HRP, hydrogenperoxid (sølv C). Sølvudfældningen aflejres i kernerne og en enkelt kopi af HER2-genet visualiseres som et sort signal. Figur 1 illustrerer SISH reaktionen. Efter SISH-detektion for HER2 detekteres den DIG-mærkede kromosom 17-probe med ultraview Red ISH DIG Detection Kit. Dette sæt omfatter følgende dispensere: Et monoklonalt muse-anti-dig-antistof, Red ISH Multimer-opløsning, som indeholder et gede-anti-muse-igg-antistof, der er konjugeret til Alkaline Phosphatase (AP), phforstærker, Naphthol og Fast Red. Efter udvikling af SISH-signalet inkuberes objektglasset med muse-anti-dig-antistoffet, som binder DIG-hapten på kromosom 17-proben. Det primære antihapten-antistof detekteres med Multimer-opløsning (gede-anti-muse-igg konjugeret til AP-enzym). Objektglasset inkuberes med ph-forstærkeropløsningen, som tilfører de rigtige saltkomponenter/-koncentrationer og bufferet ph for optimal APenzymfunktion. Derefter tilsættes naphtholfosfat, som anvendes som substratet for APenzymet (AP defosforyleret naphthol). Fast Red, der derefter tilsættes til objektglasset, kombineres med det defosforylerede naphthol, så det danner en rød udfældning, som nemt visualiseres ved lysmikroskopi. Figur 2 illustrerer Red ISH reaktionen. Præparatet kontrastfarves derefter med Hematoxylin II til fortolkning med lysmikroskopi. Rabbit anti-dnp Antibody 17q11.2-q2 Black Signal Silver A Silver B Silver C 2010-08-23 2 / 12 1008041DA Rev B DNP HRP Goat anti-rabbit Antibody Figur 1. SISH Reaction for HER2 Detection HER2 DNA Probe (DNP-labeled)

Figur 2. Red ISH Reaction for Chromosome 17 Detection Hvert trin i den automatiske farvningsprotokol omfatter inkubation af objektglasset med den påkrævede specifikke reagens på et bestemt tidspunkt og med en bestemt temperatur. Ved afslutningen af hvert inkubationstrin skylles snittene af Ventana automated slide stainer for at standse reaktionen og fjerne ubundet materiale. For at minimere fordampningen af vandholdige reagenser fra objektglasset, tilsættes der på hvert trin en coverslip-opløsning af slide stainer. Se brugervejledningen for den passende Ventana automated slide stainer for mere detaljeret information om betjening af instrumentet. MATERIALER Leverede reagenser Red Signal Goat anti-mouse Antibody Chromosome 17 Centromere Region DIG INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail dispenser indeholder tilstrækkelig reagens til 50 prøver. 1 10 ml dispenser af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail indeholder ca. 12 μg/ml af HER2-proben, der er mærket med dinitrophenyl (DNP), og 1 μg/ml af kromosom 17-proben, der er mærket med digoxigenin (DIG), der er formuleret med humant placentablokerings-dna i en formamidbaseret hybridiseringsbuffer. Begge prober bruges til at fastlægge HER2-genstatus (dvs. forhold for HER2/kromosom 17). Rekonstitution, blanding, fortynding og titrering Chr17 DNA Probe (DIG-labeled) Der er ikke behov for rekonstitution, blanding, fortynding eller titrering. Yderligere fortynding kan resultere i tab af farvningssensitivitet. Brugeren skal validere alle ændringer af denne art. Nødvendige materialer og reagenser, som ikke medfølger Følgende reagenser og materialer, der er påkrævet til farvning, medfølger ikke: 1. Ventana ultraview SISH DNP Detection Kit [REF 800-098] 2. Ventana ultraview Red ISH DIG Detection Kit [REF 800-505] 3. Ventana HybReady Solution [REF 780-4409] 4. Ventana ultraview Silver Wash II [REF 780-003 eller tilsvarende] 5. Ventana ISH Protease 2 [REF 780-4148]* 6. Ventana ISH Protease 3 [REF 780-4149]* 7. Ventana Hematoxylin II kontrastfarvestof [REF 790-2208]* 8. Ventana Bluing Reagent [REF 760-2037]* 9. Ventana Reaction Buffer (10X) [REF 950-300] 10. Ventana SSC (10X) [REF 950-110] 11. Ventana EZ Prep Reagent (10X) [REF 950-102] 12. Ventana Cell Conditioning 2 (Pre-dilute) [REF 950-123] AP ph Enhancer Naphthol Fast Red Mouse anti-dig Antibody 13. Ventana ULTRA CC2 (Pre-dilute) [REF 950-223] 14. Ventana Liquid Coverslip (High Temperature) Reagent [REF 650-010] 15. Ventana ULTRA LCS (Pre-dilute) [REF 650-210] 16. Ventana BenchMark Series automated slide stainer 17. Stregkodeetiketter 18. Superfrost Plus objektglas (VWR REF 48311-703 eller tilsvarende) 19. Xylen (til histologisk brug) 20. Deioniseret eller destilleret vand 21. Permanent monteringsmateriale (Permount Fisher kat.nr. SP15-500 eller tilsvarende)** 22. Dækglas (tilstrækkelig til at dække væv som f.eks. VWR kat.nr. 48393-60 eller tilsvarende) 23. Automatiske dækglas (som f.eks. Tissue-Tek SCA automatiske dækglas) 24. Farvningsglas eller -bade 25. Stopur 26. Lysmikroskop 27. Ventana HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides [REF 783-4422] kan efter behov bruges til fejlfindingsaktiviteter. * Kræves til bestemte applikationer. **Se tabel 9 for monteringsmaterialer, der er kompatible med denne analyse. Opbevaring og håndtering Opbevares ved 2 8 C. Må ikke fryses. For at sikre korrekt reagenstilførsel og reagensens stabilitet skal alle dispenserkapsler sættes på igen efter hver kørsel, og dispenseren skal med det samme stilles i køleskabet i oprejst position. Alle dispensere er mærket med udløbsdato. Ved korrekt opbevaring er reagenset stabilt indtil den dato, der er angivet på etiketten. Brug ikke reagensen efter udløbsdatoen for den foreskrevne opbevaringsmetode. Prøvetagning og forberedelse til analyse Rutinemæssigt behandlede, formalinfikserede og paraffinindstøbte væv er egnede til brug med denne reagens. Hvert snit skal skæres til den passende tykkelse (ca. 4 μm) og placeres på et Superfrost Plus objektglas. Den anbefalede vævsfiksativ er 10 % neutral bufferformalin. 21 Ventana har fastslået, at præparater, der er fikseret i zinkformalin eller alkoholisk formalin, også er egnede præparattyper. Præparater, der er fikseret i Prefer, udviser også enkelt kopidetektion med denne analyse, men vævsmorfologien kan blive påvirket. Det frarådes, at væv, der er fikseret med AFA eller Bouin s fiksativ, anvendes med denne analyse. Præparater, der er fikseret >6 timer med AFA eller Bouin s fiksativer, medfører svag eller fraværende farvning. 22 Ud over Ventana analyser har nyere undersøgelser påvist, at størstedelen af inkonklusive HER2-genresultater fra FISH er relateret til præanalytiske faktorer inklusive under- og overfiksering 23 og forsinket fiksering. 