Brugsanvisning EULISA dsdna IgG Anvendelse Enzymimmunoassay til bestemmelse af IgG autoantistoffer rettet mod dsdna 96 mikrotiterbrønde Kittet skal opbevares ved +28 C Kun til in vitro diagnostisk brug Dokument nr. E230240 DK Januar 203 EULISA dsdna IgG DANSK 2296 96
Indhold. Introduktion og baggrund 2. Advarsler og forholdsregler 3. Testens principper 4. Kittets indhold 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger 6. Opbevaring af kittet 7. Reagens og prøvepræparation / prøvekrav 8. Analyseprocedure 8.. Manuel udførelse 8.2. Dynex DS2 automatiseret ELISA system 9. Evaluering og kvalitetskontrol 0. Fortolkning af resultater / procedurebegrænsninger. Produkt karakteristik.. Standardisering.2. Analytisk specificitet.3. Detektionsgrænse (analytisk sensitivitet).4. Homogenitet af bindingskapacitet.5. Linearitet.6. Præcision.7. Frekvensfordeling af dsdnaab (IgG).8. Manuel udførelse vs. Dynex DS2 automatiseret ELISA system 2. Garanti 3. Symboler 4. Henvisninger 5. Resuméflowdiagram Produktet, der er beskrevet heri, er blevet fremstillet i overensstemmelse med Direktiv om medicinsk udstyr til in vitrodiagnostik 98/79/EF.
. Introduktion og baggrund Systemic lupus erythematosus (SLE) er en autoimmunmedieret, kronisk inflammatorisk sygdom med variabel klinisk præsentation, der rangerer fra lokaliserede hudlæsioner til en destruktiv systemisk lidelse uden kutane ændringer (). Antistoffer mod dobbeltstrenget (ds) DNA er en velkendt, specifik markør for SLE med en forekomst på 5090%, alt afhængig af sygdomalvorlighed (2, 3, 4). Titeren korrelerer ofte til sygdomsaktivitet og udgør en metode til behandlingskontrol (5). Cirkulerende DNA/antiDNA immunkomplekser menes at spille en rolle i patogenesen af SLE (6). dsdnaantistoffer udgør et SLEkriterie i henhold til American Rheumatism Association (ARA). Den nuværende enzymkoblede immunosorbent analyse (ELISA) er beregnet til kvantitativ eller kvalitativ bestemmelse af IgGantistoffer i human serum rettet mod dsdna. Det immobiliserede antigen er en højrenset præparation af plasmiddsdna (>90% i supercoiled tilstand), fri for kromosomalt DNA og protein (histoner). Testen er hurtig (inkubationstid 30 / 30 / 30 minutter) og fleksibel (delelig fast fase, reagenser, der er parat til brug). Seks kalibratorer standardiserer de kvantitative målinger; en negativ og en positiv kontrol sikrer analysens gyldighed. 2. Advarsler og forholdsregler Testkittet er kun beregnet til in vitro diagnostisk brug og ikke til indvortes eller udvortes brug til mennesker eller dyr. Reagenserne må ikke anvendes efter deres udløbsdato. Det anbefales stærkt, at denne protokol følges. Prøvebuffer, kalibratorer og kontroller indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Vaskebufferen indeholder bromonitrodioxan og konjugatet methylisothiazolon / bromonitrodioxan som konserveringsmiddel. Substratet indeholder 3, 3', 5, 5'tetramethylbenzidin (TMB) og hydrogenperoxid (H2O2). Stopopløsningen, 0,5 M svovlsyre (H2SO4), er sur og ætsende. De ovennævnte reagenser kan være toksiske, hvis de indtages. Følg rutinemæssige forholdsregler for håndtering af farlige kemikalier. Undgå al kontakt med kroppen, brug handsker og øjenbeskyttelse. Hvis en reagens kommer i kontakt med hud eller slimhinder, skal der skylles grundigt med vand. 2
