KvægInfo nr.: 1452 Dato: 21-02-2005 Forfatter: Morten Dam Rasmussen Automatisk detektion af klinisk mastitis Af seniorforsker Morten Dam Rasmussen Afd. for Husdyrsundhed, Velfærd og Ernæring Danmarks JordbrugsForskning e-mail: mortend.rasmussen@agrsci.dk Ved automatisk malkning er det essentielt, at køer med klinisk mastitis udpeges og mælken frasepareres. Ændringer i mælkens ledningsevne ved mastitis er ikke tilstrækkeligt sikkert at bruge til automatisk sortering af mælken og der er behov for videreudvikling af mere specifikke sensorer. Alarmlister baseret på måling af mælkens ledningsevne har hidtil ikke prioriteret mellem årsagerne til hvorfor koen optræder på listen, men det er oplagt at skelne mellem klinisk mastitis, kronisk mastitis, nye tilfælde af subklinisk mastitis, helbredelse, og manglende helbredelse af kirtlen eller koen. Nye biosensorer er under udvikling og med muligheden for in-line målinger i mælken under malkningen, brug af avancerede statistiske værktøjer og sammenligning med historiske data for samme ko og kirtel, så kan informationen fra disse systemer gøres mere målrettede. Dermed kan landmændene sikres præcis information til brug i den daglige drift og forbrugerne kan sikres en optimal mælkekvalitet. Det er normalt for konventionel malkning at vurdere forekomst af klinisk mastitis ud fra formælkens udseende. Herudover kan det som regel mærkes, hvis kirtlen føles øm og varm eller er hævet og koen giver tegn på ubehag under formalkningen. Engelsk litteratur angiver at man kan forvente at finde mindst 80% af de kliniske tilfælde under formalkningen og dermed vil mindre end 1% forblive uopdaget, hvis tilfældet varer mindst 3 malkninger. Hvis der i en besætning er 50 kliniske tilfælde pr. 100 køer pr. år og hvert tilfælde varer 4 dage, så vil man kunne forvente at finde ca. en ko med klinisk mastitis for hver 200 køer, som man formalker. Dette kan synes som en lille andel og fremsætter klart et ønske om udpegning af kritiske perioder og automatisk overvågning, så man kan være særligt opmærksom, hvor risikoen er størst. Ændringer i mælkens sammensætning ved mastitis Kirtler, som er fri for patogener, anses for at være raske. Kirtler inficeret med et patogen, men som er uden kliniske symptomer lider af subklinisk mastitis. I de tilfælde, hvor mælken er forandret har kirtlen og koen klinisk mastitis uanset om vi er i stand til at finde patogener i mælken. Der er stor overlap mellem disse tre stadier afhængig af, hvilke indikatorer vi bruger til vores klassificering. En infektion i kirtlen nedbryder vævet og blod-mælk barrieren, hvorved mælkens sammensætning nærmer sig blodets og mange af de specielle komponenter og enzymer, der findes i blodet findes så også i mælken. I tabel 1 er vist en oversigt over ændringer i mælkens sammensætning i forbindelse med mastitis. Ændringerne afspejler mange forskellige processer og stadier i udvikling og helbredelse af mastitis. Hermed er det også klart at vælger man én parameter til at klassificere kirtlen som rask eller syg, så vil man kunne få et andet resultat ved brug af andre parametre. Derfor er der brug for en entydig definition på unormal mælk i det øjeblik at sorteringen skal ske automatisk.
