Biologisk kontrol: Coating af frø med gram-negative bakterier www.maribo.com Hans Chr. Pedersen DanSeed Symposium, 26-27 februar 2008
2 Frø og mikroorganismer Mikroorganismer er naturligt forekommende i de miljøer, hvor frø udsås Der er normalt op til 10 8 (100.000.000) mikroorganismer/gram muldjord I relation til frøspiring og plantevækst er mikroorganismer Positive (Vækststimulerende; Beskyttende) Negative (Væksthæmmende; Patogene) Neutrale (- Eller næsten neutrale; Langt de fleste arter) Anvende positive mikroorganismer til Biologisk kontrol (BCA s) Vækststimulering (PGSA s) ved tilførsel til vækstmediet eller direkte på frø inden udsåning Frøteknologiske muligheder (Specielt sukkerroefrø)
3 Mikroorganismer på frø SCREENING OG SELEKTION Gram-negative bacterier Multiplikation Stabilisering Bærestof (Carrier) Applicationpåfrø Lagring Stabilitet i carrier Stabilitet på seed Produkt funktionalitet
Gram-negative bakterier Gram-negative bakterier Har i forsøg vist stort potentiale både som BCA s og som PGSA s Desværre ikke videre udtørringstolerante (A W > 0,95) Pseudomonas fluorescens DS04.1980 Vigtige slægter som Pseudomonas og Rhizobium er Gram-negative bakterier. P. Fluorescens DS 04.1980 er en siderophore-producerende stamme. (Siderophorer er metalbindende molekyler). Nogle siderophorer er kendt for at kunne inducere resistens i planter. Minimal medium Rich medium 4
5 Selektion af kandidater Biocontrol agents (BCAs) mod rodbrand sygdomme i sukkerroer Plant growth stimulating agents (PGSAs) Rhizoctonia solani DS00.0103
6 Selektion af kandidater Biologiske kriterier for mikro-organismen Væksten skal begynde straks efter såning Hurtig vækst på og langs plantens rødder Vækst og aktivitet ved tilstedeværelse af insekticider og evt. fungicider. Ingen konkurrence med frøet/småplanten om næringsstoffer og ilt m.v. I tilstedeværelsen af naturligt forekommende mikroorganismer skal den være den dominerende kolonisator på det spirende frø og i rhizosphæren. Ingen fytotoksisk effekt Stabil under varierende mark- og vækstbetingelser
7 Selektion af kandidater Produkt- og produktions kriterier Lang holdbarhed (Shelf-life) på frøet (> 6 måneder) Ingen negativ effekt på pille (Såbarhed) Ingen negativ effekt på pille-komponenter Ingen negativ effekt (f.eks. nedbrydning) på tilsatte insekticider og fungicider Lønsom produktion Let at håndtere Opfylde sikkerhedsforskrifter / Miljøvenlig.
8 Carrier teknologi Sukkerroefrø Pilleret Bakterierne lægges i et bærerstof en carrier der er egnet til coating af frø. Vandaktiviteten (A W ) i denne carrier er meget lav. Carrier Pilleret og coated
ProSeed Carrier system FE 2005 Bakterie Carrier Seed 00.0103 9,95E+08 7,50E+04 01.0155 4,95E+08 5,90E+04 04.1014 1,37E+08 4,37E+04 04.1026 1,34E+08 5,25E+04 04.1101 6,10E+08 4,20E+03 04.1128 2,15E+08 3,98E+03 04.1246 7,25E+08 5,03E+04 04.1278 4,50E+08 2,13E+03 04.1406 9,05E+08 8,58E+04 04.1411 4,60E+08 4,58E+04 04.1486 4,80E+08 5,34E+04 04.1513 4,45E+08 4,10E+04 04.1691 7,55E+08 2,13E+03 04.1720 1,41E+09 8,68E+04 04.1754 4,20E+08 2,84E+04 04.1772 8,35E+08 9,98E+03 04.1873 9,80E+08 7,10E+04 04.1874 7,50E+08 7,74E+04 04.1942 1,33E+09 1,83E+03 04.1980 7,65E+07 4,04E+04 04.1981 6,25E+08 7,18E+03 04.2113 7,75E+07 1,77E+04 04.2157 1,40E+08 3,44E+04 04.2171 6,85E+08 6,13E+04 04.2179 4,10E+08 2,90E+04 04.5019 1,13E+09 1,20E+04 04.5021 1,45E+09 9,80E+04 04.5022 1,15E+09 1,25E+05 04.5023 1,05E+09 1,10E+05 04.5030 4,45E+08 3,40E+04 Carrier 10 8-10 9 CFU/gram Frø ~ 5. 10 4 CFU/frø Shelf-life > 1 år Ingen negative indvirkninger på Pellet komponenter (fungicider + insecticider) Lagringsevne Såbarhed Spiring og etablering Sikkerhed 9
10 Carrier system - Shelf-life efter coating på frø CFU/Enkeltfrø 100.000 10.000 1.000 100 10 +PEMF Std 1 0 60 120 180 240 300 360 Dage PEMF-behandling af bakteriekulturen resulterer i overlevelse på frø i tilstrækkeligt lang tid tilstrækkeligt højt antal til praktisk anvendelse
11 BioFields PEMF-behandling Ps. Fluorescens DS96.578 Effect on survival on seeds: Exposure of cells to PEMF before coating onto seeds. 100.000 10.000 55V Suboptimal carrier. Seeds stored at 10 o C. CFU/frø 1.000 100 Dage 2 32 71 PEMF = 10 369 Pulserende Elektro-Magnetiske Felter ved extremt lav frekvens 1 0 Ctrl. 1,5 4 6 8 12 24 48 369 71 32 2 Varighed af PEMF behandling (timer) Lagringstid (Dage) Beskyttet teknologi: BioFields ApS (US-pat. 6,561,968), Danisco A/S (WO2005095579)
