Anti-EBV EBNA IgG ELISA 96 807017 Enzyme-Immunoassay for in-vitro påvisning af IgG antistoffer mod Epstein-Barr virus (EBV) nuclear antigen 1 (EBNA-1) p72 i humant serum eller plasma 1. PÅTÆNKT ANVENDELSE Anti-EBV EBNA IgG ELISA er et in-vitro diagnostisk redskab for påvisning af IgG-antistoffer mod antigen EBNA-1 p72 af EBV. Resultater opnået med denne test i forbindelse med andre kliniske og patient data opnået i assays for andre Epstein-Barr virusspecifikke antistoffer så som anti-ea IgM/IgG og anti-vca IgM/IgG hjælper i den serologiske diagnose af EBV infektion. Primær infektion med EBV kan resultere i infektiøs mononukleose (IM = morbus Pfeiffer) (1,2). Sygdommen forekommer overvejende blandt ældre teenagere og unge voksne. Den akutte sygdom kan udvise følgende symptomer: Feber, pharyngitis, tonsillitis, lymphadenopati, utilpashed, hovedpine, myalgia, spleno- og hepatomegali, udslæt og leukocytose (2). Andre patogene infektiøse emner så som cytomegalovirus, Toxoplasma gondii, rubella virus, hepatitis viruses, human immunodeficiency virus (HIV) kan forårsage lignende symptomer. Testen anvendes til differentiering mellem primær og sene stadier af EBV infektion og har en central rolle i EBV diagnosen. 2. TEST PRINCIP Anti-EBV EBNA IgG ELISA er et højt sensitivt indirekte enzym linked immuno sorbent assay (ELISA) for påvisning af EBVspecifikke antistoffer i serum eller plasma. Under det første inkubations trin vil IgG antistoffer fra prøven binde sig til det rekombinante (rec) EBNA-1 antigen p72 (3-5) koatet til mikrotiterplade. Uspecifikt materiale vil blive fjernet ved vasken. Det resulterende antibodyantigen kompleks påvises ved at anvende et specifikt, enzym-mærket monoklonalt antistof rettet mod human IgG. Ikke-specifikt bundet konjugat fjernes ved det andet vaske trin. For den sidste inkubation fyldes substrat opløsningen (TMB, 3,3 5,5 -Tetramethylbenzidine) i brøndene. Enzym reaktionen stoppes ved at tilsætte svovlsyre (farven skifter fra blå til gul) og den optiske densitet (OD) måles med et spektrofotometer ved 450 nm og en reference bølgelængde på 615-690 nm. 3. KITTET INDEHOLDER De leverede reagensmængder er afpasset, så de muliggør 96 test. Alle reagenser er udelukkende beregnet til in vitrodiagnosticering. BESKRIVELSE Mærkning Reagenstype Præsentation R1 Microplate Mikrotiterplade 12 enkelt strips med 8 brønde hver, koatede med rec. EBVEBNA-1 p72 antigen (koncentration: 0,04 μg/ml) 1 R2 R3 R4 R5 EBV Concentrated Washing Solution (x500) EBV EBNA IgG Negative Control EBV EBNA IgG Standard EBV EBNA IgG Positive Control Vaskebuffer Koncentrat (500x) Konserveringsmiddel: 0,01% 2-bromo-2-nitro-1,3-propanediol EBV EBNA IgG Negativ Kontrol Humant serum negativt for IgG-antistoffer mod EBV-EBNA og negativt for HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,005% gentamycin, 0,05%, streptomycin 0,05% penicillin V EBV EBNA IgG Standard Humant serum reaktivt for IgG-antistoffer mod EBV-EBNA og negativt for HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,005% gentamycin, 0,05%, streptomycin 0,05% penicillin V EBV EBNA IgG Positiv Kontrol Humant serum reaktivt for IgG-antistoffer mod EBV-EBNA og negativt for HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,005% gentamycin, 0,05%, streptomycin 0,05% penicillin V 1 x 6 ml En fortyndet 1 x 1,2 ml 1 x 1,2 ml 1 x 1,2 ml 1