Der må aldrig pipetteres med munden. Skal bortskaffes på en måde, der er i overensstemmelse med nationale/lokale forordninger. Natriumazid kan reagere med bly og kobbervandrør og danne eksplosive metalazider. Ved bortskaffelse skal der skylles med store mængder vand for at forhindre ophobning af azid. Kalibratorerne og kontrollerne indeholder materialer af human oprindelse. They have produced negative results when tested for Human Immunodeficiency Virus (HIV)Ag, hepatitis B overflade (HBs)antigen, HIV /2Ab og hepatitis C Virus (HCV)Ab, i FDA godkendte eller Europæisk direktiv 98/79/EFoverensstemmende tests. Ingen kendte tests kan imidlertid garantere, at produkter, der er afledt fra humant blod, ikke vil være infektiøse. De skal derfor håndteres, som var de i stand til at overføre infektiøse agenser og bortskaffes på behørig måde. Der henvises til CDC (Center of Disease Control, Atlanta, USA) eller andre lokale/nationale retningslinjer for laboratoriesikkerhed og dekontamineringsprocedurer. 3. Testens principper Den faste fases brønde er belagt med dsdna. På denne overflade vil de følgende immunologiske reaktioner finde sted:. reaktion: dsdnaspecifikke antistoffer i prøven vil binde sig til det immobiliserede antigen og danne antigenantistof komplekset. Herefter vaskes de ikkebundne prøvekomponenter væk fra den faste fase. 2. reaktion: Et andet antistof, der er rettet mod humane IgGantistoffer og konjugeret med horseradish (peberrod) peroxidase (HRP), tilsættes. Dette konjugat binder sig til komplekset. Herefter vaskes overskydende konjugat væk fra den faste fase. 3. reaktion: Det enzymmærkede kompleks omdanner et farveløst substrat til et blåt produkt. Graden af farveudvikling afspejler koncentrationen af dsdnaantistoffer (IgG) i prøven. 3
4. Kittets indhold a. mikrobrøndsplade belagt med dsdna og hermetisk indpakket i en folielaminatpose sammen med en pose med tørremiddel. Pladen består af 2 strimler, der hver kan afrives til 8 individuelle brønde. b. Prøvebuffer, 00 ml, parat til brug, orange farve. Indeholder trisbufferet saltvand (TBS), bovin serumalbumin (BSA), Tween og natriumazid. c. Vaskebuffer, 00 ml, 0xkoncentrat, blå farve. Indeholder TBS, Tween og bromonitrodioxan. d. 6 kalibratorer, 2,0 ml hver, 0 6,5 6 40 00 og 250 IU dsdnaantistoffer (IgG) / ml, parat til brug, gradvist blåfarvet. Indeholder TBS, BSA, Tween og natriumazid. e. Negativ og positiv kontrol, 2,0 ml hver, parat til brug, henholdsvis grøn og rød. Indeholder TBS, BSA, Tween og natriumazid. f. Antihumant IgG HRPkonjugat, 4 ml, parat til brug, rød farve. Bufferet opløsning, der indeholder stabiliserende protein, methylisothiazolon og bromonitrodioxan. g. Substratopløsning, 4 ml, parat til brug, farveløs. Indeholder en bufferet opløsning af TMB og H2O2. Indeholdt i et hætteglas, som lys ikke kan trænge igennem. 4
h. Stopopløsning (0,5 M H2SO4), 4 ml, farveløs, parat til brug. Forsigtig: svovlsyre er ætsende. i Brugsanvisning j. Batchspecifikt analysecertifikat 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger a. Demineraliseret eller destilleret vand b. Måleglas, 000 ml c. Rør til prøvefortynding (overførselsrør i mikrobrøndspladeformat anbefales) d. Pipetter til 0, 00 og 000 µl ( og 8kanals pipetter anbefales) e. Mikrobrøndspladevaskeapparat (valgfri) f. Mikrobrøndspladefotometer udstyret med et 450 nm filter g. ELISA evalueringsprogram (anbefalet) 6. Opbevaring af kittet Kittet skal opbevares ved 2 8 C. Det er stabilt op til den udløbsdato, der er anført på boksens mærkat. Kittet må ikke anvendes efter dets udløbsdato. 7. Reagens og prøvepræparation / prøvekrav Man må ikke ombytte eller sammensætte tilsvarende komponenter fra forskellige kits på grund af mulige forskelle på forsendelses eller opbevaringsbetingelser. 5
