1 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, 4700 Næstved

Transkript

1 1 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190,

2 2 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, Indhold Realtime PCR på β-actin... 3 CSI og retsgenetik... 3 Mutations diagnostik af hereditær hæmokromatose med PCR og restriktions-analyse PCR bestemmelse af methicillin resistente stafylokokker (MRSA)... 4 Western blot på det udtrykte resistens gen (PBP2a) fra methicillin resistente stafylokokker (MRSA)... 5 ELIZA af antistoffer fra Borrelia... 5 ELIZA af antistof og antigen fra HIV... 6 SDS polyacrylamid gel elektroforese page af Stafylokokker eller væv... 6 Oprensning af proteiner fra blod eller væv... 6 Oprensning af proteiner fra methicillin resistente stafylokokker (MRSA) og westernblot... 7 ISO elektrisk fokusering af fra proteiner fra blod D gelektroforese af E. coli... 7 Mikrobiologi identifikation af bakterier... 8 Mikrobiologi fænotypisk og genotypisk identifikation af bakterier... 8 Enzymatisk og spektrofotometrisk bestemmelse af Glucose Enzymatisk og spektrofotometrisk bestemmelse af alkalisk fosfatase Spektrofotometrisk måling af lægemidler HPLC analyse af lægemidler... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. HPLC analyse af nikotin... Fejl! Bogmærke er ikke defineret.

3 3 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, Realtime PCR på β-actin I øvelsen bestemmes koncentrationen af β-actin genet i en ukendt human DNA-prøver. Der analyseres på en ukendt prøve som sammenlignes med en standardrække af kendt humant DNA. Sigtet med øvelsen er at vise, hvordan man kvantitativt bestemmer DNA med PCR. Desuden kan de studerende visuelt se, hvordan DNA i PCR-reaktion amplificeres eksponentielt. Opsætning af realtime PCR på β- actin genet. Anvendelse af standardkurver i analyser Gennemgang af princip for realtime PCR Smeltepunktsanalyse af DNA (PCRprodukter) CSI og retsgenetik Retsgenetik anvendes til at identificere personer i forbindelse med forbrydelser og faderskabssager. I øvelsen laver vi en forbryderjagt blandt de deltagende studerende. PCR-øvelsen demonstrerer, hvordan DNA oprenses fra kindskrab og analyseres med PCR. Efterfølgende analyseres PCR-produkter med gelelektroforese. Øvelsen kan kombineres med en smeltepunktsanalyse af DNA og/eller en diskussion om allele gener i populationer. på øvelsesdagen Oprensning af DNA fra kindskrab Anvendelse af standard kurver i analyser Gelelektroforese Evt. smeltepunktsanalyse af DNA (PCR- produkter) Gennemgang af princip for realtime PCR

4 4 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, Mutations diagnostik af hereditær hæmokromatose med PCR og restriktionsanalyse. Hereditær hæmokromatose er en af de genetiske sygdomme i Danmark med stor prævalens. I 1996 blev kandidatgenet for hereditær hæmokromatose,hfe, identificeret. Tre meget hyppige mutationer er fundet (C282Y, H63D og S65C). Genet koder for et transmembrant protein, som er involveret i reguleringen af det intracellulære jernniveau. Hereditær hæmokromatose skyldes en abnorm ophobning af jern fra tyndtarmen i forskellige organer, så deres funktion hæmmes. Specielt lever, hjertemuskulatur og bugspytkirtel rammes og kan medføre skrumpelever og bronzediabetes, hvor der ses en gylden farvning af huden. PCR på HFR-genet Restriktionsanalyse af HFR-genet Gelelektroforese Postanalyse af gel Evt. smeltepunktsanalyse af DNA (PCR-produkter) PCR bestemmelse af methicillin resistente stafylokokker (MRSA) Hospital infektioner forårsaget af MRSA har været et stigende problem rundt om i Europa de sidste 10 år. I 2006 indførte Holland og England MRSA handlingsplaner for at mindske antallet af døde i forbindelse med infektioner forårsaget af MRSA. I 2007 indførte Danmark en MRSA handlingsplan for at undgå samme situation som i Holland og England. PCR analysen vil være en PCR eller Multiplex PCR på komplekse blandet bakterieprøver fra næsen. Oprensning af DNA fra attenueret MRSA PCR af SSCmec kassetten Gelelektroforese Postanalyse af gel Evt, smeltepunktsanalyse af DNA (PCR produkter) 2-5 timer