R6 Conjugate Anti-Human IgG Konjugat Monoklonalt antistof, peroxidase mærket Konserveringsmiddel: 0,025% penicillin V, 0,025% streptomycinsulfat, < 1,5% ProClin 300 R7 EBV Sample Fortyndingsmiddel R9 R10 Diluent EBV Chromogen TMB EBV Stopping Solution Storage Bag Self-adhesive transparent foils Konserveringsmidler: total koncentration < 0,11% Konserveringsmiddel: 0,01% neomycinsulfat, 0,03% Chloramphenicol Substrat Opløsning 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) opløsning < 0,05 % i H 2 O Se Advarsler og Forholdsregler Stopopløsning Svovlsyre < 1N H 2 SO 4 Opbevaringspose Polyetylenpose for opbevaring af resterende mikroplade strips Selvklæbende gennemsigtigt folie Selvklæbende gennemsigtigt folie for forsegling mikroplade brønde under inkubering 1 x 15 ml 1 x 45 ml 1 x 13 ml 1 x 15 ml 1 4 OPBEVARING Reagenserne er holdbare op til nævnte udløbsdato på individuelle etiketterved opbevaring ved 2-8 C. Efter åbning skal reagenserne anvendes inden 30 dage. For gentagne testninger anbring straks reagenserne efter brug ved 2-8 C. Mikrotiterplade forseglet i en aluminiums pose med et tørremiddel skal opnå stuetemperatur før åbning. Anbring straks ubrugte strips med tørremidlet i lynlås posen Opbevaringspose og opbevar dem på denne måde ved 2-8 C. Rør ikke den øvre kant eller bunden af brøndene med fingrene. 4. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Bland ikke reagenserne. Undgå kontakt med øjne og hud. Alle prøver og og materialer anvendt for testen skal behandles som værende potentielt smittefarlige og passende sikkerheds forholdsregler skal tages. Kontroller er af human oprindelse og negative for anti-hiv-1/2, anti-hcv, HBsAg, anti-syfilis og forhøjede transaminaser. Afpipettér ikke med munden. I henhold til god laboratorie praksis (GLP) brug handsker, kittel og sikkerheds briller. Væsker og ikke brændbare materialer skal dekontamineres med natriumhypoklorit (slutkoncentration: 3%, aktivitetstid mindst 30 minutter). Spildvæsker som indeholder syre skal neutraliseres før kassation. Anvendte mikrotiterplade og alle ma-terialer som kan genbruges skal autoklaveres i 1 time ved 121 C. Substrat Opløsning (R9) er lysfølsomt og skal beskyttes mod lys. Testen skal udføres af veluddannede og autoriserede bioanalytikere. Testen udføres under aseptiske og mikrobiologisk kontrollerede betingelser. Informér producenten hvis det originale test kit er beskadiget. ADVARSEL: Nogle af reagenserne indeholder ProClin 300 < 1,5 % For risici og sikkerheds anbefalinger refereres til tabellen i slutningen af indlægssedlen. 5. PRØVE TILBEREDELSE Friske serum eller plasma prøver, fri for hæmolyse skal anvendes. Stærkt lipæmiske, ikteriske eller bakterielt kontaminerede sera eller plasma prøver eller koncentrerede immunoglobulin præparater kan føre til tvivlsomme testresultater. Undgå gentagne nedfrysninger og optøninger af prøverne. Hvis prøverne skal transporteres, skal de pakkes i overensstemmelse med lovlige krav for transport af smittefarlige materialer. Prøverne skal ikke inaktiveres, da uspecifikke reaktioner i modsat fald kan opstå. 6. NØDVENDIGE MATERIALER SOM IKKE MEDFØLGER I KITTET Mikropipetter, spektrofotometer (450 nm, reference bølgelængde 615-690 nm), mikrotiterplade vasker(med bund vask) og inkubator (37 C) for mikrotiterplade. 7. ANALYSEPROCEDURE REKONSTITUERING AF REAGENSER Fortynd vaskebufferen (R2) med demineraliseret eller deioniseret vand (1:501). Den fremstillede buffer er holdbar i 1 uge ved opbevaring ved 2-8 C. Alle andre testkomponenter er fremstillet klar til brug. Alle reagenser er lot specifikke og kan ikke anvendes med kits af andre lots. Anvend ikke reagenser fra andre producenter. 2