24 Nøje implementering af fikseringsprocedurer (f.eks. en dedikeret processor til at sikre et minimum på 6 timers fiksering) medførte en 64 % reduktion i inkonklusive tilfælde fra 10,8 % fejl til 3,4 %. Præparater, der er fikseret <6 timer i formalin, kan medføre signaltab og overdigestion af kerner. Det ses som bleg/svag hæmatoxylinfarvning. Snit, der er tykkere end 4 μm, kan kræve kraftigere proteasebehandling end den anbefalede tilstand og kan udvise flere kernebobler end tyndere snit på grund af overskydende paraffin i vævet. Kernebobler forekommer som store eller små bobler eller septum i kernerne. Ofte når der forekommer kernebobler, er der en række påvirkninger af SISH og Red ISH signalerne, der er karakteriseret ved 1) kerner med kernebobler, hvor SISH og Red ISH signalerne generelt stadig er lokaliseret i kernen, og 2) kerner med kernebobler, som skubber SISH og Red ISH signalerne til periferien. I begge tilfælde kan tilfældet ofte scores, hvis SISH og Red ISH signalerne kan skelnes klart, ikke er forvrængede på anden måde og stadig kan tælles. Men af og til kan alvorlige kernebobler forvrænge SISH og Red ISH signalerne eller medføre, at de ikke kan skelnes, så præcis tælling ikke er mulig. Dette forekommer hyppigere, hvis SISH og Red ISH signalerne skubbes til kernens periferi. Hvis dette forekommer, kan man ofte finde kerner andre steder i prøven, som kan tælles, og tilfældet kan scores. Hvis kerneboblerne er så alvorlige, at man ikke kan finde tilstrækkelige kerner, hvor SISH og Red ISH signalerne kan tælles sikkert, bør tilfældet ikke scores. Disse præparater skal evt. afparaffineres i alkohol- og xylenbade, før farvningen gentages på instrumentet, eller brugeren kan vælge den udvidede afparaffinering i farvningsproceduren (se Fejlfinding). Kernebobler kan også forekomme i forbindelse med underfiksering (1 3 timer med formalin), hvilket er mindre diskrete kernebobler. Det kan afhjælpes med 3 timers fiksering med ændret 2010-08-23 3 / 12 1008041DA Rev B

celleforbehandling/proteasebehandling, men med 1 time kan det sandsynligvis ikke afhjælpes. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysen blev udviklet med ekstra muligheder for forbehandling, som kan hjælpe til at optimere analysen i forskellige laboratorier og til efterfølgende fejlfinding ved bestemt væv/objektglas, der udviser suboptimal farvning. Ventana anbefaler, at hvert laboratorium udfører indledende kørsler på repræsentative biopsikontrolprøver, som er blevet forberedt under forhold, der er identiske med de kliniske prøver, der skal testes. Det hjælper til at optimere de specifikke farvningsforhold for individuelle laboratorier, som kan variere med hensyn til deres præcise procedurer til forberedelse af præparater. Med andre præanalytiske faktorer end de anbefalede kan der forekomme varierende resultater. Præparater, som er forberedt præanalytisk med forhold, som ikke er anbefalet af Ventana, farver evt. aldrig korrekt med denne analyse. ADVARSLER OG FORSIGTIGHEDSREGLER 1. Til in vitro diagnostisk (IVD) brug. 2. Tøm affaldsbeholderen, før der startes en kørsel på instrumentet. Hvis denne forsigtighedsregel ikke følges, kan affaldsbeholderen løbe over, og brugeren risikerer at glide og falde. På BenchMark XT instrumentet starter en kørsel ikke, medmindre affaldsbeholderen er tømt, før der startes en kørsel. 3. Advarsel, produktet indeholder formamid. Formamid er toksisk ved indånding og moderat toksisk ved indtagelse. Det er irriterende ved kontakt med hud, øjne og slimhinder og absorberes gennem huden. Det kan forårsage fosterskader. Tag forholdsregler ved håndtering af reagenser. Brug engangshandsker, og brug egnet beskyttelsesdragt ved håndtering af toksiske materialer eller stoffer, der er mistænkt for at være kræftfremkaldende. 4. Hvis reagenser kommer i berøring med følsomme områder, bør der skylles med rigelige mængder vand. Undgå at indånde reagenser. 5. Materialer med human eller animalsk oprindelse skal håndteres som potentielt biologisk risikomateriale og bortskaffes i henhold til relevante forsigtighedsforanstaltninger. 6. Undgå mikrobiel forurening af reagenser, da det kan forårsage ukorrekte resultater. 7. Konsulter lokale eller statslige myndigheder angående anbefalede metoder til bortskaffelse. BRUGSANVISNING Fremgangsmåde trin for trin Denne reagens er udviklet til brug på en Ventana automated slide stainer sammen med Ventana detektionskits og ekstra reagenser. Parametrene for de automatiserede procedurer kan vises, udskrives og redigeres ifølge den fremgangsmåde, der er beskrevet i brugervejledningen. Andre betjeningsparametre for automated slide stainers er forudindstillet fra fabrikken. Den anbefalede farvningsprotokol for hver instrumentplatform er anført i tabel 1. Tabel 1. Anbefalet protokol for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail på Ventana BenchMark Series automated slide stainers. Valgbart proceduretrin Anbefalet farvningsprotokol for BenchMark og BenchMark XT Anbefalet farvningsprotokol for BenchMark ULTRA Opvarmningstempera tur Vælg 63 ºC Opvarmningstid 20 min Afparaffinering Valgt Vælg 72 ºC Udvidet afpar* Ikke valgt Ikke valgt Celleforbehandling ISH-Protease 3 Valgt Celleforbehandling CC2 Mild CC2-8 min Standard CC2-12 min Udvidet CC2-8 min 16 min (væv) 8 min (xenografter) Valgt Celleforbehandling CC2 86 ºC Mild CC2-8 min Standard CC2-12 min Udvidet CC2-8 min 16 min (væv) 8 min (xenografter) Denaturering 20 min 20 min Hybridisering 6 timer 6 timer Stringensafskylning 72 C (humant væv) 76 C (xenografter) 72 C (humant væv) 76 C (xenografter) SISH Multimer 16 min 32 min Silver Kromogen 4 min 4 min Red ISH Multimer 24 min 24 min Red Kromogen 8 min 8 min Kontrastfarvestof Hematoxylin II - 8 min Hematoxylin II - 8 min Postkontrastfarvestof Bluing Reagent - 4 min Bluing Reagent - 4 min * Den udvidede afparaffineringsmulighed er beregnet til at mindske alvorlige kernebobler på grund af overskydende paraffin. Start af en kørsel på BenchMark Series automated slide stainers 1. Sæt en stregkodeetiket, der svarer til den protokol, der skal udføres, på objektglasset. 2. Læg INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, reagenser fra ultraview Red ISH DIG og ultraview SISH DNP Detection Kits og påkrævede ekstra reagenser i reagensbakken/-bakkerne. Placér reagensbakken/bakkerne på automated slide stainer. Kontrollér partivæsker og affald. 