Tabel 1. Ændringer i mælkens sammensætning ved mastitis (Korhonen and Kaartinen, 1995). Komponent Normalt indhold Grad og retning af ændringer *) Hovedkomponenter Fedt % 4.3 Protein % 3.3 Laktose % 4.8 Fedt komponenter Frie fedtsyrer (meqv/l) 0.7 + + Fedtsyre sammensætning mg/g fat) C 4 - C 12 126.4 + C 16 - C 18 708.4 Protein fraktioner (mg/ml) Total casein 27.9 Total valle protein 8.5 + + + Kaseiner (mg/ml) α S1 -casein 13.3 β-casein 10.6 κ-casein 1.6 + +? Valleproteiner (mg/ml) β-lactaglobulin 3.3 α-lactalbumin 1.2 Immunoglobulins 0.6 + + + Proteose-peptones 0.5 + + Serum albumin 0.3 + + + Lactoferrin 0.1 + + + Mineraler og sporelementer (µg/ml) Natrium 470 + + Chloride 1030 + + + Kalium 1500 Calcium 1210 Magnesium 120 Fosfor 950 Jern 0.53 + Kobber 0.12 + Zink 3.60 Enzymer Catalase (µmol O 2 /min/ml) 0.08 + + + + Lactate dehydrogenase (mu/ml) 300-500 + + + Alkaline phosphatase (U/ml) 191 + + + Acid phosphatase (µmol/min/ml) 0.06 + + Carboxylesterase (µg/ml) 0.004 + + + + Arylesterase (µg/ml) 0.03 + + + β-glucuronidase (µg/ml) 0.01 + + + Lactoperoxidase (µg/ml) 0.02 + Lipase (µg/ml) 1.5 + + Lysozyme (µg/ml) 0.0004 + + + + Xanthine oxidase (µg/ml) 12 +/ Plasmin (U/ml) 73.5 + + + Ornithine decarboxylase (U/ml) 984 N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAGase %) 7.3 + + + Vitaminer (µg/ml) Vitamin A 0.37 +/ β-carotene 0.21 +/ B 1 (thiamin) 0.42 B 2 (riboflavin) 1.72 Vitamin C 18 *) Forklaring
+ = 10x stigning = 10 % fald + + = 11-100x stigning = 11-25 % fald + + + = 101-1000x stigning = 26-75 % fald + + + + = >1000x stigning = > 75 % fald Analyse af kocelletal Celletallet for ikke inficerede kirtler ligger normalt på 10-50.000 celler/ml og ved akut, klinisk mastitis kan dette forøges med op til en faktor 1000. Celler er koens og kirtlens svar på en infektion og indgår som en af de væsentligste elementer i immunforsvaret. Celletallet i en rask kirtel er domineret af makrofager (35-79%), efterfulgt af PMN (neutrofile granulocytter 3-26%), lymfocytter (10-24%), samt epitelceller (2-15%). Niveauerne er under stærk indflydelse af køernes fysiologiske stade. I den proinflammatoriske fase af klinisk mastitis udsender makrofagerne og epitelceller signalstoffer (bl.a. cytokiner), som medfører et influx af PMN til det inficerede område. PMN kan da udgøre >90% af cellerne i mælken. PMN lever et voldsomt, men kort liv (få timer) og vil foruden fagocytering af bakterier også medføre en nedbrydning af væv. PMN er formentlig korreleret med høj proteolytisk aktivitet. Andelen af makrofager øges herefter for at rydde op og det specifikke immunforsvar styrkes ved influx af lymfocytter. Antallet af PMN og makrofager i forhold til lymfocytter kan betegnes som inflammatorisk index. Bestemmelse af PMN kan således være et væsentligt redskab til at vurdere infektionsstadie. Måling af de forskellige typer af celler i mælk udføres i dag vha. flowcytometri, men er p.t. en arbejdskrævende proces. Nye og kroniske infektioner vurderet ud fra kocelletal Celletalsudskriften er den mest anvendte udskrift i malkekvægbruget. Udskriften giver en god oversigt over køer med normale celletal og med forhøjede og akut forhøjede celletal. Det er vigtigt at erkende, at man ikke kan vurdere koens yversundhedstilstand ud fra et enkelt celletal, man skal se på udviklingen over tid. Udskriften og beregningerne er baseret på et stort bagvedliggende datamateriale for ikke inficerede køer og vurderes til at være et mere nuanceret redskab end en vurdering af celletal over og under en tærskelværdi. Vores