Mad og mikroorganismer

Mad og mikroorganismer Nr. 2 Escherichia coli 0157 i okse- og svinekød fra detailleddet i Danmark sept.-nov. 1996

Escherichia coli 0157 i okse- og svinekød fra detailleddet i Danmark sept.-nov. 1996 er udgivet som nr. 2 i serien Mad og mikroorganismer Veterinær- og Fødevaredirektoratet Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri September 1997 ISSN nr. 1397-5404 Veterinær- og Fødevaredirektoratet Mørkhøj Bygade 19 2860 Søborg

Forekomst af Escherichia coli 0157 i fersk hakket okse- og svinekød udtaget i detailleddet i Danmark Resultater af en landsdækkende screenings-undersøgelse udført i september-november måned 1996 Sammendrag De 32 danske levnedsmiddelkontrolenheder har i samarbejde med Levnedsmiddelstyrelsen undersøgt 2112 prøver af hakket okse ( 15R4) og svinekød (524) for forekomst af Escherichia coli 0157. Undersøgelsen resulterede i, at der fra 7 prøver blev isoleret E. cnli 0157 (0,3%). Fire slammer, to fra oksekød (H7 og H- ) (0, 1%) og to fra svinekød (H7 og H- ) (0,4%), produ~erede verotoksin (VT). De VT positive stammer besad adhæsionsgenet eae og et stort plasmid pli (in MDa. De tre VT negative E. coli O I 57 stammer fordelte sig på ro svinekøds og en oksekødsprøve. De tre stammer var ikke H7 (H- og Hro) og besad ikke adhæsionsgenet. De ro svinkødsprøver. der var konwminerede med verotoksin produ<.:erende E. coli 0157, indeholdt et kvæg spe~ifikt protein som blev påvist ved en ELISA metode. Dette indikerer, ar der har været små mængder af oksekød i de to svinkødsprøver. Screeningsundersøgelsen viser, at der kan isoleres E. coli 0157: H7/H- fra hakket kød i Danmark. Endvidere viser undersøgelsen, at andre typer end oksekød kan være kontaminerede med E. coli O I 57, muligvis på grund af krydskontamination i detalleddet. Baggrund Verotoksin (VT) producerende EscherichilJ m/i serotype 0157:H7 (VTEC 0157) blev førsre gang registreret som årsag til levnedsmiddelbllrne udbrud i 19M2 i USA. hvor kontaminerede hamburgers fra samme "fast-food" restaurant kæde gav anledning ril humane tilfælde af blodig diarre. Siden da er der internationalt rapporterer om mange sporadiske såvel som store levnedsmiddel bårne udbrud (I). Senest har VTEC O 157 givet unledni ng til omfattende levnedsmiddelbårne udbrud i Japan og Skotland.

Danmark har hidtil været forskånet for store udbrud af VTEC 0157. I perioden 1986-96 har Colilaboratoriet ved Statens Seruminstitut diagnosticeret 23 sporadiske tilfælde. Sverige havde indtil 1995 en tilsvarende VTEC 0157 situation, men i efteråret 1995 blev der pludselig diagnosticeret 10-15 tilfælde om ugen. Frekvensen af registrerede tilfælde vedblev at være høj indtil begyndelsen af 1996, hvorefter niveauet stabiliserede sig til 1-2 tilfælde om ugen gennem hele 1996. Kilderne til udbruddene blev aldrig klarlagt, rnen enkelte tilfælde blev tilskrevet rå mælk fra en VTEC 0157 inficeret kvægbesætning (Personlig meddelelse, Yvonne Anderson, Smittskyddsinstitutet, Stockholm). Den markante stigning i antallet af VTEC 0157 infektioner, fra få om året til 1-2 om ugen, kunne tyde på, at antallet af VTEC 0157 infektioner var underrapporteret i Sverige indtil udbruddet. E. coli 0157:H7 og 0157:H' (H antigener er knyttet til flageller hvilket i praksis betyder at ubevægelige stammer ikke er H typbare) betegnes sammen med nogle få andre VTEC serotyper (primært 026 og 0111) som enterohæmorrhagiske E. cou (EHEC). Benævnelsen referer~r til symptomerne ved infektion som typisk er blodig diarre, men infektionen kan også vise sig ved ukompliceret vandig diarre eller symptomfri udskillelse. I et varierende antal tilfælde ledsages infektionen af livstruende komplikationer, ofte i form af hæmolytisk uræmisk syndrom (HUS), der er karakteriseret ved akut nyresvigt, eller sjældnere i form af thrombotisk thrombocytopenisk purpura (TrP) (2). VTEC O 157 er kendetegnet ved at producere bakteriofagmedierede toksiner, VTl og eller VT2, der kan dræbe veroceller - en nyre cellelinie fra den afrikanske vero abe. Toksinet er strukturelt og biologisk nært beslægtet med shiga toksinet, som produceres af Shigella dysen/eria type l og betegnes enten verotoksin, verocytotoksin (VT), "shiga like" toxin (SL T) eller blot shiga-toksin (ST). Verotoksin dannes af mange forskellige E. cou serotyper som fælles betegnes veroroksin producerende E. cou. Mere en 160 forskellige O:H serotyper er erkendt VT producerende men det sygdomsmæssige potentiale er ikke afklaret for alle O:H serotyper. Der er dog voksende international opmærksomhed omkring andre VTEC (EHEC) serotyper end 0157. Patogeniteten af VTEC serotype 0157 og de øvrige VT producerende E. cou knyttes til toksin produktion samt adhesive egenskaber. Ved infektion koloniseres den bagerste del af tarmen og mange VTEC stammer forårsager en karakteristisk ødelæggelse af tarmepithelceller, betegnet "attaching and effacing" (AE) læsioner. VTEC stammer producerer ofte enterohæmolysiner der er kendetegnet ved at kunne lysere vaskede fåreerythrocytter. For E. cou O 157:H7 stammer er det endvidere karakteristisk, at stammerne ofte besidder et plasmid på 60 MDa. VTEC O 157 udbrud associeres ofte til levnedsmidler af bovin oprindelse og utilstrækkeligt varmebehandlet hakket oksekød er ofte det inkriminerede levnedsmiddel. Upasteuriseret mælk, 2