3. Partiflaskerne med reaktionsbuffer skal være fulde. 4. Affaldsbeholderen skal være tom, før kørslen startes. 5. Læg objektglassene på automated slide stainer. 6. Start farvningskørslen. 7. Fjern objektglassene fra automated slide stainer, når kørslen er slut. 8. Fortsæt med dehydreringsproceduren. Dehydreringsprocedure Bemærk: Fast Red kromogen kan opløses i alkohol og acetone. Brug ikke alkohol- og acetonebade til at dehydrere objektglas, da det røde signal påvirkes. 1. Fjern Liquid Coverslip solution ved at vaske objektglassene 2 gange efter hinanden i en mild opvaskemiddelopløsning (brug ikke opvaskemiddel, der er beregnet til maskinopvask). 2. Skyl objektglassene grundigt med destilleret vand i ca. 1 minut. Ryst overskydende vand af. 3. Placér objektglassene i en ovn (45 60 C), og lad dem tørre eller lufttørre ved omgivelsestemperatur. I en ovn varer tørretiden fra 10 minutter til en time. Sørg for, at objektglas er helt tørre, før dækglas placeres. 4. Overfør objektglassene til et xylenbad i ca. 30 sekunder. 2010-08-23 4 / 12 1008041DA Rev B

5. Placér dækglasset på objektglasset. Bemærk, at nogle monteringsmaterialer ikke er kompatible med analysen (se afsnittene Begrænsninger og Fejlfinding). Metoder til kvalitetskontrol Præparatkontroller HER2- og kromosom 17-sekvenser findes i alle celler i menneskets krop. Derfor fungerer de som interne positive kontroller i hvert vævspræparat og skal kunne ses (1 til 2 signaler pr. celle) i normale (ikke-neoplastiske) celler i og omkring målkarcinomets område. Men på grund af biologisk heterogenitet og afskæring fra vævssnit udviser ikke alle celler en enkelt genkopi. Specifik kernefarvning kan lokaliseres i flere celler inklusive: stromale fibroblaster, endotelceller, lymfocytter og andre ikke-neoplastiske celler. Hvis de positive kontrolceller ikke fremviser positiv farvning, skal objektglasset anses for at være inadækvat til tælling og skal gentages (se afsnittet Fejlfinding). Fordi hver normal celle indeholder to kopier af HER2-genet, er der ikke nogen sand negativ præparatkontrol. En laboratoriespecifik positiv præparatkontrol kan efter ønske køres med hver udført farvningsprocedure. Kontrolpræparater kan være præparater, der er forberedt på en måde, der er identisk med patientpræparater. Disse kontroller er nyttige til at overvåge alle trin i proceduren fra forberedelse af præparater til farvning. HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides bruges til foreløbig validering og fejlfindingsaktiviteter, der er associeret med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. De indeholder tre distinkte xenograftsnit, som er formalinfikserede og indstøbte i en enkelt paraffinblok. Xenograft-snittene er blevet valgt, fordi de er velkarakteriserede i den videnskabelige litteratur for HER2-proteinniveauer og antal genkopier. Positiv reagenskontrol En positiv reagenskontrol kan køres under verifikation af analyse og fejlfindingsaktiviteter, da DNA-tilgængelighed kan variere med præanalytiske behandlingsforhold. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail kan bruges som en positiv kontrol for denne analyse, da hver normal celle i menneskets krop indeholder en til to kopier af HER2 og kromosom 17. En negativ reagenskontrol er ikke nødvendig, fordi interne positive kontroller er tilstrækkelige. Uforklarede uoverensstemmelser Uforklarede uoverensstemmelser i kontrolresultaterne skal omgående videresendes til den lokale support-repræsentant. Verifikation af analyse Før en reagens bruges første gang i en diagnostisk procedure, skal reagensens funktion verificeres ved at teste den på en række præparater med kendte karakteristika for ISHydeevne som f.eks. Ventana HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides (se metoder til kvalitetskontrol, der er skitseret tidligere i dette afsnit i indlægssedlen for produktet). Disse metoder til kvalitetskontrol skal gentages for hvert nyt lot reagenser, eller når der er en ændring i analyseparametrene. Fortolkning af resultater En kvalificeret læser, der har erfaring med mikroskopisk fortolkning af bryst- eller gastriske karcinompræparater, ISH-procedurer og påvisning af enkelte og forstærkede HER2-kopier (som kan kræve mikroskopisk undersøgelse med objektiver på op til 40X til 60X), skal evaluere kontrolkerner, før resultaterne fortolkes. HER2-genstatus skal kun tælles i det invasive karcinom. In situ karcinom (duktal og lobulær) i brystpræparater skal ikke tælles. Læseren skal referere til det afstemte H&E objektglas for at fastslå passende målområder, der om nødvendigt skal tælles på det Dual ISH-farvede objektglas. Definitioner 1. HER2-genstatus. HER2-genstatus er en funktion for forholdet mellem det gennemsnitlige antal kopier af HER2-genet og det gennemsnitlige antal kopier af kromosom 17 (Chr17) pr. celle i et invasivt bryst- eller gastrisk karcinom. HER2- genstatus klassificeres ved hjælp af følgende retningslinjer: HER2/kromosom 17-forhold 2,0 er forstærket HER2/kromosom 17-forhold <2,0 er ikke forstærket. 2. Krav til objektglas. Et individuelt objektglas, der er farvet med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail skal opfylde to kriterier for at anses for egnet til tælling. Hvis objektglasset ikke opfylder disse kriterier, er det ikke egnet til tælling. a. Intern positiv kontrol. Normale HER2 (SISH) og Chr17 (Red ISH) signaler (1 til 2 kopier pr. celle) fungerer som interne positive kontroller og skal være synlige i prøven. Denne kernefarvning kan lokaliseres i flere ikke-neoplastiske celler inklusive: stromale fibroblaster, endotelceller, lymfocytter og andre ikkeneoplastiske celler. Ikke alle celler på objektglasset farves for begge prober, men normale celler i og/eller omkring målet skal være farvet korrekt. b. Karcinomceller. Ved hjælp af 20X, 40X eller 60x objektiver skal karcinommålområdet udvise et tælleligt felt med SISH og Red ISH signaler. 3. Målområder for signaltælling. Et acceptabelt målområde inden for karcinomet udviser et tælleligt felt med SISH og Red ISH signaler. Signaler skal ikke tælles i områder, som indeholder svage SISH og/eller Red ISH signaler, komprimerede eller overlappende kerner eller nekrose. Kerner med overdreven SISH eller Red ISH baggrund, som interfererer med muligheder for at tælle specifikke signaler, skal ikke tælles. Yderligere observationer for HER2 og Chr17 Andre observationer vedrørende HER2 SISH og/eller Red ISH Chr17 farvning kan noteres som kommentarer på patologens rapport. 