celletalsværdier er korrigeret for race, laktationsnummer, mælkeydelse, og afstand fra kælvning og er derfor et mere præcist redskab til at vurdere sundhedsstatus for den enkelte ko. Det kunne dog være en fordel, at der blev gjort mere ud af præsentation af data, hvor hovedbudskabet er at give et hurtigt overblik over besætningen frem for den enkelte ko, der er i fokus på celletalsudskriften. Begge dele er nødvendige, men overblikket over besætningen skal gives inden man giver information om den enkelte ko. Nedenstående er vist to eksempler på udskrifter baseret på celletalsværdier med anvendelse af et nyt præsentationskoncept. Figuren til venstre angiver årets gang for % køer med forhøjet og akut forhøjet celletalsværdier (Inf), % nyinficerede køer (akut forhøjet celletalsværdi), og andelen heraf der er førstekalvskøer (Nyinf 1). I figuren til højre er der set på samme parametre i forhold til afstand fra kælvning i dage. Andel inficerede køer over året Andel inficerede køer i laktationen 0,40 0,40 0,30 0,30 0,20 0,10 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Inf Nyinf Nyinf 1 Man kan yderligere få information ud fra celletallene ved at se på, hvor hurtigt celletallene normaliseres efter at de har været høje. Et forløb hvor tre prøver efter hinanden er lav-høj-lav peger overvejende på, at koen har haft klinisk mastitis forårsaget af miljøafhængige bakterier (S. uberis og coli). Et forløb med lav-høj-høj og eventuelt flere høje værdier tyder på, at koen er inficeret med koafhængige bakterier (S. aureus og S. dysgalactiae) (Haas et al., 2005). In-line måling af celletallet og beregninger af udviklingen vil kunne give meget stor viden om koens yversundhed og bruges til detektion af klinisk mastitis, sortering af mælk, bedømmelse af helbredelsesprocessen og vurdering af om koen skal udsættes. Der vil også med stor succes kunne vælges andre af de karakteristiske komponenter fra tabel 1 til denne bedømmelse, hvor det væsentligste bliver at bedømme et forløb nærmere end den enkelte værdi. Hvis in-line målingen skal 0,20 0,10 0,00 30 100 200 300 301 Inf Nyinf Nyinf 1
anvendes til sortering af mælk, så kræver det en præcis udpegning af køer med forandret mælk, hvor det især er kritisk for landmandens økonomi, hvis der udpeges for mange falske positive. Hvad er unormal mælk? For at firmaerne kan fremstille systemer til automatisk frasortering af unormal mælk, så er det nødvendigt at have en klar og veldefineret standard for, hvad der er acceptabelt. Dette har vi arbejdet med i et EU-projekt, hvor konklusionen er, at mælk som afviger i homogenitet fra det normale eller er tilblandet blod, skal frasorteres. Som reference for homogenitet filtreres formælken fra de enkelte kirtler gennem et filter med porestørrelsen 0.1 mm, hvilket svarer til størrelsen af hvad det menneskelige øje kan se. Hvis der på dette filter er klumper større end 2 mm, så er mælken fra den pågældende kirtel unormal. Hvis der er tilblandet mere end 0.1% blod i mælken, så vil man kunne skelne dette fra normal mælk og derfor bør dette også frasorteres. Celletallet indgår ikke i definitionen af normal og unormal mælk, fordi det ikke kan forlanges målt ved hver eneste malkning. Det er dog stadig et vigtigt mål for tankmælkens kvalitet. Disse nye referencemetoder er indarbejdet i et nyt forslag til ISO-standarder for automatisk malkning. Automatisk detektion af klinisk mastitis De fleste automatiske malkesystemer baserer detektion af mastitis på ændringer i mælkens ledningsevne. Den store fordel ved