Andemad (Lemna gibba) Væksthæmningstest Side 5.1 METODEBESKRIVELSE FOR VÆKSTHÆMNINGSTEST MED FERSKVANDSPLANTEN ANDEMAD (LEMNA GIBBA) K. Ole Kusk Oktober 2009 Andemad (Lemna gibba) tilhører familien Lemnaceae. I Norden findes arterne L. minor, L. gibba og L. trisulca. Den her anvendte klon af L. gibba er imidlertid en amerikansk stamme. Andemad vokser flydende på vandoverfladen (se figur 1). Den er ikke rodfæstet, men har en kort nedsænket rod. Om efteråret synker bladene til bunds, hvor de overvintrer. På stille næringsrige småsøer og vandhuller kan andemad fuldstændig dække overfladen, så den ligner en fast sammenhængende grøn flade. Bladene hænger sammen i små grupper a 2-4 blade. Væksten foregår ved at der i kanten af et blad anlægges et nyt, som så vokser ud til et selvstændigt blad. Når bladgrupperne når en vis størrelse, brydes de op i mindre. Dette er samtidig den vegetative formering af andemad, hvilket er langt den mest betydende. Andemad kan også om end sjældent danne enkønnede blomster, og en kønnet formering kan således finde sted, men anses for væsentlig mindre betydningsfuld. Princip i testen Testtypen er en væksttest, hvor bladantallet følges i kulturer af andemad over 7 dage, mens de er eksponeret for forskellige koncentrationer af teststoffet. Bladene tælles ved starten, 1 eller 2 gange i løbet af eksponeringsperioden og ved afslutningen. Når testen er slut beregnes vækstraten i hver kultur, og koncentrationer, som hæmmer vækstraten 50 og 10 % i forhold til kontrolvækstraten, beregnes eller aflæses af en graf (EC 50,7 d, EC 10,7 d ). Biomassen ved hver koncentration kan testes for statistisk signifikant afvigelse fra kontrollen ved hjælp af en student t-test (for eksempel for at konkludere på et statistisk grundlag, om der er en signifikant stimulering (= hormese) eller hæmning. T-testen er en af Microsoft Excel s statistiske metode.
Andemad (Lemna gibba) Væksthæmningstest Side 5.2 Figur 1: Kultur af andemad (Lemna gibba). Bladgrupperne med 2-4 blade flyder på overfladen. Fra bladpladen udgår en rod, som antagelig fungerer væsentlig som balance-stang så planten ikke vender rundt. Biomassetilvækst Den vigtigste test-parameter er biomasse-produktion, der kan udtrykkes som tørvægt, klorofyl a-indhold eller antal blade. Af disse tre parametre er bladantallet langt den letteste at anvende, og det er en ikke-destruktiv målemetode i modsætning til f.eks. tørvægt. Før testen: Testorganismer (Lemna) opdyrkes i tilstrækkelig mængde til at starte det planlagte testarbejde. Dyrkningen foregår i kontinuerligt lys og ved 22-25 C under betingelser, som er identiske med testbetingelserne. Fortyndingsrækken fremstilles ligeledes inden teststart. Fremstilling af fortyndingsrække: Fremstil en stamopløsning per teststof. Om muligt fremstilles stamopløsningen ved at opløse teststoffet direkte i mediet. Fremstil 5-7 testkoncentrationer ud fra stamopløsningen. Medium uden teststof anvendes som kontrolmedium. Mål ph i kontrollen og i stamopløsningen før start. Om nødvendigt justeres ph i stamopløsningen med stærk syre eller base til kontrolmediets ph.