1. Heterogenitet: I nogle tilfælde kan vævet indeholde områder af karcinom, som er genetisk heterogene for antallet af HER2-kopier (dvs. der kan være en blanding af uforstærkede og forstærkede kerner eller en blanding af kerner, der indeholder forskellige kopier af HER2). Dette kan iagttages blandt karcinomceller inden for selve målområdet eller mellem to forskellige målområder. 2. Aneusomi er enhver tilstand, hvor en organisme har flere eller færre specifikke kromosomer end normalt, dvs. antallet af et bestemt kromosom (i dette tilfælde kromosom 17) er ikke diploidt. I polysomi kan der være tre eller flere kopier af kromosomet i stedet for de forventede to kopier. I monosomi udviser tumorcellerne kun en kopi af kromosom 17. Der er rapporteret tilsyneladende amplifikation, klynger eller polysomi af kromosom 17 (med eller uden HER2 SISH klynger). 25 I tilfælde med klynger af HER2 og Chr17 skal man være forsigtig med ikke at betragte dem med et forhold på ~1,0. Læseren skal referere til IHC for analyser af overudtrykkelse af HER2-protein i disse tilfælde, da størstedelen har tendens til at være 3+. 3. Monoallel sletning: Sletningen af HER2-genet fra kromosom 17 i tumorcellerne medfører et HER2/Chr17 forhold <1,0. Visualisering af signal og krav til objektglas SISH og Red ISH signaler visualiseres som: 1. Enkelt kopi. Et diskret sort (SISH) eller rødt signal (Red ISH) tælles som en enkelt kopi af henholdsvis HER2 eller Chr17. For SISH (sort) repræsenterer diskrete enkelte signaler, der visualiseres i de interne, fysiologiske, positive (ikkeneoplastisk) kontrolkerner på det samme objektglas, størrelsen på en enkelt kopi i invasive karcinomceller. For Red ISH, tælles hvert diskret signal som en kopi. Det skal bemærkes, at Red ISH signalet fra kromosom 17-DIG-proben kan synes større end SISH-signalerne, nogle gange forlænget i formen, og kan variere i størrelsen inden for et målområde og på tværs af prøver. SISH signaler kan synes betydeligt mindre end Red ISH signaler. Men der kræves ikke en minimumsignalstørrelse, og alle diskrete signaler skal tælles. Der kan forekomme rød tåge, som ikke må forveksles med et signal. Røde signaler, som er meget lyse i farven sammenlignet med signalet i interne positive kontrolkerner, og generelle farvningsmønstre skal ikke tælles, da de kan være uspecifikke. 2. Flere kopier. Diskrete enkelte SISH signaler, der visualiseres i de interne positive kontrolkerner, repræsenterer størrelsen på en enkelt kopi af HER2 i invasive karcinomceller. Størrelsen på de enkelte SISH signaler bruges som reference til at fastlægge det relative antal forstærkede kopier i kræftkernerne. For Red ISH tælles hvert diskret signal som en kopi. 3. Klynger. En klynge er defineret som talrige overlappende SISH signaler i kerner, som ikke kan skelnes individuelt. Klynger af HER2 kan kun vurderes af læseren. For eksempel kan en stor klynge af flere SISH signaler vurderes som 12 kopier, mens mindre klynger kan vurderes som 6 kopier. Vurderingen foretages ved hjælp af den enkelte SISH kopier, der findes i den interne positive kontrolceller, som reference. Tilstedeværelsen af HER2-klynger noteres på scoringsarket. 4. Overlappende kerner, kerner med kun én farve og præparater med uspecifik farvning skal ikke tælles. Alle kerner med overlappende Red ISH og SISH signaler, som ikke kan skelnes, skal visualiseres ved kraftigere forstørrelser for at skelne de to signaler eller ikke tælles. Kerner, som synes at have så mange bobler, at fortolkningen er uklar, skal ikke tælles. 2010-08-23 5 / 12 1008041DA Rev B

Tælling af SISH og Red ISH signalerne for at fastslå HER2-genstatus Før HER2- og kromosom 17-signalerne tælles for at fastslå HER2-genstatus, er det vigtigt at fastslå, om det invasive målområde (det læderede væv) er farvet korrekt og opfylder kriterierne, der er beskrevet for krav til objektglas (se afsnittet Definitioner ovenfor, 2. Krav til objektglas). Ventana har udviklet en scoringsalgoritme for analysen, som maksimerer præcision og effektivitet ved tælling. Tyve kerner, der hver indeholder røde (Red ISH) og sorte (SISH) signaler, skal tælles. De afsluttende resultater for HER2-status rapporteres på grundlag af forholdet, der dannes ved at dele summen af HER2-signaler for alle 20 kerner delt med summen af kromosom 17-signaler for alle 20 kerner. Amplifikationsstatus defineres som forstærket, hvis HER2/Chr17 forholdet 2,0, og som ikke-forstærket, hvis HER2/Chr17 forholdet <2,0. Hvis HER2/Chr17 forholdet falder til mellem 1,8 til 2,2 (inklusiv), skal der tælles 20 kerner ekstra. Et nyt forhold skal derefter dannes på grundlag af alle 40 kerner og amplifikationsstatus rapporteres som allerede beskrevet. Kriterier for cellevalg Tæl kun kerner med diametre, som er repræsentative for den gennemsnitlige population af invasive karcinomkerne i målområdet. Tæl ikke signaler i kerner, som er: 1. Meget større i diameter end den gennemsnitlige størrelse for karcinomkerner 2. Meget mindre i diameter end den gennemsnitlige størrelse for karcinomkerner I målområder, som er genetisk heterogene for antal HER2-kopier, skal der kun tælles kerner, som er repræsentative for populationen af invasive karcinomkerner med det højeste gennemsnitlige antal signaler. Bemærk, at der findes heterogenitet på scoringsarket. Tæl ikke, hvis kerner overlapper. Tæl ikke, hvis der ikke findes et signal. Tæl ikke, hvis der kun findes et signal med én farve. Tæl ikke, hvis signalerne er uden for kernerne. Tæl som 1 sort (HER2) og 1 rød (Chr17) signal. Tæl som 2 sorte (HER2) og 2 røde (Chr17) signaler. Små SISH klynger kan kun vurderes ved hjælp af størrelsen på et enkelt punkt som reference, brug stromale celler til at vurdere signalstørrelse (mindre celle til venstre). For eksempel kan denne klynge vurderes som 6 SISH signaler - ved at tilføje de andre 2 enkelte signaler fås en samlet tælling på 8. Tæl som 2 røde signaler. Notér på scoringsarket, at der findes klynger for HER2. Vurdér den store klynge. Her kan klyngen vurderes som 12 sorte signaler - ved at tilføje de andre 4 enkelte signaler fås en samlet tælling på 16. Tæl de røde signaler som 2 kopier af