a. Før posen med den faste fase åbnes, skal den først nå op på stuetemperatur. Tag alle mikrobrøndene ud af rammen og put dem øjeblikkeligt tilbage i posen, sammen med posen med tørremiddel. Genforsegl posen hermetisk og opbevar den i køleskab til fremtidig brug. b. Fortynd vaskebuffer 0xkoncentratet (00 ml, blå) med 900 ml demineraliseret vand. Bland grundigt. Den fortyndede buffer er stabil i adskillige uger, hvis den opbevares i køleskab (2 8 C). c. Klargøring af prøver: Patientprøver skal håndteres, som var de i stand til at overføre infektiøse agens. Klargør sera i henhold til normale laboratorieteknikker og fortynd dem /00, fx 0 µl serum + 990 µl prøvebuffer. Bland grundigt. For at opnå hurtig dispensering under analyseproceduren anbefales det, at kalibratorer, kontroller og prøver i mikrobrøndoverførselsrør klargøres. Dette gør det muligt, at anvende en 8kanals pipette under analyseproceduren. Hvis prøver ikke analyseres med det samme, skal de opbevares ved 2 8 C og analyseres indenfor 3 dage. For længere opbevaring anbefales 20 C eller derunder. Gentagen nedfrysning og optøning af sera skal undgås. Optøede prøver skal blandes inden de fortyndes. Prøvekrav: Stærkt lipæmiske, hæmolyserede eller mikrobielt kontaminerede sera kan forårsage fejlagtige resultater og skal undgås. 8. Analyseprocedure 8.. Manuel udførelse Før analysen startes skal alle kittets komponenter være nået op stuetemperatur (23 ± 3 C). For at opnå de bedste resultater, dvs. det maksimale forhold mellem specifikt og baggrundssignal, er omhyggelig vask afgørende (trin a, c og e). Det er yderst vigtigt, at vaskeopløsningen fjernes fuldstændigt. Det gøres ved at tappe pladen resolut på adskillige lag absorberende servietter. Automatiserede vaskeapparater skal verificeres i henhold til resultater, der opnås med manuel vask. 6
a. Umiddelbart før brug skal den faste fase vaskes én gang: fyld brøndene med 350 µl vaskebuffer hver, lad brøndene gennembløde i 0 sekunder og fjern vaskebufferen. b. Dispensér kalibratorerne (2,0 ml hver, parat til brug, gradvist blå), kontroller (2,0 ml hver, parat til brug, grøn og rød) og de fortyndede prøver hurtigt i mikrobrøndene; 00 µl pr. brønd. Dobbeltbestemmelser anbefales. Inkubér pladen i 30 minutter ved stuetemperatur (23 ± 3 C). c. Vask brøndene 4 gange som i trin a. d. Dispensér hurtigt (helst med en 8kanals pipette) konjugatet (4 ml, parat til brug, rød); 00 µl pr. brønd. Inkubér pladen som i trin b. e. Gentag vasketrin c. f. Dispensér hurtigt (helst med en 8kanals pipette) substratopløsningen (4 ml, parat til brug, farveløs, sort hætteglas); 00 µl pr. brønd. Inkubér pladen som i trin b. Da substratet er lysfølsomt skal intens lyseksponering (fx direkte sollys) undgås under inkubation. g. Dispensér hurtigt (helst med en 8kanals pipette) stopopløsningen (4 ml, parat til brug, farveløs. Forsigtig: ætsende!); 00 µl pr. brønd. Brug den samme sekvens som for substratet. Farven skifter fra blå til gul. Ryst pladen, helst på en orbitalryster, i ca. 0 sekunder. h. Aflæs øjeblikkeligt absorbansen i mikrobrøndspladefotometeret ved 450 nm. Opbevar de resterende reagenser i køleskab (2 8 C), hvis de skal bruges igen. 8.2. Dynex DS2 automatiseret ELISA system Dette produkt er blevet valideret til brug med Dynex DS2 automatiseret ELISA system. En behørig programfil til analyseudførelse og evaluering kan fås ved anmodning. Dette programs parametre er kun et forslag, og det kan være nødvendigt, at operatøren tilpasser dem til den faktiske analyses krav. Vi har generelt forsøgt, at holde os så tæt som muligt på protokollen for den manuelle udførelse, som beskrevet ovenfor. På grund af den nødvendigvis forhøjede temperatur inden i DS2 har det været nødvendigt at forkorte substratinkubationsperioden. Punkt.8. viser en sammenligning af analyseresultater opnået ved manuel udførelse og ved brug af DS2 ELISA systemet. 7