Andemad (Lemna gibba) Væksthæmningstest Side 5.3 Fremgangsmåde ved testen: Undersøgelser af stoffers toksicitet foretages normalt i to trin et første præliminært, hvor der fastlægges et omtrentligt koncentrationsområde med effekt og et andet definitivt trin, der er den egentlige test, og hvor det toksiske stofs EC50 bestemmes. I den præliminære test anvendes en stor faktor (f.eks. en faktor 10) mellem koncentrationsniveauerne. På den måde kan man undersøge et stort koncentrationsinterval, hvor man typisk finder en eller flere koncentrationer, hvor planterne dør, og tilsvarende en eller flere koncentrationer uden effekt, men et sted i koncentrationsrække vil man finde ændringen fra ingen til fuld eller delvis effekt, og det er i dette koncentrationsområdet, hvor ændringen sker, at den definitive test udføres og nu anvendes ligeledes en mindre faktor mellem koncentrationerne (typisk en faktor 1.6-max. 3). Den preliminære test: 5-7 koncentrationer fremstilles med en faktor 10 mellem koncentrationerne (eks: (mg/l) 0.001; 0.01; 0.1; 1; 10; 100). Desuden skal der være en kontrol-gruppe, som ikke udsættes for toksisk materiale. Målet her er kun at finde koncentrationsniveauet fra et område, hvor intet sker, til et koncentrationsområde, hvor der er fuld effekt. Da det ikke er hensigten at underkaste resultaterne statistisk behandling udføres denne test typisk med færre replikater per koncentration. (Hvis man på forhånd har en vis viden om det toksiske niveau, kan man evt. springe direkte til den definitive test) Den definitive test: På basis af resultatet af den preliminære test eller på basis af andre informationer om toksicitet fastlægges en koncentrationsrække for den definitive test. Faktoren imellem de enkelte koncentrationer er ofte 2-2,5 og der testes 5-7 koncentrationer (eks: (mg/l) 1; 2; 5; 10; 20; 50; 100). Koncentrationsrækken skal inkludere mindst en koncentration, hvor der i den præliminære test ikke blev observeret effekter, og mindst en koncentration, hvor der blev observeret en høj effekt (80% eller mere). Hvis koncentrationsrækken er fornuftigt valgt, vil det som regel være muligt at beregne en EC50 og en EC10-værdi på basis af resultatet af den definitive test, hvilket er det væsentligste formål med at udføre undersøgelsen. I Lemna-testen anvendes typisk 4 kontrol-replikater (gentagelser) samt 2-3 replikater per test-koncentration. Fremgangsmåde: Der anvendes et testmedium, som fremstilles i laboratoriet (se senere). Som test containere anvendes krystallisationsskåle med et volumen på 150ml eller 250 ml- Erlenmeyer-kolber eller krystallisationsskåle, som hver indeholder 125 ml af test-
Andemad (Lemna gibba) Væksthæmningstest Side 5.4 opløsning. Under testen dækkes kolberne med over- eller underdelen af en plastpetriskål eller med en tynd gennemsigtig film. Der overføres i alt 6-9 blade til hver skål/kolbe, dvs. 2-3 planter. Tæl bladene omhyggeligt og noter i tilhørende skema hvor mange blade der er tilsat i hvert glas. Planterne overføres ved hjælp af en nylon-pind, en nål eller andet egnet værktøj. For hver koncentration anvendes 2-3 replikater. Kontrollen har 4 replikater. Det er vigtigst for gennemførelsen og resultatet af denne test, at planter, der anvendes som inoculum vokser godt og er ensartede. Hvis kolberne dækkes med klar folie, prikkes små huller i folien for at sikre tilførsel af CO 2 til planterne. Testkolberne inkuberes i konstant lys ved rumtemperatur. Bestemmelse af biomasse Tæl antallet af blade (alle kolber) 1-2 gange i løbet af testen (f.eks. fredag og mandag, hvis testen er startet en onsdag/ eller mandag og onsdag, hvis startet en fredag) uden at åbne kolber. Antallet af blade bliver brugt som et mål for biomasse. Væksten i kontrollen bør være eksponentiel (konstant vækstrate på blade = fast generationstid = lige vækstkurve i et semi-logaritmisk plot [log-aksefor biomasse og lineær tidsakse]). Alle blade, der let kan identificeres som et særskilt blad, skal tælles. Dette kan give nogle individuelle forskelle mellem forskellige observatører. Tidsplan Dag 0: Den første dag i testen (= dag 0): Testen startes med fremstilling af testopløsninger og overførsel af blade til prøvebeholdere ph-måling Dag 2 og 4 (eller andet): Bladene i kontrol replikater samt testopløsningerne tælles uden at røre planterne. Dag 7: Alle blade i alle testbeholdere tælles. Data behandling ph-måling.
