ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M1990

Transkript

1 Sanquin Reagents Plesmanlaan CX Amsterdam The Netherlands Phone: Fax: Website: M1990 / January 2011 ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M ELISA-kit til in vitro kvantitativ analyse af mannosebindende lektin i humant serum (eller plasma) (da) Ab BLANC BUF CAL COAT CONJ da Antistoffer imod Blanco Buffer Kalibrator Coating Konjugat CONTROL DIL HUM MANNAN MOU SPE STOCK da Kontrol Fortynding Human Mannan Mus Prøve Beholdning WASH - da Vask Grænseværdi 1

2 da I. INDLEDNING Mannosebindende lektin (MBL), som også kaldes mannose- eller mannanbindende protein, spiller en vigtig rolle i det medfødte immunforsvar. MBL hører til klassen af kollektiner i den overordnede gruppe C-type lektiner, hvis funktion tilsyneladende er genkendelse af mønster i den første forsvarslinie hos den præimmune vært. MBL genkender kulhydratmønstre, der findes på overfladen af en lang række patogene mikroorganismer, herunder bakterier, vira, protozoer og svampe (1,2,3). Binding af MBL til en mikroorganisme resulterer i, at den klassiske komplementvej aktiveres, længe før specifikke antistoffer er dannet. MBL har en oligomerisk struktur ( kda) og er bygget op af underenheder, der hver indeholder tre identiske peptidkæder på 32 kda. Selvom MBL kan danne forskellige oligomerer, findes der indikationer på, at dimerer og trimerer ikke er biologisk active og at der kræves mindst en tetramer form for at komplementet aktiveres. Peptidkæden består af en kollagenlignende del og en lektindel. Lektindelen bindes vha. CRD er ('carbohydrate recognition domains', dvs. domæner der genkender kulhydrater) til sukkergrupper som mannose, maltose, N-acetylglukosamin, N-acetylgalaktosamin, fukose og glukose. Denne binding har en lav affinitet (Kd 10-3 ) og derfor er det væsentligt, at flere lektindele af et MBL-molekyle fæstnes samtidigt for at opnå en funktionel binding (4). I kredsløbet danner MBL et funktionelt kompleks MASP er (MBL-associeret serinprotease) 1, 2 og 3, som bliver enzymatisk aktive efter at de har bundet sig til en mikroorganisme. MASP-2 er identisk med C1-esterase på den almindelige komplementvej og kan spalte C4 og C2, hvorpå der dannes C4b2a. C4b2a fungerer som C3-konvertase og spalter C3, hvorpå der dannes C3b, der forårsager opsonisering af mikroben (2). Desuden findes der tegn på, at MBL bindes direkte til kollektinreceptorer på overfladen af fagocytter og det antages, at MBL bindes til C1qreceptoren på neutrofile granulocytter, monocytter og makrofager. Bindingen til effektorceller kan stimulere produktionen af proinflammatoriske cytokiner. MBL er et akutfaseprotein, der syntetiseres af hepatocytter. Umiddelbart efter fødslen stiger MBL-plasmakoncentrationen fra 1000 ng/ml til maks ng/ml i løbet af nogle uger, hvorefter koncentrationen falder til et niveau på 1700 ng/ml hos voksne. Individuelle MBLkoncentrationer kan variere anseeligt og de kan stige til tyve gange mere end det normale niveau i den akutte fasereaktion. MBL er vigtig i tiden efter fødslen som en del af det medfødte immunforsvar, når koncentrationen af antistoffer fra moderen falder og den egne igg-produktion skal begynde. Endvidere spiller MBL en væsentlig rolle i alle aldre ved den primære kontakt med mikroorganismer, før LgMkoncentrationerne stiger. MBL s kliniske relevans MBL-mangel forekommer relativt ofte sammenlignet med andre mangler i komplementsystemet, og forekommer hos 20-25% af hele befolkningen. MBL-mangel associeres med en forøget modtagelighed for infektioner som mellemørebetændelse, lungebetændelse, mave-tarmbetændelser, hjernehindebetændelse, betændelse i knoglemarven (osteomyelitis) og blodforgiftning (sepsis). Hos børn fordobler en heterozygot MBL-genmutation risikoen for hospitalsindlæggelse på grund af en infektionssygdom, sammenlignet med børn, der har normale MBL-niveauer. Ved homozygot genmutation er infektionsrisikoen endnu større og sygdomsforløbet er værre end hos patienter med normale MBL-niveauer. Patienter med cystisk fibrose, som har en MBL-genmutation er mere modtagelige for infektioner med Pseudomonas aeruginosa eller Burkholderia cepacia og har en kortere forventet levealder end patienter med cystisk fibrose, der ikke har denne mutation (5). Onkologipatienter, der får kemoterapi mod kræft og som følge heraf udvikler neutropeni (nedsat mængde neutrofile granulocytter i blodet), er mere modtagelige for lange perioder med feber, hvis de har lave MBL-plasmakoncentrationer. Hos børn under et år, der har Kawasakis sygdom, er MBL-mangel en risikofaktor for aneurismer af kranspulsårene. HIV-positive patienter udvikler hurtigere AIDS, hvis de har MBL-mangel. MBL-mangel associeres med gentagne spontane aborter, muligvis på grund af infektioner i livmoderen. MBL-mangel associeres med autoimmunsygdomme som Systemic Lupus Erythematosus (SLE) og reumatisk leddegigt (RA). Sammenhængen mellem MBL-mangel og forekomsten af både infektions- og autoimmunsygdomme har ikke blot ført til en stigning af MBLdiagnostik, men har desuden vist, at der er behov for terapeutiske anvendelser af rent MBL. II. Teknisk princip Analysen er en ELISA-test, der udføres i mikrobrønde, der er coatet med mannan. MBL i en målt mængde i en præve eller kalibrator bindes til mannancoatingen på mikrotiterpladen. Ikke-bundet materiale kan fjernes ved vask. Derefter tilsættes der et HRP-konjugeret (HRP=horseradish peroxidase, dvs. peberrodsoxidase) antistof mod MBL (ikke-humant MBL/1 HRP). Efter at det ikke-bundne HRP-konjugat er fjernet ved vask, tilsættes substratopløsningen i brøndene. Farven der udvikles, er proportional med den mænge MBL, der findes i prøven eller kalibratoren. Enzymreaktionen afbrydes kemisk og farveintensiteten aflæses ved 450nm i et ELISA-fotometer. MBL-koncentrationen kan bestemmes gennem interpolation på grundlag af prøvernes absorbans og absorbansen på en kalibreringskurve. III. Opbevarelse og holdbarhed MBL ELISA-kittet skal opbevares ved -18 C til -32 C. Det garanteres, at kittet er funktionsdygtigt til den udløbsdato, der er angivet på æskens etiket. Transportbetingelserne kan afvige fra betingelserne for opbevarelse. Må ikke fryses ned og optøs igen mere end tre gange. IV. Sættets indhold MBL ELISA-sættet indeholder tilstrækkeligt materiale til 288 tests (tre plader), inklusive kalibratorer, kontroller og tomme reagenter. Se tabellen i slutningen af denne indlægsseddel. Den mannan, der er anvendt som coating, er renfremstillet fra Saccharomyces cerevisiae. Det monoklonale antistof er renset for vævnæringssubstrat ved hjælp af søjlekromatografi (ionbytning og affinitetskromatografi). Kalibratoren og kontrollen er humansera. V. Yderligere påkrævede materialer Yderligere materialer: Destilleret vand til fortynding af vaske- og fortyndingsopløsning og substratbuffere. Bægere, flasker og cylinder, der kræves til tilberedning af reagenter. Afpipetteringsudstyr til nøjagtig mængdedosering. 2