9. Evaluering og kvalitetskontrol Kvantitativ evaluering: De fremkomne data evalueres kvantitativt med standardkurven, som vist nedenfor. Den viste kurve tjener imidlertid kun som illustration. Den kan ikke erstatte målingen af kalibratorerne sammen med kontrollerne og de faktiske prøver. Kurven er blevet konstrueret med et konventionelt ELISA evalueringsprogram, der anvender en 4 parameterfunktion. Splineapproksimationen er ligeledes passende. 2500 2000 Dynex DS2 xx manual op. oo mod 450nm 500 000 500 0 0 00 000 IU dsdnaab/ ml 09FE00.FED/StdKurveV40J Hvis computerunderstøttet evaluering ikke er mulig, kan standardkurven tegnes i hånden. Det muliggør transformation af en prøves absorbansværdi til dens koncentration, dvs. til IU dsdnaantistoffer (IgG) pr. ml serum. Kvalitativ evaluering: Testen kan også evalueres på en kvalitativ måde. Dette kræver kun måling af den positive kontrol. Det anbefales ikke desto mindre at måle og undersøge den negative kontrol (se nedenfor: kvalitetskontrol). I kvalitativ testevaluering sammenlignes prøvernes absorbans med grænseabsorbansen (= cutoff). Den bestemmes ved brug af den følgende formular: absorbans gränse = absorbans positiv kontrol x faktor Faktoren varierer for forskellige kit batches og er anført på det batchspecifikke analysecertifikat, der er inkluderet med hvert enkelt testkit. Eksempel: 8
absorbans positiv kontrol = 250 mod faktor = 0,35 absorbans grænse = 250 mod x 0,35 = 438 mod For at få indtryk af, hvor positiv en bestemt prøve er for dsdnaab (IgG), kan man beregne forholdet ved hjælp af formlen: forhold = absorbans prøve / absorbans grænse Eksempel: Absorbans grænse = 438 mod absorbans prøve = 480 mod forhold = 480 mod / 438 mod = 3,4 Kvalitetskontrol: Den positive og negative kontrol kontrollerer analysens gyldighed. Deres autoriserede værdier og acceptable områder er anført på det batchspecifikke analysecertifikat. Kontrollernes værdier skal falde indenfor de angivne områder, hvis de ikke gør, er analysens resultater ugyldige. 0. Fortolkning af resultater / procedurebegrænsninger Baseret på målinger af en gruppe af sera fra bloddonorer og en gruppe af positive sera (se nedenfor), foreslår vi for vurderingen af patientsera: kvantitativ evaluering kvalitativ evaluering IU dsdnaab (IgG) forhold pr. ml serum normalt (negativt) område < 35 < 0,90 cutoff 40,00 tvetydigt område 35 46 0,90, positivt område > 46 >, Disse specifikationer gives kun som en indikation; for at kontrollere enhver analyses nøjagtighed bør der altid inkluderes parallelprøver af normal sera. 9
Et negativt testresultat indikerer, at patienten ikke har et forhøjet niveau af IgGantistoffer mod dsdna. Hvis kliniske tegn på SLE ikke desto mindre observeres, kan yderligere antinukleære antistoffer måske blive bestemt. Da dsdnaautoantistoffer sjældent observeres hos normale personer, skulle et positivt resultat anses for at være en indikation for SLE. I nogle få tilfælde forekommer dsdnaantistoffer imidlertid ved andre autoimmune lidelser. Prøver, der udviser resultater mellem de ovenfor anførte grænser, skal betragtes som dobbelttydige og rapporteres som sådan. Det anbefales, at endnu en prøve indsamles to uger senere og køres parallelt med den første prøve for at dokumentere en mulig ændring i antistoftiter. Som med alle serologiske tests skal resultaterne fortolkes i lyset af patientens symptomer og andre diagnostiske kriterier.. Produkt karakteristik.. Standardisering Testen er standardiseret med en renset serumpræparation, der indeholder IgGantistoffer, der specifikt er rettet mod dsdna. Denne præparation er blevet kalibreret overfor den første internationale standard for dsdnaab, kodet Wo/80. Graden af prøvereaktivitet måles i internationale enheder (IU dsdna Ab (IgG)/ml serum)..2. Analytisk specificitet Testen muliggør specifik bestemmelse af humane IgGantistoffer rettet mod dsdna..3. Detektionsgrænse (analytisk sensitivitet) Detektionsgrænsen er defineret som den koncentration, der svarer til middelabsorbansen af prøvebuffer plus 3fold standardafvigelse (s). Den blev bestemt som < IU dsdnaab (IgG) pr. ml serum (n = 24). Anbefalet måleområde: 5 250 IU dsdnaab (IgG) pr. ml serum.4. Den faste fases homogenitet Måling af den faste fases homogenitet er en regelmæssig kvalitetskontrol (QC) del af hver enkelt produktionsbatch. Denne bestemmes ved en 288fold måling af en IgGpositiv, men ikkemættende prøve på 3 udvalgte plader. Acceptkriterie: modvariationskoefficient (cv) over pladerne < 8%. 0