kromosom 17. Notér på scoringsarket, at der findes klynger for HER2. Et rødt signal tæt på et sort signal skal tælles som et rødt signal og et sort signal. Det kan kræve en tælling med 60x objektiv for at skelne. Tæl derfor som 4 sorte signaler og 2 røde signaler. Hvis der ikke kan skelnes mellem overlappende signaler, skal denne kerne ikke tælles. Klynger af sorte signaler tilslører de(t) røde signal(er). Kraftigere forstørrelse (60x) kan anvendes for at prøve at bekræfte tilstedeværelsen eller fraværet af de(t) røde signal(er). Tæl i modsat fald ikke: Tæl altid kerner med klare røde signaler. Notér tilstedeværelsen af SISH-klynger på scoringsarket. Kerner med synlige og højere antal røde signaler skal scores i kerner med SISH klynger. Hvis der forekommer SISH- støv i baggrunden i kernerne, skal der kun tælles, hvis specifikke SISH signaler kan skelnes klart fra baggrunden. Tæl som 1 sort (HER2) og 2 røde (Chr17) signaler. Det sorte signal er en dublet. Tæl kun to signaler med samme farve ved siden af hinanden, hvis afstanden mellem signalerne er lig med eller større end diameteren for et enkelt signal. Der kan evt. observeres rød tåge, som ikke må forveksles med et signal. Et rødt signal kan variere i intensitet, men er altid diskret. Billedet viser 2 diskrete røde (Chr17) signaler og 2 sorte (HER2) signaler. Tabel 2. Visualisering af signal for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. 2010-08-23 6 / 12 1008041DA Rev B

HER2-genstatus: Scoringsalgoritme for HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Tyve kerner (der hver indeholder røde (Chr17) og sorte (HER2) signaler, skal tælles. De afsluttende resultater for HER2-status rapporteres på grundlag af forholdet, der dannes ved at dele summen af HER2-signaler for alle 20 kerner delt med summen af kromosom 17-signaler for alle 20 kerner. Amplifikationsstatus defineres som forstærket, hvis HER2/kromosom 17 forholdet 2,0, og som ikke-forstærket, hvis HER2/kromosom 17 forholdet <2,0. Hvis HER2/Chr17 forholdet falder til mellem 1,8 til 2,2, skal der tælles 20 kerner ekstra. Et nyt forhold skal derefter dannes på grundlag af alle 40 kerner og amplifikationsstatus rapporteres som allerede beskrevet. Start HER2/Chr17 farvet objektglas Objektglas passende? Ja Identificér og vælg målområde Nej Ikke passende Tæl HER2- og kromosom 17-signaler i 20 kerner Beregn HER2/Chr17 forhold ved at dele det samlede antal HER2-signaler fra målområde 1 med det samlede antal Chr17-signaler fra målområde 1 Er 1,8 HER2/Chr17 2,2? Ja Tæl 20 ekstra kerner Nej Beregn HER2/Chr17 forhold ved at dele det samlede antal HER2- signaler fra målområderne 1 og 2 med det samlede antal Chr17- signaler fra målområderne 1 og 2 Rapportér resultater Ikke-forstærket HER2/Chr17 < 2,0 Forstærket HER2/Chr17 2,0 2010-08-23 7 / 12 1008041DA Rev B

Kontroller Tilstedeværelsen af sølvfarvet og rød udfældning inden for normale cellekerner angiver positiv reaktion. Normale cellekerner skal indeholde et gennemsnit på 1 2 diskrete SISH og Red ISH signaler, der angiver, at HER2 DNA og centromere kromosom 17-prober har hybridiseret til både genet og dets kromosom. Hvis der ikke detekteres en enkelt genkopi i normale celler, angiver det, at objektglassene ikke er egnede, og resultaterne skal anses for ugyldige. Patientens morfologiske fund og relevante kliniske data skal fortolkes af en kvalificeret patolog. BEGRÆNSNINGER Generelle begrænsninger 1. ISH er en metode i flere trin, som kræver specialiseret træning i udvælgelsen af egnede reagenser, forberedelse af præparater, behandling, forberedelse af ISHobjektglas og fortolkning af resultaterne. 2. Vævsfarvning er afhængig af håndteringen og behandlingen af vævet før farvningen. Forkert fiksering, frysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, udskæring eller kontaminering med andet væv eller væsker kan forårsage artefakter. Usammenhængende resultater kan være et resultat af variationer i fikserings- og indstøbningsmetoderne eller tilstedeværelse af uregelmæssigheder i vævet. 3. Overdreven eller ufuldstændig kontrastfarvning kan forstyrre en korrekt fortolkning af resultaterne. 4. Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal evalueres på baggrund af sygehistorie, morfologi og andre histopatologiske kriterier. Ansvaret herfor pålægges en kvalificeret patolog, der er fortrolig med de reagenser og metoder, der anvendes til frembringelse af det farvede præparat. Farvning skal udføres på et certificeret og godkendt laboratorium under opsyn af en patolog, der er ansvarlig for gennemsyn af de farvede objektglas og sikring af, at kontrollerne er egnede. 5. Ventana leverer reagenser ved optimal fortynding til brug, når de medfølgende anvisninger følges. Yderligere fortynding kan medføre tab af passende farvning. Brugeren skal validere alle ændringer. Enhver afvigelse fra anbefalede testprocedurer kan gøre forventede resultater ugyldige. Brugere, som afviger fra anbefalede testprocedurer, skal tager ansvaret for fortolkning af patientresultater. 6. På grund af variationer i behandlingen af præparater kan det være nødvendigt at forøge eller reducere inkubationstiden for protease, celleforbehandlingstiden eller inkubationstiderne for detektionskomponenterne for optimal farvning. Disse ændringer skal valideres af brugeren. Brugere, som afviger fra anbefalede testprocedurer, skal tager ansvaret for fortolkning af patientresultater under disse omstændigheder. 7. Reagenser kan udvise uventede reaktioner i hidtidigt utestet væv. På grund af biologiske variabilitet i væv kan muligheden for uventede reaktioner heller ikke udelukkes fuldstændigt i testede vævsgrupper. Kontakt den lokale supportrepræsentant med dokumenterede uventede reaktioner. Specifikke begrænsninger 1. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail blev udviklet til at farve vævssnit, som er fikseret i 10 % NBF og skåret med en tykkelse på ~4 μm. 26 Analysen farver også præparater, der er fikseret i alkoholisk formalin, zinkformalin og Prefer. Fiksering i Bouin s eller AFA frarådes. 2. For at forhindre at Red ISH signalet opløses, må farvede objektglas ikke neddyppes i alkohol- eller acetonebade ved dehydrering. Lufttørring eller tørring i en ovn anbefales. 