måling af mælkens ledningsevne er, at metoden er meget billig i drift og ikke kræver udtagning af specielle prøver under malkningen. De første undersøgelser viste, at 90% af inducerede kliniske tilfælde kunne findes ud fra ændringer i mælkens ledningsevnen. Denne sensitivitet faldt, når der skulle udpeges naturligt forekommende kliniske tilfælde, men var dog stadigt på et acceptabelt niveau. Problemerne med brug af mælkens ledningsevne som indikator har dog først og fremmest været kroniske infektioner, hvor udgangspunktet ikke er en rask kirtel med lave værdier, men høje og fluktuerende værdier. Bedre brug af avancerede software programmer har kunnet afhjælpe en del af disse mangler (Norberg, 2004), men systemernes evne til at udpege raske køer og kirtler som raske (= specificiteten) har ikke været høj nok til en automatisk sortering af mælken. Evaluering af AMS evne til detektion og fraseparering af unormal mælk Vi har testet alle AMS-modeller på det danske marked for deres evne til at udpege køer og kirtler med forandret mælk. Vi kan konkludere, at systemerne ikke er tilstrækkeligt sikre til en automatisk fraseparering af unormal mælk. Ved testen er det fundet, at der ved den aktuelle malkning udpeges fra 13 til 50% af tilfældene med unormal mælk (sensitiviteten) og der ville blive kasseret mælk fra op til 13% af malkningerne med normal mælk (100% minus specificiteten). De nuværende systemer er beregnet på udskrivning af en alarmliste og ikke på automatisk separering og ses der over et længere tidsforløb (en uge) forbedres sensitiviteterne markant, desværre i nogle tilfælde på bekostning af specificiteten. Vi konkluderer, at mange af systemerne kunne drage fordel af en forbedret brug af moderne algoritmer og filtrering af data. Vi har testet et system på det danske marked med udstyr til automatisk at fraseparere mælk med blod. Systemet fungerer godt og kan fraseparere mælk med mere end 0.1% blod, når blodet er opblandet homogent. Tabel 2. Sensitivitet (SE) og specificitet (SP) for udpegning af unormal og normal mælk fra køer ved en aktuel malkning, i testdøgnet, eller foregående uge i 6 besætninger. Aktuel malkning Testdage Foregående uge Besætn. SE SP SE SP SE SP 1 33 99 100 89 100 85 2 28 100 36 100 43* 100* 3 17 96 33 92 100 55 4 13 87 22 85 67 62 5 50 87 60 87 100 35 6 50 99 100 99 100 83 * Data kun fra 3 dage. Der ligger en stor udfordring i at opnå en sikker udpegning af køer og kirtler med unormal mælk (sensitivitet >70%) uden at der samtidigt fejlagtigt udpeges for mange dyr med normal mælk (specificitet > 99.5%). Mange firmaer er undervejs med udvikling af nye sensorer og der arbejdes på at indbygge in-line systemer både til brug for automatisk sortering af mælken, men også til at give landmanden et bedre management redskab. Dette vil være til gavn for såvel økonomi som for mælkens kvalitet.
Litteratur Haas, Y. de, Barkema, H.W., Schukken, Y.H. & Veerkamp, R.F. 2005. Associations between somatic cell count patterns and the incidence og clinical mastitis. Prev. Vet. Med. in press. Hillerton, J.E. 2000. Detecting mastitis cow-side. Natl. Mastitis Council Ann. Meet. 39:48-53. Korhonen,H. & Kaartinen,L., 1995. Changes in the composition of milk induced by mastitis. In: Sandholm, M., Honkanen-Buzalski T., Kaartinen, L., and Pyörälä, S. (Eds.), The bovine udder and mastitis, Univ. of Helsinki, Faculty of Veterinary Medicine, pp. 76-82. Norberg, E. 2004. Elektrisk ledningsevne i mælk som en indikator på mastitis. KvaegForskning.dk KvægInfo nr.: 1452 Dansk Kvæg