TESTENS GENNEMFØRELSE Protokollen (se afpipetterings procedure) skal følges nøjagtigt. Prøve fortyndig 1:21 med forfortynding i glas: Fortynd Positiv Kontrol (R5), Negativ Kontrol (R3), Standard (R4) og prøver 1:21 i et glas (f.eks. 25 μl kontrol eller prøve + 500 μl Fortyndingsmiddel (R7)). Bland godt. Prøve fortynding 1:21 med fortynding direkte i pladen: Afpipettér 200 μl Fortyndingsmiddel (R7) i hver brønd. Fortynding direkte i mikrotiterpladen er specielt passende ved anvendelse af automatisk afpipetterings udstyr. Hvis der udføres fortynding direkte i pladen manuelt er det vigtigt at undgå non-specifik protein binding ved at iagttage følgende trin: Afpipettér først 200 μl Fortyndingsmiddel (R7) i brønden og tilsæt 10 μl prøve eller kontroller derefter. Bland 5 op til 7 gange når der tilsættes 10 μl prøve eller kontrol. VASKEPROCEDURE Vaskeproceduren er kritisk. Utilstrækkelig vask vil resultere I ringe præcision og uspecifikke reaktioner. Vask fem gange med vaskebufferen. Således, sug indholdet ud af brønden og tilsæt 300 μl af vaskebufferen. Gentag denne process fem gange. Slå blidt vaskebuffren ud af pladen efter vask. Pladen må ikke tørre ud. AFPIPETTERINGS PROCEDURE FOR KVALITATIV IgG BESTEMMELSE (FORTYNDING I GLAS) Bring alle reagenser til stuetemperatur før brug. Kontroller og blanke skal afpipetteres sidst. Efter afpipettering af kontroller og prøver skal inkubationen af pladen straks påbegyndes. Trin 1 A1/B1 C1/D1 E1/F1 G1 Blank 200 µl R7 - - - Negativ Kontrol (R3) dobbelt test - 200 µl R3 - - Positiv Kontrol (R5) dobbelt test - - 200 µl R5 - Prøve 1:21 - - - 200 µl Prøve Forsegl mikrotiterplade med selvklæbende folie (ikke påkrævet i ELISA* processor). Inkubation 30 ± 1 min., 37 ± 1 C Processor*: 30 ± 1 min., 37 ± 1 C 5 x vask Fortyndet Vaskebuffer (R2) 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl Trin 2 Konjugat (R6) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Forsegl mikrotiterplade med selvklæbende folie (ikke påkrævet i ELISA* processor). Inkubation 30 ± 1 min., 37 ± 1 C Processor*: 30 ± 1 min., 37 ± 1 C 5 x vask Fortyndet Vaskebuffer (R2) 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl Trin 3 Substrat Opløsning (R9) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Inkubation 30 ± 1 min., ved stuetemperatur i mørke Processor*: 15 ± 1 min., Ved stuetemperatur i mørke Stopopløsning (R10) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Mål ekstinktionen straks eller inden 15 min. efter stop ved 450 nm med et spektrofotometer (reference bølgelængde: 615-690 nm). 3
PIPETTERINGS PROCEDURE FOR KVANTITATIV IgG BESTEMMELSE (FORTYNDINGS GLAS) Bring alle reagenser til stuetemperatur før brug. Kontroller og blanke skal afpipetteres sidst. Efter afpipettering af kontroller og prøver skal inkubationen af pladen straks påbegyndes. Trin 1 A1/B1 C1/D1 E1/F1 G1 Blank 200 µl R7 - - - Negativ Kontrol (R3) dobbelt test - 200 µl R3 - - Standard (R4), Positiv Kontrol (R5) dobbelt test - - 200 µl R4/R5 - Prøve 1:21 - - - 200 µl Prøve Forsegl mikrotiterplade med selvklæbende folie (ikke påkrævet i ELISA* processor). Inkubation 30 ± 1 min., 37 ± 1 C Processor*: 30 ± 1 min., 37 ± 1 C 5 x vask Fortyndet Vaskebuffer (R2) 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl Trin 2 Konjugat (R6) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Forsegl mikrotiterplade med selvklæbende folie (ikke påkrævet i ELISA* processor). Inkubation 30 ± 1 min., 37 ± 1 C Processor*: 30 ± 1 min., 37 ± 1 C 5 x vask Fortyndet Vaskebuffer (R2) 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl Trin 3 Substrat Opløsning (R9) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Inkubation 30 ± 1 min., ved stuetemperatur i mørke Processor*: 15 ± 1 min., Ved stuetemperatur i mørke Stopopløsning (R10) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Mål ekstinktionen straks eller inden 15 min. efter stop ved 450 nm med et spektrofotometer (reference bølgelængde: 615-690 nm). * Hvis en ELISA processor anvendes er validering af testen på brugerens eget ansvar. 8. PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles i henhold til vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialer til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og frigives kun til salg, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares hos virksomheden. 