Figuren nedenfor viser et repræsentativt uddrag (fast fase batchnr. 0809C) af sådan en analyse. plade tidlig (n/0) sen (9n/0) middel værdi cv% række 2 6 7 2 2 6 7 2 linje a 964 950 942 95 942 934 942 948 949 946 965 965 950, linje b 937 945 94 944 933 925 937 936 939 935 96 976 942,4 linje c 922 926 929 940 92 907 929 90 92 925 948 962 927,8 linje d 922 9 99 926 909 9 95 97 98 99 937 960 922,5 linje e 93 907 904 94 923 96 933 924 92 945 958 993 929 2,7 linje f 899 902 890 906 95 92 93 898 926 930 948 985 99 2,9 linje g 896 886 88 90 895 895 904 890 902 926 92 964 905 2,5 linje h 893 90 893 899 905 902 96 902 92 929 93 975 94 2,5 middelværdi 98 96 92 923 97 93 924 96 924 932 946 973 926 cv% 2,6 2,4 2,6 2,2,7,4,5 2,2,6,0,6,2 2,5 line a line b line c line d line e line f line g line h 0 200 400 600 800 000 mod 450nm
mod 450nm 000 800 600 400 200 0 2 6 7 2 2 6 7 2 early / late plate, row no. 09FE00.FED/FphHomV40J.5. Linearitet For at vurdere testens dosisrespons forhold blev positive sera målt i seriel 2 fold fortynding. Acceptkriterie: lineær regression af 4 på hinanden følgende fortyndinger skal give en korrelationsfaktor > 0,98. Et typisk resultat er vist nedenfor. L m / b 250 200 50 A A N D 00 s d IU 50 serum serum 2 serum 3 lin.regr. lin.regr.2 lin.regr.3 0 0 200 400 600 800 000 nl serum / well 09FE00.FED/LinearV40J 2
.6. Præcision For vurdering af testens præcision blev variabiliteten af resultater under de følgende forhold bestemt: a. indenfor analyse og mellem 3 analyser, b. mellem 3 operatører og c. mellem 2 kitbatches. a. Intra og interanalysevariabilitet (n = henholdsvis 24 og 72) prøve middelværdi variabilitet (cv, %) IU/ml Intraanalyse interanalyse 23 3,3 3,5 2 82 2,2 3, 3 00 2,0 2,0 b. Operatør til operatørvariabilitet (n = 2) prøve middelværdi variabilitet IU/ml (cv, %) 27 4, 2 30 2, 3 60 2,4 c. Variabilitet mellem 2 kitbatches (n = 6) prøve middelværdi variabilitet IU/ml (cv, %) 27 8,0 2 94 6,0 3 0 6,4.7. Frekvensdistribution af dsdnaab (IgG) Denne blev analyseret for en gruppe af sera fra bloddonorer, der var ligeligt fordelt mht. køn og alder, og for en gruppe af sera, der var fundet positive i henhold til en CEkompliant referenceelisa. Den følgende distribution af analyten blev observeret:. Smantistoffer anses for stærkt specifikke for SLE. Den følgende distribution af analyten blev observeret: 3
bloddonorsera positive sera n: 60 n: 9 middelværdi: IU/ml middelværdi: 39 IU/ml middelværdi + s: 2 IU/ml middelværdi s: 47 IU/ml middelværdi + 2s: 3 IU/ml middelværdi 2s: < 0 IU/ml median: 8, IU/ml median: 0 IU/ml 95. percentil: 22 IU/ml 5. percentil: 59 IU/ml ROCanalyse af disse data blev brugt til at bestemme cutoff som 40 IU dsdnaab (IgG)/ml (7). De her præsenterede data indikerer en diagnostisk specificitet og sensitivitet for ELISA'en på henholdsvis ca. 98 % og næsten 00 %. Disse værdier gælder kun for de målte sera; andre grupper kan give andre resultater. blood donor sera 25 ) 20 (% y c n 5 e u q fre e 0 tiv la re 5 cutoff 0 < 2 2 3 3 5 4 7 6 9 6 3 3 2 9 5 3 9 2 2 5 2 4 7 3 6 4 3 9 9 6 8 3 0 5 2 5 0 2 IU dsdnaab/ml 4