æblecider Uuil:e), yoghurt, spirer, vand, spegepølse, hjortekød, badevand mv. er ligeledes rapporteret at være kilder til udbrud (I). Drøvtyggere, og i særdeleshed kvæg, udgør hovedreservoiret for VTEC 0157. I undersøgelser af kvæg rapporteres der typisk en VTEC 0157 prævalens på omkring en procent (I). På denne baggrund besluttede Levnedsmiddelstyrelsen i samarbejde med de 32 kommunale levnedsmiddelkontrolenheder. at der skulle udføres en landssneening for forekomst af verotoksin produ<:erende E. ('oli O 157 i danske levnedsmidler i 199(\. Screeningens fonnål var. at bidrage med tal for forekomst af E. coli 0157 i råvarer samt at bibringe levnedsmiddelkontrolsystemet rutine i isolationsteknikken for E. coli O 157 og denned etablere et metodemæssigt beredskab til håndtering af et eventuelt udbrud i Danmark. Forløb Som forberedelse til s<:reeningen arrangerede Levnedsmiddelstyrelsen en kursusdag. hvor E. coli 0157 påvisningsmetoden blev gennemgået i praksis. Alle laboratorier var repræsenteret ved kursusdagen. Screeningen blev gennemført i september, oktober og november måned 199(\, hvor 2112 prøver, fordelt på 15X4 okse- og 52X hakkede svinekødsprøver. blev undersøgt. Alle prøver blev indsamlet fra detailleddet. Prøvefordelingen mellem de 32 levnedsmiddelkontrolenhederne afspejlede enhedernes befolkningsmæssige underlag med 192 som det højeste og 4R som det mindste antlll prøver. Ved analyserne blev 25 gram kød undersøgt ved opformering i (\ timer ved 37 C i fosfat bufferet peptonvand efterfulgt af udsæd på sorbitol MacConkey agar (SMAC) tilsat cefixime og tellurit (CT-SMACl (3). For I(\X4 af de 2112 prøver blev der udført en immunomagnetisk separationstrin, hvor en milliliter opformeringskultur blev oprenset ved anvendelse af Dynabeads anti-e. coli 0157 (Dynal A/S, Norge). Den affinitetsoprensede kultur blev sået ud på SMAC og CT-SMAC. Efter inkubation ved,17 C natten over blev agarpladerne aflæst. Suspekte sorbitol negative kolonier på SMAC og CT-SMAC blev verifkeret med 0157 antiserum. Agglutinerende kolonier blev rendyrket, identificeret som E. coli og sendt til Levnedsm iddelstyrel sen. En non-verotoksinprodul:erende sorbitol negativ E. coli 0157:H7 stalllllle (ATTC 43RHH) blev anvendt som positiv kontrolstamille. En podet kødprøve blev analyseret parallelt med alle undersøgelser SOIll kontrol. Ved Levnedsmiddelstyrelsen blev de tilsendte stammer verificeret som E. coli ved standard 3