12 BioFields PEMF-behandling Ps. Fluorescens DS96.578 Effect on survival on seeds: Exposure of cells to PEMF before coating onto seeds. 1.000 Suboptimal carrier. Seeds stored at 10 o C. Faktor 100 Dage 32 71 10 369 1 Relativt til overlevelse af ikke-pemf ede celler (0 timer = 1) 0 1,5 4 6 8 12 24 48 32 71 369 Varighed af PEMF-behandling (timer) Lagringstid (Dage) Beskyttet teknologi: BioFields ApS (US-pat. 6,561,968), Danisco A/S (WO2005095579)
13 Overlevelse i carrier og efter coating på frø Log(CFU/g) ; Log(CFU/frø) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Average values from processing 30 different gram-negative strains a b c Treatment of carrier x bacteria at loading (drying) Carrier Carrier 1y Seed Seed 1y
14 Relativ overlevelse 70% 60% Average values from processing 30 different gram-negative strains 61% 50% 43% 40% 30% 29% 25% Carrier 1y Seed 1y 20% 10% 0% 9% 7% 3,5. 10 3 1,3. 10 4 5,4. 10 3 a b c Start CFU/frø: 4. 10 4 5. 10 4 8. 10 4
15 Frø applikation Fordeling på frø Enkeltfrøanalyse Enkelt-frø 1.000.000 100.000 91.700 CFU/frø 10.000 1.000 100 10 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 MC4/362 avg 362 Frø # Frø no.
16 Funktionalitet Migrerer de rodkoloniserende mikroorganismer fra coatingslaget på pillen ned til kimplantens rødder?
17 Kolonisering på rødderne Immunoblotting Sukkerroefrø coated med DR54: Kimplante høstet fra jord og blottet på papir Genkendelse med antistoffer mod Pseudomonas fluorescens stamme DR54 Konklusion: Mikroorganismerne migrerer fra frø til rod
Forsøgsresultater 18
19 Forsøgsresultater Væksthus (Pythium) Trial 3 Pathogen Pythium ultimum Plant Sugar beet POT SCREENING OF BCAs 06.12.2004 Percent 100 90 80 90 70 80 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 Kontrol 10 10 00 HCP5/0054 HCP5/0055 HCP5/0056 HCP5/0057 HCP5/0058 Low High disease disease pressure pressure of of Pythium Pythium ultimum ultimum Diseased Low High diseased Low High healthy Healthy Pillerede/coatede sukkerroefrø
20 Forsøgsresultater Væksthus (Rhizoctonia) Trial 1 07.12.2004 Pathogen Rhizoctonia solani Plant Sugar beet POT SCREENING OF BCAs Percent 100 70 90 60 80 50 70 60 40 50 30 40 Kontrol 20 30 20 10 10 00 HCP5/0054 HCP5/0055 HCP5/0056 HCP5/0057 HCP5/0058 Low High disease disease pressure pressure of of Rhizoctonia Rhizoctonia solani solani Diseased Low High diseased Low High healthy Healthy Pillerede/coatede sukkerroefrø
21 Forsøgsresultater Mark, YT 2003 HCPYT025 2003 Vilhelmsdal, Falster DK WSY, relative to F0 105 104 103 102 101 100 99 98 97 + + + + FT 96.297 00.105 FTH DR54 FH Gnsnt. af 3 varieteter, Lattice design, 4 reps. 00.103 01.116 01.109 00.102 00.135 F0 Treatment FXX: T = Thiram 6gai/U, H = Hymexazol 14,7gai/U, 0 = Uden fungicider. Alle coated med Imidacloprid 60gai/U.
22 Forsøgsresultater Mark, YT 2003 (mix) HCPYT023 2003 Vilhelmsdal, Falster DK WSY, relative to F0 105 104 103 102 101 100 99 98 97 + + + + + + FT BL3 FTH BL9 BL8 BL2 BL5 BL1 BL7 BL6 BL4 F0 Treatment Gnsnt. af 3 varieteter, Lattice design, 4 reps. FXX: T = Thiram 6gai/U, H = Hymexazol 14,7gai/U, 0 = Uden fungicider. Alle coated med Imidacloprid 60gai/U.
23 Forsøgsresultater Mark, YT 2005 (GEP) White sugar yield (WSY) 1. Standard (P0; P3) 2. 04.5019 (P0; P3) 3. 04.5030 (P0; P3) ES (3) DE(5) DK(4) All(12) 100,0 100,0 100,0 100,0 100,4 100,3 101,1 100,6 104,2 ++ 101,1 101,2 101,9 ++
Andre applikationer - Gulerod Carrot - PMI trial 2003 24
25 Andre applikationer - Lucerne Alfalfa Piller med Rhizobium carrier Piller med 0-carrier
26 Konklusion Selektion Microorganismer der kontrollerer rodråd i sukkerroer er selekteret Teknik System til applikation af mikroorganismer på frø PEMF-behandlede mikroorganismer kan lagres i lang tid på frø Efter såning Mikroorganismer kan migrere fra frø-coatingen og kolonisere rødderne Mikroorganismerne kan kontrollere angreb af rodråd i sukkerroe-marker Mikroorganismerne er virksomme sammen med fungicider på frøet