<,22,48,8 2,2 2,68 3,26 3,98 4,84 5,9 7,8 8,75 0,7 3 5,8 9,3 23,5 28,6 34,8 42,4 5,6 62,9 76,6 93,3 4 38 69 205 250 relative frequency (%) positive sera 25 20 5 0 cutoff 5 0 IU dsdnaab/ml 09FE00.FED/HäufgPlotV40J.8. Manuel udførelse vs. Dynex DS2 automatiseret ELISA system Variabilitet: Ved brug af prøve fra den samme kitbatch blev variabiliteten af analysens resultater sammenlignet mellem manuel udførelse og Dynex DS2 automatiseret ELISA system: manuel udførelse Dynex DS2 intraanalyse variabilitet middelværdi cv =,7 % middelværdi cv = 2,3 % (n = 6) interanalyse variabilitet middelværdi cv = 3,3 % middelværdi cv = 4,2 % (n = 48) Standardkurve: vist i punkt 9 5
Dynex DS2 (IU/mL) Korrelation: 200 50 y =,082 x r = 0,999 00 50 0 0 50 00 50 200 manual operation (IU/mL) 2. Garanti 09FE00.FED/KorrDynexDS2V40J Euro Diagnostica AB garanterer, at det leverede produkt er blevet testet grundigt for at sikre, at dets egenskaber, som specificeret heri, er opfyldt. Der ydes ingen yderligere garantier. De data, der er præsenteret her, blev indhentet ved brug af den anførte procedure. Enhver proceduremodifikation kan påvirke resultaterne og Euro Diagnostica AB vil i så tilfælde fraskrive sig alle garantier, hvad end de er udtrykkelige, underforståede eller lovbefalede. Euro Diagnostica AB vil ydermere ikke acceptere noget ansvar for skader, hvad end de er direkte, inddirekte eller efterfølgende opståede som følge af ubehørig brug eller opbevaring af produktet. 6
3. Symboler Bestillingsnummer Batchkode Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests In vitro diagnostisk medicinsk anordning CEoverenstemmelsesmærkning Må ikke udsættes for sollys Temperaturgrænse Skal anvendes inden Forsigtig Biologiske risici 7
Producent 4. Henvisninger. Tan, E. M., et al.: The 982 revised criteria for the classifiction of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 25 (982), 27 277 2. Ludivico, C. L., et al.: Predictive value of antidna antibody and selected laboratory studies in systemic lupus erythematosus. J Rheumatol 7 (980), 843 849 3. Schwartz, R. S.: AntiDNA antibodies and the problem of autoimmunity. Cell Immunol 99 (986), 38 43 4. Arbuckle, M. R., et al.: Development of antidsdna autoantibodies prior to clinical diagnosis of systemic lupus erythematosus. Scan J Immunol 54 2 (200), 2 29 5. Bootsma, H., et al.: Prevention of relapses in systemic lupus erythematosus. Lancet 345 (995), 595 599 6. Tan, E. M.: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Adv Immunol 33 (982), 67 240 7. Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der GliadinAntikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 04/4 (992), 86 92 8
5. Resuméflowdiagram a. Fortynd sera /00 i prøvebuffer (00 ml, parat til brug, orange) og bland. b. Fortynd vaskebuffer 0xkoncentratet (00 ml, blå) med vand og bland. c. Vask brøndene en gang med 350 µl vaskebuffer hver. Dispensér 00 µl af kalibratorerne (2,0 ml hver, parat til brug, gradvist blå) og kontroller (2,0 ml hver, parat til brug, grøn og rød) og de fortyndede prøver i brøndene. Dobbeltmålinger anbefales. Inkubér i 30 minutter ved stuetemperatur (23 ± 3 C). d. Vask brøndene 4 gange med 350 µl vaskebuffer hver. e. Dispensér 00 µl af konjugatet (4 ml, parat til brug, rød) i brøndene. Inkubér som i trin c. f. Gentag vasketrin d. g. Dispensér 00 µl af substratopløsningen (4 ml, parat til brug, sort hætteglas) pr. brønd. Inkubér som i trin c. Derefter tilsættes 00 µl stopopløsning (4 ml, parat til brug, farveløs) pr. brønd og ryst pladen kortvarigt. h. Mål øjeblikkeligt absorbansen ved 450 nm. i Kvantitativ evaluering: Bestem standardkurven og, ved brug af denne kurve, omsæt prøvernes absorbans til deres respektive antistofkoncentration (IU dsdnaab (IgG)/ml). j. Kvalitativ evaluering: Bestem grænseabsorbansen ved at multiplicere absorbansen af den positive kontrol med den faktor, der er angivet på analysecertifikatet. Derefter beregnes prøvernes forhold ved at dividere deres absorbans med grænseabsorbansen. 9