3 En standard ELISA-vasker eller en 500 ml sprøjteflaske af plast til automatisk eller manuel vask af stripsene. Et standard ELISA-fotometer til absorbansmåling ved 450 nm. Linjeret logpapir. Yderligere buffere og opløsninger: Coating buffer: 0,1 M karbonat/bikarbonat buffer ph 9,6 Buffere og opløsninger til enzymatisk farveudvikling: Substratbuffer: 0,11 M acetatbuffer ph 5,5 Opløs 15,0 g natriumacetat (CH3COONa.3H2O) i 800 ml destilleret vand. Tilpas ph-værdien til 5,5 med iseddike og tilsæt destilleret vand til volumenet er 1 liter. Tilsæt ikke konserveringsmiddel (f.eks. mertiolat, natriumazid), da dette kan påvirke den enzymatiske farveudvikling. 3,5,3',5'-tetramethylbenzidin (TMB) stamopløsning: 6 mg/ml TMB i DMSO. Opløs 30 mg 3,5,3',5'-tetramethylbenzidin (TMB) i 5 ml dimethylsulfoxid (DMSO). Hydrogenperoxid stamopløsning: 3% H2O2 opløsning i destilleret vand. Stopopløsning: 1,8 M H2SO4 opløsning i destilleret vand. Til en mikrotiterplade tilberedes 12 ml substratopløsning ved at blande følgende ingredienser: 12 ml substratbuffer 200 μl TMB stamopløsning 12 μl H2O2 stamopløsning VI. Håndtering af testprøver Blodprøver skal samles aseptisk. Serum er den foretrukne prøve, men heparin eller EDTA antikoaguleret plasma kan også anvendes for testen. Hvis der anvendes plasma, skal 10 U/mL heparin tilsættes fortyndingsbufferen. Prøverne skal være så friske som mulig eller skal opbevares nedfrosset. VII. Testprotokol På testdagen optøs alle reagenter. Sørg for, at alle reagenter har stuetemperatur (18-25 C) og bland dem forsigtigt. Undgå bobler eller skum. 5-dobbelt koncentreret fortyndingsbuffer kan anbringes i et vandbad på 37 C og blandes med jævne mellemrum. Kalibratoren og kontrollen kan optøs ved at holde dem i hånden. Alle flaskerne skal centrifugeres (1 minut at 3000g) inden brug. Det anbefales at teste alle prøver, kontrollen og kalibratorfortyndinger i dobbeltbestemmelse. Se tabel 4 i vedlagte informationsbrochure for et forslag på en pladeplan. Mikrotiterplade Kittet indeholder tre mikrotiterplader. Afhængigt af hvor mange prøver der skal testes, skal en eller flere plader coates med mannan dagen før testen. Mannan medfølger i 100-fold koncentration i dette kit. Coatingbufferen skal tilberedes på selve testdagen. Tilsæt 120 μl mannan til 12 ml coatingbuffer pr. mikrotiterplade. Tilsæt 100 μl i alle brønde, dæk mikrotiterplade(r)n(e) med låget og inkuber natten over ved stuetemperatur (18 25 C). Buffere Beregn den nødvendige mængde vaskebuffer og tilbered en arbejdsopløsning ved at fortynde bufferen 20 gange i destilleret vand (til en plade kræves ca. 300 ml). Den fortyndede vaskebuffer skal opbevares mellem 2-8 C og er holdbar i 1 uge. Fortyndingsbuffer: Beregn den nødvendige mængde fortyndingsbuffer og tilbered en arbejdsopløsning ved at fortynde bufferen 5 gange i destilleret vand. Tilberedning af kalibratoren og kontrollen (i to eksemplarer) For oplysninger om koncentrationer se Tabel 2 og 3 på den vedlagte informationsbrochure. Optø kalibratoren og kontrollen ved at holde dem i hænderne og blande dem forsigtigt. Mærk fire glasrør, to til kontrollen (i to eksemplarer) og to til det højeste (350 ng/ml) kalibreringspunkt (i to eksemplarer). Kalibrator: For oplysninger om tilberedelse af det højeste kalibreringspunkt se tabel 1 på den vedlagte informationsbrochure. Mærk otte glasrør, et til hver fortynding for kalibreringskurven (i to eksemplarer): 140; 56; 22,4 og 9,0 ng/ml. Afpipetter dernæst 150 μl fortyndingsbuffer i disse glasrør. Overfør 100 μl fra glasrøret med det højeste kalibreringspunkt til det andet glasrør, der er mærket med 140 ng/ml og bland omhyggeligt. Gentag fortyndingen tre gange ved at tilsætte 100 μl fra det tidligere glasrør med den fortyndede kalibrator til 150 μl fortyndingen i de mærkede glasrør. Kalibreringskurven vil indeholde 350; 140; 56; 22,4; 9,0 ng/ml (i to eksemplarer). Brug fortyndingsbufferen som neutral værdi (0 ng/ml). Kontrol : Afpipetter 380 μl arbejdsopløsning i glasrørene til kontrollen (i to eksemplarer), tilsæt 20 μl af kontrollen og bland omhyggeligt. Tilberedning af prøverne Fortynd testprøverne 1:20 i fortyndingsbufferen på samme måde som kontrolserummet. Ved resultater, der er uden for de angivne områder (se tabel 1 i den vedlagte informationsbrochure), skal testen gentages med en anden prøvefortynding. 1. Første vask Aspirer mannanopløsningen fra brøndene i mikrotiterplade(r)n(e) og fyld brøndene helt (> 300 µl) med vaskebuffer og kasser disse. Gentag proceduren tre gange. Til sidst skal brøndene være fuldstændig tomme. Den følgende reagent skal tilsættes øjeblikkeligt. Lad ikke brøndene stå og tørre i længere tid. 3