3. Det er kendt, at SISH signalet svinder efter udsættelse for bestemte monteringsmaterialer. Se tabel 9 i afsnittet Fejlfinding for en liste over inkompatible monteringsmaterialer. KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNE 1. Analytisk sensitivitet for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail blev evalueret ved hjælp af HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides, som tidligere blev karakteriseret for antallet af HER2-genkopier ved Abbott/Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit for fluorescerende in situ hybridisering (FISH) og fastslået at have tilsvarende HER2/Chr17 forhold. Derudover blev ~90 humane præparater (en blanding af forstærkede og ikke-forstærkede tilfælde) farvet ved hjælp af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og talt af to kvalificerede læsere. Den samme gruppe blev farvet ved hjælp af PathVysion FISH og læst af en kvalificeret læser. For INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysen var den første beståede farvningssuccesrate >93 %. Resultaterne, der angiver detaljer om negative, positive og generelle overensstemmelsesrater for de ca. 60 kliniske prøver i denne gruppe, som blev talt med både FISH og INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, vises i tabel 3 og tabel 4. Tabel 3. Overensstemmelse mellem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og FISH i en gruppe med præparater med humant brystkarcinom for 2 læsere. HER2 Dual ISH læser FISH amplifikationsstatus HER2 Dual ISH amplifikationsstatus Amp Ikke-amp Amp 21 2 Ikke-amp 1 40 Amp 17 1 Ikke-amp 2 41 2010-08-23 8 / 12 1008041DA Rev B Læser A Læser B Tabel 4. Sammendrag af negative, positive og generelle overensstemmelsesrater for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og FISH på præparater med humant brystkarcinom. HER2 Dual ISH læser Læser A 40/42 Læser B 41/42 Negativ overensstemmelsesrate Rådata /antal Procent tilfælde (95 % score CI) 95,2 (84,2 98,7) 97,6 (87,7 99,6) Positiv overensstemmelsesrate Rådata /antal Procent tilfælde (95 % score CI) 21/22 17/19 95,5 (78,2 99,2) 89,5 (68,6 97,1) Generel overensstemmelsesrate Rådata /antal Procent tilfælde (95 % score CI) 61/64 58/61 95,3 (87,1 98,4) 95,1 (86,5 98,3) 2. Analytisk specificitet (hybridiseringseffektivitet) for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail blev fastlagt ved at farve normale humane metafasespredninger med HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail på et BenchMark XT instrument. Af 100 analyserede metafasespredninger udviste 100 % specifik co-lokalisering af både HER2- og kromosom 17-prober. 3. Reproducerbarhed for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysen blev testet på fem forskellige humane brystkarcinomtilfælde (der repræsenterer det dynamiske område for HER2-genstatus) og HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides over fem dage, der ikke følger hinanden, på seks instrumenter (2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark ULTRA). Det gennemsnitlige antal kopier af HER2 og kromosom 17 blev opnået fra hvert instrument (på de 3 platforme) i hver af de fem kørsler. Mere end 98 % af alle objektglas, der blev farvet og evalueret i denne undersøgelse (360 total), bestod kravet til objektglas og resulterede i reproducerbare antal kopier af HER2 og kromosom 17 med %-CV'er < 10 % på alle testede dage, instrumenter og platforme. 4. Reproducerbarhed fra en lot til en anden for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysen blev fastlagt ved at teste hver af de 3 lots af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med 3 lots af ultraview SISH DNP og ultraview Red ISH DIG Detection Kits på dobbelte objektglas med 3 humane brystkarcinomtilfælde og HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides. Alle objektglas (100 %) bestod kravet til objektglas og blev talt af en kvalificeret læser for råkopier af HER2 og Chr17 i 20 kerner/præparater. Dataene blev udsat for en variationskomponentanalyse på grundlag af en vilkårlig effektmodel, og resultaterne viser, at alle godkendelseskriterier blev opfyldt i denne undersøgelse. %-CV'er på probelot, detektionskit-lot og inden for kørslen var alle <11 %, hvilket angiver analysens fremragende præcision. 5. Analysens sammenlignelighed for brystpræparater blev fastlagt med en undersøgelse, der sammenligner INFORM HER2 DNA Probe analysen, hvor antallet af kopier af HER2 og kromosom 17 blev fastslået på individuelle objektglas ved hjælp af enkelt SISH detektion, og INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysen, hvor antallet af kopier af HER2 og kromosom 17 blev fastslået på et enkelt objektglas ved hjælp af SISH og Red ISH detektion. En gruppe på 213 brystkarcinomtilfælde, der indeholder en ~50/50 blanding af ikke-forstærket og forstærket genstatus, blev testet med begge analyser på BenchMark XT

automatiserede farvningsinstrumenter (tabel 5). Den generelle overensstemmelsesrate i kliniske prøver af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med INFORM HER2 DNA Probe analyse vises i tabel 6. 6. Reproducerbarhed for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysen blev testet på fire forskellige humane gastriske karcinomtilfælde (der repræsenterer det dynamiske område for HER2-genstatus) over dage, der ikke følger hinanden, på seks instrumenter (2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark ULTRA). Det gennemsnitlige antal kopier af HER2 og kromosom 17 blev opnået fra hvert instrument (på de 3 platforme) i hver af de fem kørsler. Mere end 98 % af alle objektglas, der blev farvet og evalueret i denne undersøgelse (240 total), bestod kravet til objektglas og resulterede i reproducerbare antal kopier af HER2 og kromosom 17 med %-CV'er < 10 % på alle testede dage, instrumenter og platforme. 7. Analysens sammenlignelighed med hensyn til gastriske præparater blev fastlagt ved at sammenligne farvningsresultater fra INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysekørslen på et BenchMark XT med Dako HER2 FISH PharmDx Kit (tabel 7). Den generelle overensstemmelsesrate i kliniske prøver af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med Dako HER2 FISH PharmDx Kit vises i tabel 8. Tabel 5. Overensstemmelse mellem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ved hjælp af Dual SISH og Red ISH Detection og INFORM HER2 DNA Probe ved hjælp af enkelt SISH detektion på en gruppe af præparater med invasivt brystkarcinom. HER2 SISH amplifikationsstatus HER2 Dual ISH amplifikationsstatus Forstærket Ikke-forstærket Samlet Forstærket 101 7 108 Ikke-forstærket 13 92 105 Samlet 114 99 213 Tabel 6. Sammendrag af den generelle overensstemmelsesrate for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ved hjælp af Dual SISH og Red ISH detektion sammenlignet med INFORM HER2 DNA Probe ved hjælp af enkelt SISH detektion på præparater med invasivt brystkarcinom. 