morfologiske og biokemiske tests, herunder enterohæmolysinproduktion, sorbitol forgæring og ~-glucoronidase aktivitet. Colilaboratoriet ved Statens Seruminstitut verificerede O antigenet og fastlagde H antigenet. Stammerne blev undersøgt for verotoksingener ved PCR analyse (4) og verotoksinproduktion ved et verocelle assay. Toksintype (VT1/VT2) (5,(\) og tilstedeværelse af genet for adh,~sinet intimin (l!uea) blev fastlagt ved PCR analyse (7). Stammerne blev plasmidprofileret og typet ved Xhul restriktions profiler af total DNA ved puls felt gel elektroforese (PFGE). To af de undersøgte svinekødsprøver blev undersøgt for forekomst af et specifikt bovint serumprotein. Disse undersøgelser forstod Veterinær Direktoratets Laboratorium i Ringsted. Resultater Ved landsscreeningen blev der i alt undersøgt 2112 prøver fra detailleddet fordelt på 15X4 hakkede okse og 52X hakkede svinekødsprøver. Ti prøver blev fundet positive for E. co/i 0157. Resultaterne af laboratorieanalyserne for de ti stmnmer angivet i tabel I. Fire stammer (O,2'K), to fra oksekød (H7 og H-) (0,1 'Ic) og to fra svinekød (H7 og H-) (O.4'k) var verotoksinproducerende. Alle fire stammer producerede VT2 og en stamme producerede endvidere VTI. De fire VT positive stammer havde adhæsingenet eaea og indeholdt et plasmid på C)O kilobaser. Stammerne var enterohæmolysinproducerende, sorbitol negative og udviste ingen ~-glucoronidase aktivitet. X/w I PFGE profilerne var forskellige hvorfor der sandsynligvis er tale om forskellige kloner af E. coli O 157. De VT positive svinekødsprøver var kontaminerede med et bovint serumprotein. En af prøverne indeholdt mere end I'le oksekød mens den anden prøve var kontamineret i niveauet O,05'k okse i svinekød. Seks af de isolerede E. co/i O157 stammer producerede ikke verotoksin. Tre af disse stammer kunne ikke adskilles fra kontrolstammen. De resterende VT negative stammer blev isoleret fra to svine- og en oksekødsprøve. Ingen af disse stammer var H7 (H- og 1-11'0) og de tre stammer indeholdt ikke adhæsingenet. Kommentarer til resultater Den danske screeningsundersøgelse viser, at levnedsmiddelkontrolenhederne kan isolere E. co/i 0157:H7 og H- fra hakket kød udtaget i detailleddet. Karakteriseringen af de isolerede E. co/i O 157 viser, at de verotoksinproducerende stammer har de karakteristika som man forbinder med sygdomsfremkaldende VTEC O 157: Besiddelse af eal' genet, indhold af et stort plasmid samt enterohælllolysinproduktion. De VT negative isolater er derimod med stor sandsynlighed harmløse for mennesker. 4.J

Da VT positive E. coli O 157 er isoleret fra dansk kvæg er det ikke overraskende, at hakket oksekød også kan være inficeret. Svin regnes ikke som reservoir for VTEC O 157 og en sandsynlig forklaring på tilstedeværelse af VTEC 0157 i hakket svinekød er krydssmitte fra oksekød. I den foreliggende undersøgelse understøttes dette af, at man kan pavise et specifikt bovint serumprotein i de to positive svinekødsprøver. I detailleddet hakkes kød fra forskellige dyrearter og af forskellig mikrobiologisk status i samme maskine og derfor ma krydssmitte mellem hakkede kødprodukter ofte påregnes. Screeningsundersøgelsen viser, at der er en lav pra:valens af VTEC O 157 i hakkede kødprodukter. Til trods for at VTEC O 157 kan isoleres fra levnedsmidler, og mennesker dermed eksponeres for bakterien, giver forekomsten sig stort set ikke udslag i registrerede humane infektioner. Resultaterne i undersøgelsen er direkte sammenlignelige med en tilsvarende undersøgelse som Statens nærringsmiddeltilsyn og det kommunale næringsmiddeltilsyn udførte i Norge i 1996. Her blev 1323 prøver af kjøttdeig undersøgt. Fra en prøve blev der isoleret E. coli 0157 som ikke producerede verotoksin. I USA gennemførte U.S. Departrnent of Agriculture (USDA) en undersøgelse af 50()() oksekødsprøver fordelt på 25()O fra slagteri- og engros leddet og 2500 fra detailleddet ved et dipstick immunoassay med tre positive prøver til følge (2). VTEC 0157 er tidligere isoleret fra svinekød i en amerikansk undersøgelse (K). men som i Danmark er der stor sandsynlighed for at disse fund også kan tilskrives krydskontamination. Dette støttes af netop offentliggjorte tal fra USDA. hvor E. ('oli 0157 ikke kunne påvises ved undersøgelse af 4229 fæcesprøver fra svin. Isolering af E. coli O 157 der ikke producerer verotoksin er ligeledes velkendt (91 og dette forhold understreger betydningen af omhyggelig karakterisering af E. ('oli 0157 isola ter. Som opfølgning af 1996 screeningundersøgelsen for VTEC O 157 gennemføres en tilsvarende undersøgelse i 1997. Denne undersøgelse vil tilvejebringe nye opdaterede prævalenstal og forøge den melodem(~ssige rutine i påvisningen af E. coli 0157. I'e(eril/ær- og Fødel'Orl'dire/"(ora(e( \'il gerne {((Ul' 11'1'I/ed.vmiddl'lko/llrolel/!redef//e jor deltagelse i s<ti'i!/iil/gsprojek(i!/. 5