9. TOLKNING AF RESULTERNE Prøver med en ekstinktions værdi under gråzonen anses for at være negativ. Hvis en prøve har en ekstinktions værdi lig med eller større end gråzonen, anses den for at være positiv for EBV EBNA-specifikke IgG antistoffer. Hvis OD-værdien af den gentestede prøve igen er indenfor gråzonen (tvivlsomme resultater), anbefaler vi at bede om en opfølgende prøve. BEREGNING AF CUT-OFF-VÆRDI OG GRÅZONE Cut-off værdien er beregnet fra middel OD værdien af den Negative Kontrol (R3 X ) plus 0,200: Cut-off værdien = R3 X + 0,200 Gråzonen er området mellem cut-off-værdien og cut-off-værdien -20%. BEREGNING AF DEN KALITATIVE BESTEMMELSE Efter måling af ekstinktions værdierne ved 450 nm i alle brønde (reference filter: 615-690 nm), Middelværdien af de blanke trækkes fra ekstinktions værdierne af controller og prøver. Middelekstinktions værdien af de blanke 0,100 OD Efter fratrækning af den blanke skal kontrolværdien møde følgende kriterier for at være gyldig: Middel OD-værdi af R3 0,200 Middel OD-værdi af R5 0,800 BEREGNING AF DEN KVANTITATIVE BESTEMMELSE Kittet indeholder en standard som følger det tyske Federal Medical Councils rekommendationer for udførelse af kvalitets controller i diagnostisl laboratorium (RiliBÄK) for kvantitative bestemmelser (7). Efter måling af ekstinktions værdierne ved 450 nm i alle brønde (reference filter: 615-690 nm), Middelværdien af de blanke trækkes fra ekstinktions værdierne af controller og prøver. Middelekstinktions værdien af de blanke 0,100 OD Efter fratrækning af den blanke skal kontrolværdien møde følgende kriterier for at være gyldig: Middel OD-værdi af R3 0,200 Middel OD-værdi af R4 0,800 4
TEST PROCEDURE (KVANTIFICERING) Kittet indeholder en standard som følger det tysk, Federal Medical Council tysk rekommendationer for udførelse af kvalitets controller I diagnostiske laboratorier (RiliBÄK) for kvantitative bestemmelser (7). Kvantitave bestemmelser kræver at resultatet af standarden er indenfor gyldigheds grænsen indikeret på etiketten. Testen udføres som beskrevet for den kvalitative metode. R3 og R4 måles altid ved en slut fortynding på 1:21. R3 og R4 skal måles in duplo. En ukendt prøve skal først måles ved en fortynding på 1:21. Sensitiviteten der kræves for definition af den immune status er kun tilvejebragt ved denne fortyndiing. I tilfælde af prøve OD > OD for den standard, skal prøven måles igen ved en højere fortynding (f.eks. 1:10 forfortynding = 1:210 slut fortynding). Alternativt (f.eks. i tilfælde af kendt seropositivitet), kan testen udføres straks ved en fortynding på 1:210. Denne fortynding tager ca. 85 % af forløbne infektioner i betragtning. Hvis værdierne er under cut-off eller > OD værdien af den positive kontrol, skal prøven gentestes ved en fortynding på 1:21 eller 1:2100 respektivt. For korrekt kvantificering skal følgende betingelser altid følges: Cut-off OD-prøve OD-standard (1:21) Den kvantitative bestemmelse er baseret på en to-punkt kalibrering, hvorved kalibrerings kurven tegnes mellem cut-off værdien og middelværdien af den standard (STD X ) i overensstemmelse med den medleverede lot-speci-fikke information. Værdier mellem de to grænser er bestemt enten fra en graf eller matematisk. BESTEMMELSE V.H.A. GRAF Grænserne af kalibrerings kurven placeres i et koordinatsystem. Skalaen på x-aksen er i området fra 0.000 til 2.500 OD og på y-ksen fra 0 til 120 RU/ml. De to grænseværdier placeres ved følgende koordinater (x/y): Koordinater af den nedre grænseværdi = [OD Cut off / 1 RU/ml] Koordinater af den ødre grænseværdi = [OD R4 / RU/ml se etikette] De to punkter forbindes med en ret linie. OD værdierne af prøverne aflæses fra kalibrerings kurven som RU/ml (ved parallel forskydning fra x-aksen