95% sikkerhedsgrænserne præsenteres også. Generel overensstemmelsesrate Rådata /antal tilfælde Procent (95 % score CI) 193/213 90,6 (85,9 93,8) Tabel 7. Overensstemmelse mellem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysen og Dako PharmxDx FISH testen i præparater med gastrisk karcinom. Dako FISH amplifikationsstatus HER2 Dual ISH amplifikationsstatus Forstærket Ikke-forstærket Samlet Forstærket 15 2 17 Ikke-forstærket 6 123 129 Samlet 21 125 146 Tabel 8. Sammendrag af den generelle overensstemmelsesrate mellem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail analysen og Dako FISH for HER2-genstatus på præparater med gastrisk karcinom. 95 % sikkerhedsgrænserne præsenteres også. Generel overensstemmelsesrate Rådata /antal tilfælde Procent (95 % score CI) 138/146 94,5 (89,6 97,2) FEJLFINDING 1. Det er vigtigt at evaluere tilstedeværelsen af et egnet signal i de interne, positive kontrolkerner. Normale HER2 og Chr17 signaler (1 til 2 kopier pr. celle) fungerer som interne positive kontroller, og tilstedeværelsen af dem bekræfter analysesensitivitet på individuelle objektglas. Denne kernefarvning kan lokaliseres i flere ikke-neoplastiske celler inklusive: stromale fibroblaster, endotelceller, lymfocytter og andre ikke-neoplastiske celler. 2. Svag eller manglende farvning af præparater på en kørsel kan angive et problem med reagenser eller instrumentet. Kontrollér, at de rigtige præanalytiske forhold er blevet fulgt (se Prøvetagning og forberedelse til analyse). Kontrollér for at sikre, at alle dispensere fungerer korrekt. Brugen af HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides kan bruges til fejlfinding, hvis der er mistanke om problemer med reagens eller instrument. 3. Hvis SISH signalet er egnet, men Red ISH signalet er svagt eller mangler, skal det sikres, at objektglassene ikke er blevet dehydreret i alkohol eller acetone og ikke har været udsat for xylenbade for længe. Hvis Red ISH signalet er egnet, men SISH er svagt eller mangler (eller synes at forsvinde eller blive brunt/orange), kan der forekomme oxidering af signalet. Sørg for, at der anvendes de korrekte monteringsmaterialer (se tabel 9). 4. Præparater, som ikke er blevet indsamlet, fikseret eller opbevaret korrekt, udviser evt. ikke korrekt farvning (se Prøvetagning og forberedelse til analyse). 5. Hvis signalet for en eller begge prober synes at være svage eller at mangle, og tumorkernerne ser intakte ud og/eller har en blå farve, anbefales det at forøge forbehandlingstiden. Især kan ISH Protease 3 bruges i mere end 16 minutter (dvs. 24 minutter) eller ISH Protease 2 i 4 minutter eller mere. Forøgede celleforbehandlingstider (16 minutter pr. cyklus i 3 cyklusser) er også effektive. Ventana har fastslået, at manipulation af forbehandlingstrinene er mest effektive ved udbedring af svag farvning. 6. Hvis signalet fra de anbefalede forhold er svagt eller mangler i tumorcellerne, og tumorceller synes at være overfordøjede (dvs. bleg eller manglende kontrastfarve), kan det skyldes underfiksering (se Prøvetagning og forberedelse til analyse). Reduktion af ISH Protease 3 tiden til 8 til 12 minutter anbefales. Derudover er forøgelse af inkubationstiderne for SISH HRP Multimer, Silver C, AP Multimer og Fast Red Chromogen også effektive ved udbedring af svag farvning. 7. Hvis objektglassene udviser uspecifik SISH baggrundsfarvning ( støv ) i kernerne, som kan interferere med tælling af det specifikke SISH signal, kan Protease 3 tiden reduceres fra 16 minutter til 4, 8 eller 12. 8. Hvis uspecifik Red ISH farvning i kernen interfererer med tælling, skal objektglasset farves igen med højere temperaturer for stringensafskylningen (dvs. 76 C). 9. For information om korrigerende tiltag henvises til afsnittet Fremgangsmåde trin for trin, brugervejledningen for automated slide stainer, eller kontakt den lokale supportrepræsentant. 10. Snit, der er tykkere end 4 μm, kan kræve kraftigere proteaseforbehandlinger for at demaskere mål-dna. Tyndere snit kan kræve mere forsigtig proteaseforbehandlinger. Derudover kan tykke snit udvise flere kernebobler end tyndere snit på grund af overskydende paraffin i vævet (se Prøvetagning og forberedelse til analyse). Disse præparater skal evt. afparaffineres i alkohol- og xylenbade, før de farves på instrumentet, eller brugeren kan vælge den udvidede afparaffinering i farvningsproceduren for at dæmpe kerneboblerne på grund af overskydende paraffin. 11. Hvis et tilfælde udviser farvning, der ikke kan fortolkes, med brun, sort eller mørkerød baggrund i hele vævet, skal objektglasset køres igen. Hvis farvningen stadig er uacceptabel, skal det sikres, at objektglassene er SuperFrost Plus. Hvis der aflejres overskydende sølv- eller rød farve på objektglasset, hvilket gør det vanskeligt at tælle kernesignalet på grund af pletter i hele vævet, skal objektglasset også køres igen. Normalt skal der ikke køres mere end 5 6 % af tilfældene igen på grund af disse tørre-/pletartefakter. 2010-08-23 9 / 12 1008041DA Rev B