5 5 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, Western blot på det udtrykte resistensgen (PBP2a) fra methicillin resistente stafylokokker (MRSA) Hospitalsinfektioner forårsaget af MRSA har været et stigende problem rundt om i Europa de sidste 10 år. I 2006 indførte Holland og England MRSA handlingsplaner for at mindske antallet af døde i forbindelse med infektioner forårsaget af MRSA. I 2007 indførte Danmark en MRSA-handlingsplan for at undgå samme situation som i Holland og England. I øvelsen sammenlignes en MRSA med en følsom stafylokok. For at undersøge om stafylokokker udtrykker resistensgenet meca, og derved bliver resistens overfor β-laktam antibiotika, undersøges indholdet af det udtrykte gen med western blot. Fremstilling af groft celleekstrakt (stafylokokker fra attenueret MRSA) SDS gelelektrofores af groft celleekstrakt Farvning af gel Western blot Antistof påvisning af PBP2a Over flere dage og det aktuelle tidsforbrug er 4-6 timer ELISA af antistoffer fra Borrelia Skovflåter kan ved bid overføre bakterien Borrelia burgdorferi, der kan medføre sygdommen borreliose. Når flåten bider i menneskets hud, kommer bakterien over i huden og spredes via hudens små blodkar til omkringliggende væv, hvilket ses som en ringformet udbredelse. Herefter kan Borrelia burgdorferi spredes til resten af kroppen via blodbanerne. Sygdommen kan medføre symptomer som muskel- og ledsmerter, betændelse af nervebanerne (neuroborreliose), meningitis og nervelammelser - oftest i ansigtsnerverne. Håndtering af pipetter ELISA af antistoffer fra Borrelia Præsentation om sygdom og symptomer 2-3 timer

6 6 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, ELISA af antistof og antigen fra HIV To typer humane immundefektvira, HIV 1 og HIV 2, er beskrevet og angivet som årsag til erhvervet immundefektsyndrom (AIDS). Begge er retrovira, der overføres ved eksponering af bestemte inficerede kropsvæsker, primært blod og kønssekreter, og ved smitte fra moderkagen. Analysen bygger på påvisning af både antigener og antisoffer i humant blod. Følgende antistoffer og proteiner påvises: A)Påvisning af antistoffer over for epitoper fra kappen af HIV 1 og HIV 2; B) Påvisning af antistoffer mod GAG eller Pol-proteiner; C) Påvisning af antistoffer mod epitoper fra kappen af HIV 1subtype; D) Påvisning af HIV-core protein p24 Håndtering af pipetter ELISA af antistof og antigen fra HIV Præsentation om ELISA og Antistof Oprindelse og fylogeni af HIV 2-3 timer SDS polyacrylamid gelelektroforese page af Stafylokokker eller væv SDS page er en analyse, der ofte anvendes i forskning for at analysere mængden af protein i prøver i forbindelse med fx oprensning af proteiner eller Westernblot. Analysen separerer proteiner efter størrelse. Fremstilling af groft celleekstrakt fra bakterier eller væv Gelelektroforese af bakterier eller væv Farvning af gel Præsentation om gelelektroforese Øvelsen tager i mellem Oprensning af proteiner fra blod eller væv Inden for biokemien anvendes oprensning af proteiner i mange sammenhænge fx oprenses proteiner i forbindelse med karakterisering af proteiner/enzymer. SDS page er en analyse, der ofte anvendes i forskning for at analysere mængden af protein i prøver i forbindelse med fx oprensning af proteiner eller Westernblot. Analysen separerer proteiner efter størrelse. Fremstilling af groft celleekstrakt fra bakterier eller væv Saltfældning Ethanol fældning Anionbytning af proteiner SDS page (gelektroforese) Øvelsen er under forberedelse 3-6 timer