ved at bruge en lineal). Hvis en prøve er blevet fortyndet til mere end 1:21, skal værdien bestemt fra grafen ganges med forfortyndings faktoren (f.eks. målt værdi x 10 for en fortynding på 1:210). MATEMATISK BESTEMMELSE RU/ml værdien af en prøve målt ved 1:21 fortynding beregnes i overensstemmelse med følgende formel: (OD Prøve OD Cut-off) RU/ml Prøve = RU/ml R4 1 x + 1 ( ) ( ) (OD R4 (1:21) OD Cut-off) For kvantitativ bestemmelse af en prøve som er blevet fortyndet til mere end 1:21, skal værdien bestemt fra ovennævnte kalkulation ganges med forfortyndings faktoren. Eksempel: for en prøve målt ved en fortynding på 1:210 (forfortyndings faktor = 10): RU/ml prøve (at 1:210) = RU/ml prøve (beregnet i henhold til formel) x 10 TOLKNING OG INFORMATION De bestemte kvantitative værdier er test-specifikke og er ikke sammenlignelige med værdier bestemt ved at bruge Anti-EBNA-1- IgG tests fra andre producenter. Definitionen af RU/ml er baseret på en Anti-EBNA-1-IgG -specifik serum standard anvendt af Bio-Rad internt for standardisering af kalibratoren som er leveret med test kittet. Rapporterede resultater skal påpege dette under yderligere bemærkninger (f.eks. Bio-Rad Anti-EBNA-1-IgG units ). Imidlertid er pålideligheden af resultaterne af denne kvantitative metode på tværs af de forskellige test kit lots garanteret indenfor normale produktions tolerancer. Den kvantitative værdi svarer ikke til endepunkts titeren af prøven. I tilfælde af tvivlsomme konstellationer kan lave Anti-EBNA-1-IgG kvantitative værdier(<100 RU/ml) støtte diagnosen af en primær infektion, specielt når en klar stigning i værdierne ses i de opfølgende prøver. Høje værdier (>100 RU/ml) peger på den anden side mere mod en post-akut til tidligere infektion. Under immunosuppressiv terapi eller relateret til en aquired immunodeficiency (AIDS) kan oprindeligt signifikante anti-ebna IgG kvantiteter falde stærkt med tiden, sommetider endog under grænsen for påvisning. Endvidere er det vist, at en lille del (1.2%) af raske individer med tidligere (latent) EBV infektion og en positiv anti-vca IgG blev anti-ebna IgG negative (1,3). Mere sjældent (<1%) er der tilsyneladende raske individer hos hvem EBNA antistoffer aldrig kan påvises (EBNA non-responders) (1). Derfor er det generelt anbefalet at bruge anti-ebv VCA IgG serologi (Bio-Rad Art. Nr. 807 019) i de tilfælde hvor den EBV immune status skal bestemmes. De følgende fordelinger blev fundet for kvantitative anti-ebna-igg værdier i raske individer (N = 100, bloddonationer) i RU/ml: 38,5% (1-100 RU/ml), 55,1% (100-1000 RU/ml) og 6,4% (1000-4000 RU/ml). Ca. 94% af raske voksne havde antistof koncentrationer mellem 1 og 1000 RU/ml. Dette kan tolkes som normal området. 10. PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Et negativt testresultat i Anti-EBV EBNA IgG ELISA udelukker ikke fuldstændigt en EBV infektion. Testresultaterne skal anvendes i forbindelse med tilgængelig information fra patientens kliniske bedømmelse og andre tilgængelige diagnostiske procedurer. Testresultater fra prøver fra immunosuppresserede patienter kan være svære at tolke (1). Positive testresultater kan måske ikke være valide i personer som har modtaget blodtransfusioner eller andre blodprodukter i de sidste måneder. Anti-EBV EBNA IgG ELISA blev analyseret med følgende potentielt krydsreagerende prøver: Anti-Varizella Virus-positive (50), Anti- Cytomegalievirus-positive (16), Anti-Herpes simplex type 1 og 2 (27). Ingen af prøverne blev positive med Anti-EBV EBNA IgG 5