Tabel 9. Monteringsmaterialer, der er testet for kompatibilitet med SISH-baserede analyser. Monteringsmaterialer Producent Type (xylen, alkohol, vandholdig) Eukitt EMS Xylen F Entellan New Merck Xylen F Entellan Merck Xylen F HSR Sysmex Xylen F Malinol Muto Chemical Xylen F Cytoseal XYL Richard Allan Scientific Xylen N Softmount WAKO Lemasol A N Paramount Protaqs Quartett: Dako Xylen N DPX BDH: Raymond Lamb Xylen N Cytoseal 60 Richard Allan Scientific Xylen N Permount Fisher Xylen N Histomount Raymond Lamb Xylen N Ultramount Dako Xylen N Thermo EZ Mount Thermo Scientific Xylen N SureMount Triangle Biomedical Sciences Xylen N Flo-Texx Lerner Labs Xylen N Mountex Histolab Xylen N Shandon Consul mount Thermo Scientific Xylen N MM24 SurgiPath Xylen N Pertex Cell Path Xylen N MicroMount SurgiPath Xylen N Diamount Diapath Xylen N Alcolmount Diapath Alkohol N BioMount 2 BBInternational Xylen N Acrytol SurgiPath Xylen N Gel Mount Biomeda Vandholdig N Mount-Quick Daido Sangyo Co. Vandholdig N HENVISNINGER Resultat (normal farvning = N, afbleget = F) 1. Gschwind A, Fischer OM, Ullrich A. The discovery of receptor tyrosine kinases: target for cancer therapy. Nat Rev Cancer 2004;4;361-370. 2. Muleris M, et al. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemic viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17121.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76:34-5. 3. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230:1132-1139. 4. Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neu protooncogene in human breast and ovarian cancer. Science 1989;244:707-712. 5. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235:177-182. 6. Narita M, Nakao K, Ogino N, et al. Independent prognostic factors in breast cancer patients. Am J Surg 1998;175:73-75. 7. O Reilly SM, Barnes DM, Camplejohn RS, et al. The relationship between c-erbb-2 expression, S-phase fraction, and prognosis in breast cancer. Br J Cancer 1991;63:444-446. 8. Pegram MD, Finn RS, Arzoo K, et al. The effect of HER-2/neu overexpression on chemotherapeutic drug sensitivity in human breast and ovarian cancer cells. Oncogene 1997;15:537-547. 9. Press MF, Pike MC, Chazin VR, et al. HER-2/neu expression in node-negative breast cancer: Direct tissue quantitation by computerized image analysis and association of overexpression with increased risk of recurrent disease. Cancer Res 1993;53:4960-4970. 10. Press MF, Bernstein L, Thomas PA, Meisner LF, et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: Poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J Clin Oncol 1997;15:2894-2904. 11. Gusterson BA, Gelber RD, Goldhirsch A, et al. Prognostic importance of c-erbb-2 expression in breast cancer. J Clin Oncol 1992;10:1049-1056. 12. Bianchi S, Paglierani M, Zampi G, et al. Prognostic significance of c-erbb-2 expression in node negative breast cancer. Br J Cancer 1993;67:625-629. 13. Kallioniemi O-P, Holli K, Visakorpi T, et al. Association of c-erb-2 protein expression with high rate of cell proliferation, increased risk of visceral metastasis and poor long-term survival in breast cancer. Int J Cancer 1991;49:650-655. 14. Vogel CL, Cobleigh MA, Tripathy D, et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol 2002;20:719-726. 15. Baselga J, Carbonell X, Castaneda-Soto NJ, et al. Phase II study of efficacy, safety, and pharmacokinetics of trastuzumab monotherapy administered on a 3- weekly schedule. J Clin Oncol 2005;23:2162-2171. 16. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. Concurrent administration of anti-her2 monoclonal antibody and first-line chemotherapy for HER2-overexpressing metastatic breast cancer. A phase III, multinational, randomized controlled trial. N Engl J Med 2001;344:783-792. 17. Marty M, Cognetti F, Maraninichi D, et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatments: The M77001 Study Group. J Clin Oncol 2005;23:4265-4274. 18. Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B, et al. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005;353:1659-1672. 19. Romond EH, Perez EA, Bryant J, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005;353:1673-1684. 20. Bilous M et al. Current perspectives on HER2 Testing: A review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003:173-182. 21. Wolff, AC, Hammond, MEH, Schwartz, JN, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2007;131:18-43. 22. Baloglu G, Haholu A, Kucukodaci Z, Yilmaz I, Yildirim S, Baloglu H. The effects of tissue fixation alternatives on DNA content: a study on normal colon tissue. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2008;16:485-492. 23. Middleton LP, et al. Implementation of American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists HER2 Guideline Recommendations in a tertiary care facility increases HER2 immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization concordance and decreases the number of inconclusive cases. Arch Pathol Lab Med. 2009;133:775-780. 24. Khoury T, Sait S, Hwang H, Chandrasekhar R, Wilding G, Tan D, Kulkami S. Delay to formalin fixation effect on breast biomarkers. Mod Pathol. 2009;22:1457-1467. 25. Reinholz MM, et al. Breast cancer and aneusomy 17: Implications for carcinogenesis and therapeutic response. Lancet Oncol. 2009 Mar;10:267-277. 26. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and Practice of Histotechnology, 2nd Edition. The C.V. Mosby Company, St. Louis, 1980. 27. Hofmann M, Stoss O, Shi D, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52:797-805. 2010-08-23 10 / 12 1008041DA Rev B

OPHAVSRET INFORM, ultraview, BenchMark, VENTANA og Ventana logoet er varemærker tilhørende Roche. Alle andre varemærker tilhører deres respektive ejere. Ventana giver kun køberen licens til engangsbrug under U.S. Pat. Nos. 6045759, 6192945, 6416713, 6945128, and 7378058, og tilsvarende udenlandske patenter. KONTAKTINFORMATIONER Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D-68305 Mannheim Germany www.ventanamed.com 2010-08-23 11 / 12 1008041DA Rev B

Bilag A: Fortolkning af resultater, scoringsark Der skal tælles 20 kerner. Hvis HER2/Chr17 forholdet falder til mellem 1,8-2,2: Der skal tælles 20 ekstra kerner. Målområde 1 Målområde 2, hvis forhold 1.8 HER2/Chr 17 2.2 Heterogenitet til stede? (Afkryds, hvis ja) Heterogenitet til stede? (Afkryds, hvis ja) Celle HER2-tælling Celle Chr17- tælling Celle HER2-tælling Celle Chr17-tælling 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 6 7 7 7 7 8 8 8 8 9 9 9 9 10 10 10 10 11 11 11 11 12 12 12 12 13 13 13 13 14 14 14 14 15 15 15 15 16 16 16 16 17 17 17 17 18 18 18 18 19 19 19 19 20 20 20 20 Klynger til stede? (Afkryds, hvis ja) Klynger til stede? (Afkryds, hvis ja) Klynger til stede? (Afkryds, hvis ja) Klynger til stede? (Afkryds, hvis ja) Samlet antal HER2- signaler i målområde 1 Samlet antal Chr17- signaler i målområde 1 Samlet antal HER2- signaler i målområde 2 Samlet antal Chr17- signaler i målområde 2 a b d e Målområde 1 HER2/Chr17 forhold c = a/b Målområder 1 og 2 HER2/Chr17 forhold f = (a+d)/(b+e) Ikke-forstærket: HER2/Chr17 < 2,0 Ikke-forstærket: HER2/Chr17 < 2,0 Forstærket: HER2/Chr17 2,0 Forstærket: HER2/Chr17 2,0 2010-08-23 12 / 12 1008041DA Rev B