Andemad (Lemna gibba) Væksthæmningstest Side 5.5 Databehandling Vurdering af effekten på væksten af Lemna foregår på følgende måde: Beregn vækstraten (responset) i hver replikat og brug værdierne til at fremstille en koncentrations-respons-kurve. Vækstrate: Biomassens vækstrate (normalt kaldt µ): µ = (ln N n - ln N O )/t d hvor og N O er den initiale biomasse (inoculum som antal blade) N n er slutbiomassen (antal blade ved slut) t d er længden af testperioden (her 7 dage) Hæmning af vækstraten (i %): I µi (%) = (1 - µ i /µ c ) x 100 hvor I µi er den procentvise hæmning af vækstraten i koncentration i µ i er gennemsnitsvækstraten i koncentration i µ c er gennemsnitsvækstraten i kontrollen Brug et semi-logaritmisk papir eller et Excel-regneark til at kontrollere, at væksten i kontrolgruppen er eksponentiel (vækstkurver med biomasse som funktion af tiden [tid på lineær x-akse, biomasse på logaritmisk y-akse]). Brug et logaritmisk normal-fordelings-papir (log-norm papir) [denne type opgave eksisterer ikke i Excel] til fremstilling af en koncentrations-respons-kurve og til evaluering af EC10 og EC50 (håndlavet) med en logaritmisk koncentrations-akse og normal-fordeling Y-aksen med respons udtrykt som (gennemsnitlig) hæmningsprocent. Husk at koncentrations-responskurven formodes at være en lige linje i dette log-norm-system. Sammenlign med resultaterne fra LOG459-programmet - den statistiske behandling af data. Hvis der observeres stimulering af væksten (hormese) ved en lav koncentration kan dette testes statistisk ved brug af en t-test på et 95%-signifikansniveau ved sammenligning af vækst-raterne ved den respektive koncentration med kontrolvækstraterne. Kun hvis forskellen er statistisk signifikant, kan stimuleringen kaldes hormese. Et T-test-program er tilgængelig som en funktion i Excel. Validitetskriterier Fordoblingstiden i kontrollen skal være mindre end 50 timer. ph i kontrolgruppen må ikke variere mere end ± 1 enhed. (I praksis kan vi ikke opfylde det første kriterium, hvis temperaturen i laboratoriet er for lav)
Andemad (Lemna gibba) Væksthæmningstest Side 5.6 REFERENCE /1/ Swedish National Environmental Protection Board 1990. Method for toxicity test with the floating plant, Lemna minor, Duckweed. SNV report 3755. /2/ OECD 2006. GUIDELINES 221 FOR THE TESTING OF CHEMICALS Lemna sp. Growth Inhibition Test. OECD, Paris 2006. Koncentration (mg/l) Dag 0 Dag Dag Dag 7 Replikat Vækstrate (µ) Kontrolgennemsnit µ Hæmning I µi (%) i relation til kontrolgennemsnit 0 A 0 B 0 C 0 D 0 A B A B Materiale-liste : Andemad : Lemna gibba eller Lemna minor i god vækst Lemna-medium: OECD Krystallisationsskåle eller 250-ml koniske kolber Div. pipetter og spidser. 250 ml målekolber Div. måle- og bægerglas. Teststofopløsning (fremstilles i medium) Lyskilde Nylonpind eller preparer-nål Apparater. ph-meter
Andemad (Lemna gibba) Væksthæmningstest Side 5.7 20X AAP growth medium Stock solutions are prepared in sterile distilled or deionised water. Sterile stock solutions should be stored under cool and dark conditions. Under these conditions the stock solutions will have a shelf life of at least 6 8 weeks. Five nutrient stock solutions (A1, A2, A3, B and C) are prepared for 20X - AAP medium, using reagentgrade chemicals. The 20 ml of each nutrient stock solution is added to approximately 850 ml deionised water to produce the growth medium. The ph is adjusted to 7.5 ± 0.1 with either 0.1 or 1 mol HCl or NaOH, and the volume adjusted to one litre with deionised water. The medium is then filtered through a 0.2 m (approximate) membrane filter into a sterile container. Growth medium intended for testing should be prepared 1-2 days before use to allow the ph to stabilise. The ph of the growth medium should be checked prior to use and readjusted if necessary by the addition of 0.1 or 1 mol NaOH or HCl as described above. footnote: The theoretically appropriate final bicarbonate concentration (which will avoid appreciable ph adjustment) is 15 mg/l, not 300 mg/l. However, the historical use of 20X-AAP medium, including the ring test for this guideline, is based upon 300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc - Environment Agency.)