ELISA. 11. FORVENTEDE VÆRDIER 99 serum prøver opsamlet fra raske, asymptomatiske bloddonorer blev testet med EBNA IgM ELISA. Af de 99 prøver blev 92 fundet at være positive (92,93%) og 7 blev fundet at være negative (7,07%). Dette er i overensstemmelse med publiserede tal for udbredelsen af udsættelsen for EBV i den voksne befolkning. Udbredelsen kan variere afhængig af forskellige faktorer så som geografisk lokation, alder, socialøkonomisk status, race, typen af anvendte test, prøve indsamling og håndterings procedurer, klinisk og epidemiologisk historie (5,6). Sera fra patienter efter CMV- (20), Toxoplasma- (20) og reumatoide sygdomme(20) blev analyseret. Ved at anvende EA IgM, EA IgG og EBNA IgG ELISA systemer kunne 7, 17 og 29 prøver identificeres med primær-, reaktiveredeog tidligere EBV infektion (4). 6
12. YDEEVNE SENSITIVITET OG SPECIFICITET Resultater opnået med Anti EBV EBNA IgG test i forbindelse med yderligere assays så som anti-ea IgM/IgG og anti-vca IgM/IgG hjælper i den serologiske diagnose af EBV infektion (3-6). Sensitiviteten af disse tre ELISA test systemer blev defineret i IM patienter til 99,2%. Specificiteten blev bestemt til 98,8% (4). PRÆCISION Et testpanel på 10 sera repræsenterende lave, lav-reaktive og høj reaktive prøver blev testet på 10 forskellige dage. Inter-assay variationen af disse sera blev 7,7% - 16,5%. Prøverne af det samme panel blev testet 8 gange i en test kørsel. Intra-assay variationen af disse sera blev 4,8% - 15,4%. 13. LITERATURE 1. Linde, A. (1992). Rev. Med. Microbiol. 3, 43-51. 2. Straus, S., Cohen, J.I., Tosato, G. and Meier, J. (1993). Ann. Int. Med. 118, 45-58. 3. Gorgievski-Hrisoho, M., Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J., Vornhagen, R., Sonneborn, H.-H., H., Wolf, H. and Siegl, G. (1990). J. Clin. Microbiol. 26, 2305-2311. 4. Färber, I., Wutzler, P., Wohlrabe, P., Wolf, H., Hinderer, W. and Sonneborn, H. -H. (1993). J. Virol. Meth. 42, 301-108. 5. Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J., Vornhagen, R., Wenger-Süss, R. and Sonneborn, H. -H. (1993). Biotest Bulletin 5, 33-46. 6. Tamir, D., Benderley, A., Levy, J. et al. (1974). Pediatrics 53, 330. 7. Bundesärztekammer: Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung labormedizinischer Untersuchungen, 2008 14. FEJLFINDING 1. Uventede højt antal af reaktive resultater: a. Prøver og kontroller blev af -pipetteret før afpipettering af Fortyndingsmiddel (R7). b. Utilstrækkelig blanding. 2. Middel blank værdi højere end kriterier for validitet, 0,100 OD: a. Substrat Opløsning (R9) blevet blå p.g.a. oxidering eller kontaminering. b. Vaske fejl: Udfør 5x vask/vaske trin. Hvis der anvendes manuel vaske udstyr, udfør 7x vask/vaske trin. Brug Bio- Rad Vaskebuffer (R2) som er indeholdt i kittet. c. Inkubations fejlt: Temperaturen for høj, inkubations tiden blev overskredet eller pladen blev ikke inkuberet direkte efter afslutningen af pipetteringen. d. Bølgelængde fejl: Måling uden reference filter vil øge OD værdierne med ca. + 0,120 OD. 3. Gul farvning i alle brønde (se 2a, 2b): a. Vaskebuffer (R2) kontamination; Fremstil ny Vaskebuffer (R2). b. Fortyndingsmiddel (R7) eller Konjugat (R6) kontamination; Gentag test med reagenser fra uåbnede flasker. Brug reagenser under mindre bakterielle betingelser. 4. Middelværdi af Positiv Kontrol (R5) og Standard (R4) 0,800 OD: a. Overskridelse af udløbstiden. b. Temperaturen for lav eller fald under inkubations tiden. c. Vaske fejl: For intensiv vask eller mekanisk kontakt af manifold og solid phase i brønden. d. Kontamination af Positiv Kontrol (R5), Standard (R4) eller 3b. 5. Middelværdi af Negativ Kontrol (R3) 0,200 OD (se 1 og 2 a-d): a. Negativ Kontrol (R3) blev ikke afpipetteret efter afpipettering af prøver; Afpipettér alle prøver før afpipettering af blanke og kontroller. b. Kontamination med låget af Positiv Kontrol (R5) og Standard (R4). 7
8
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 08/2011 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881075 www.bio-rad.com 9