Referencer I. Armstrong GL. Hollingsworth J, Morris, Jr. Emerging foodborne pathogens: Escherichia coli O 157:H7 as a modelof entry of a new pathogen into the food supply of the developed world. Epidemiologil: Reviews 1990: I R:29-51. 2. Karmali MA. Infel:tion by verol:ytotoxin-produl:ing E.I'cherichia coli. C1inil:al Microbiological Reviews 19X9:2: 15-311. 3. Zadik PM. Chapman PA. Siddons CA. Use of tellurite for the seleclion of verocytotoxigenic E.\ cherichia coli O 157. Journal of Medieal Microbiology 1993:39: 155-15X. 4. Read Se. Clarke Re. Grandis SA. de. Hii J. McEwen S. Gyles CL. Polymerase chain real:lion for deleuion of verol:ytoloxigenic E.I'chrrichia coli isolated from animal and food sourl:es. Molel:ular and Cellular Probes I 992:fi: 153-1 fi I. 5. Pollard DR. Johnson WM. Lior H. Tyler SD. Rozee KR. Differenlialion of shiga toxin and vero l:ytoloxin type I genes by polymerase chain reaclion. Journal of Infectious Diseases 1990; I fi2: IIY5- IIYX. fi. Olsvik ø. Rimsrad E. Hornes E. et al. Anested PCR followed by magnetil: separation of alllplified fragments for detection of E.~cherichia coli shiga-like toxin genes. Molecular and Cellular Probes ly':! I :5:42Y-435. 7. Louie M, de Azavedo J. Clarke R. et al. Sequenl:e heterogeneily of the eae gene and deteetion of verotoxin-produl:ing Escl!erichia coli using serotype-specific primers. Epidemiol Infecl 1994; I 12:449-4fi I. X. Doyle MP, SdlOeni JL. Isolation of Escherichia coli 0157:H7 from retail fresh meats and poultry. Journal of Clinil:al Mil:robiology IYX7:53:23Y4-23%. Y. Willshaw GA. Smith HR. Roberts D. Thirlwell J. Cheasty T. Rowe B. Examination of raw beef produl:ts for the preseike of Vero cytoloxin producing Esclll!richia coli. partkularly those of serogroup 0157. Journal of Appl ied Bal:leriology IYY3:75:420-42fi.

Tabel I: Indsendte isolater ved E. coli 0157 landsscreeningen 1996. Der blev ialt undersøgt 21 12 prøver fordelt på 15R4 okse- og 528 svinekødesprøver LST nr. Oksel Svin Plasmid (kb) PCR/VCA (Toksin type) Serotype/Glu/Entero eae 95A O 90 +1+ (2) O I 57:H7/Glu-/Entero+ + 57H S' 90. 50 +1+ (2) O I 57:H-/Glu-/Entero+ + 25V O 90 +1+ (l +2) O I 57:H-/Glu-/Entero+ + 41H S' 90 +1+ (2) O I 57:H7/Glu-/Entero+ + 2XA O 90, (io, IO -1 Ol 57:H-/Glu-/Entero - 22V S 90,60, 10 -I O I 57:H"'/Glu-/Entero - 2(iH S 90, IO -I O I 57:H-/Glu-/Entero - X3V O kontrol? -1 Ol 57 :H7/Glu-/Entero+ - 89S O kontrol? - - - 47R O kontrol? - - -. Positive for bovint serumprotein ved ELISA test 7