7 7 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, Oprensning af proteiner fra methicillin resistente stafylokokker (MRSA) og westernblot Hospital infektioner forårsaget af MRSA har været et stigende problem rundt om i Europa de sidste 10 år. Proteiner fra MRSA oprenses med saltfældning og anionbytning. Efterfølgende analyseres de forskellige oprensningstrin for PBP2a med Westernblot. Fremstilling af groft celleekstrakt fra stafylokokker. Oprensning af proteiner SDS-page Antistof påvisning af depbp2a (meca) Øvelsen er under forberedelse 4-10 timer. Øvelsen kan foregå over flere dage ISO elektrisk fokusering af proteiner fra blod. Isoelektrisk forkusering af proteiner Isoelektrisk fokusering. Øvelsen er under forberedelse og der er lang vej igen? 2D gelektroforese af E. coli En bakterie, der hyppigt bliver analyseret i klinisk mikrobiologi, er E. coli. Bakterien forårsager bl.a. urinvejinfektioner og sepsis. I denne øvelse analyseres et groft celleekstrakt af E. coli med isoelektrisk fokusering efterfulgt af en SDS page som farves med sølvfarvning. Øvelsen er under forberedelse Isoelektrisk fokusering Gel-elektroforese Sølvfarvning af gel 3-5 timer

8 8 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, Mikrobiologisk identifikation af bakterier På kliniske mikrobiologiske afdelinger på sygehuse identificeres bakterier i forbindelse med udredning af sygdom fra patienter. I en øvelse illustreres hvordan man identificerer bakterier visuelt ved mikroskopering af farvede (gram-farvede) og ufarvede præparater. Desuden ved lugt, samt med biokemiske identifikations metoder. Visuel identifikation af koloni morfologi Gram-farvning af bakterier Mikroskopering af farvede og ufarvede bakterier. Fænotypisk og genotypisk identifikation af bakterier Mikroorganismer identificeres både med fænotypiske og genotypiske metoder. Øvelsen demonstrer, hvordan man identificere 3 bakterier med fænotypiske metoder som mikroskopi, kolonimorfologi og biokemiske identifikations metoder. Efterfølgende vil de samme 3 bakterier blive identificere genotypiske med restriktions skæring (RFLP) Visuel identifikation af koloni morfologi Gram-farvning af bakterier Mikroskopering af farvede og ufarvede bakterier. Restriktionsskæring af DNA fra 3 bakterie Gelektroforese af skåret DNA

9 9 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, Enzymatisk og spektrofotometrisk bestemmelse af Glucose Måling af glucose er vigtig i forhold til diabetes patientens regulering af insulin. I denne øvelse er vi interesserede i at bestemme sammenhængen mellem koncentrationen af glucose og absorbansen. Vi anvender derfor en målemetode, hvor vi lader reaktionen, dvs. omdannelsen af glucose, løbe helt til ende. Ved at måle absorbansen når al glucose er forbrugt, har vi et direkte mål for glucosekoncentrationen. Undersøge reaktionsforløbet for omdannelsen af glucose i blod via et koblet enzymatisk assay Etablere af en standardkurve for glucose Bestemme glucoseindholdet i blod Specificitet af enzymaktivitet af forskellige sukker 2-3 timer Enzymatisk og spektrofotometrisk bestemmelse af alkalisk fosfatase Alkalisk fosfatase (AP) forekommer i de fleste vævstyper i kroppen, hvor det er forankret i cellernes membran, men det AP der findes i plasma kommer hovedsageligt fra lever- og knoglevæv. Den fysiologiske funktion af AP kendes ikke til bunds, men en vigtig funktion som enzymet menes at bidrage til er opbygningen af knoglevæv. Det er ofte hos patienter med knoglesygdomme, f.eks. Paget sygdom og ved knoglemetastaser som følge af prostatacancer at der observeres forhøjede værdier af AP-aktivitet i blodet, men også gravide, patienter med tarmsygdomme og patienter med kronisk hepatitis kan have forhøjede værdier. Formålet med øvelsen er at undersøge forskellige faktorers indflydelse på aktiviteten af enzymet alkalisk fosfatase. Spektrofotometrisk måling af alkalisk fosfatase aktivitet Bestemme initial hastigheden af enzymet ved forskellige substratkoncentrationer Første og anden ordens reaktionskinetik Michaelis-Meten kinetik 3-5 timer

10 10 Idékatalog til øvelser: Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Parkvej 190, Måling af lægemidler Der arbejdes med at skrive 3 øvelses ved ledninger til bestemmelse af lægemidler/ kemiske stoffer indenfor følgende emner. Spektrofotometisk måling af Acetyl salisylsyre. Enzymatisk analyse af Acetyl salisylsyre HPLC analyser HPLC-analyse af paracetamol (Kromatografi). Ekstraktion og HPLC-analyse af nikotin Øvelsen er under forberedelse