4 2. Første inkubation Tilsæt 100 µl af den fortyndede kalibrator, kontrol og prøver i de relevante brønde. Dæk pladen med den selvklæbende forsegling, ryst forsigtigt ved at banke mod mikrotiterpladens kant i et par sekunder for at blande indholdet af hver brønd. Inkubér i 1 time ved stuetemperatur (18-25 C). Forbered den næste reagent til inkubation som beskrevet i punkt 4, lige før vasken. 3. Anden vask Aspirer supernatanter fra brøndene og vask pladen som beskrevet i punkt Inkubation med anti-humant MBL-HRP. Fortynd konjugatet 1:100. Tilsæt 120 μl HRP-konjugat til 12 ml fortyndingsbufferen pr. mikrotiterplade. Tilsæt 100 μl til hver brønd. Dæk pladen med den selvklæbende forsegling, ryst forsigtigt ved at banke mod kanten i et par sekunder for at blande indholdet af hver brønd. Inkubér i 1 time ved stuetemperatur (18-25 C). Tilbered næste inkubationsreagent TMB-substrat lige før vaskeproceduren som beskrevet i afsnit V (Yderligere påkrævede materialer). 5. Tredje vask Aspirer supernatanter fra brøndene og vask pladen som beskrevet i punkt Inkubation med TMB-substrat Tilsæt 100 µl TMB-substratopløsning til alle brønde. Ryst forsigtigt ved at banke mod mikrotiterpladens kant i et par sekunder for at blande indholdet af hver brønd. Inkubér maks. 30 minutter ved stuetemperatur (18-25 C) på et mørkt sted. Bemærk: Hastigheden af den enzymatiske farveudvikling afhænger af mange faktorer, herunder temperaturen og kvaliteten af det anvendte TMB. 7. Stop enzymreaktionen Tilsæt 100 µl stopopløsning til alle brønde. 8. Aflæsning af pladen Aflæs inden for 30 minutter ved 450 nm i et ELISA-fotometer. VIII. Resultater og fortolkning af data Noter absorbansen ved 450 for hver brønd og beregn gennemsnittet af duplikatværdierne. For hver prøve skal duplikaterne ikke afvige mere en 15% fra gennemsnitsværdien. Testen skal gentages, hvis duplikaterne afviger mere. Plot gennemsnitsabsorbansen af kalibratorerne (y-akse) ind mod den relaterede MBL i ng/ml (x-akse) på linjeret logpapir og tegn en kurve, der passer bedst. MBL-koncentrationerne i kontrollen skal være inden for de(t) område(r), der er angivet i tabel 3 på den vedlagte informationsbrochure. Interpoler den gennemsnitlige absorbansværdi for hver prøve på referencekurven. Testprøver, der viser en gennemsnitlig absorbans, der er uden for området af fortyndingerne på referencekurven, skal fortyndes passende. IX. Testområder Se Tabel 1 i den vedlagte informationsbrochure for testområder, der er specifikke for kittet. X. Referenceområder Målinger hos en gruppe almindelige, raske bloddonorer i Nederlandene (n=244), resulterede i følgende MBL-værdier: 10% percentil <0,04 μg/ml 25% percentil 0,4 μg/ml 50% percentil 1,1 μg/ml 75% percentil 2,0 μg/ml 90% percentil 3,3 μg/ml Da referenceområderne er underkastet mange påvirkende variabler, som kan variere for hver befolkning, der er blevet undersøgt, bør hvert laboratorium oprette sit eget referenceområde. XI. Specifikke ydelseskarakteristikker Reproducerbarhed Variationer inden for tester: To forskellige fortyndinger af en serumprøve blev målt elleve gange i en test. Variation mellem tester: MBL-mængden blev målt i tre forskellige serumprøver i seks til ti forskellige tester. 4

5 Inden for tester Gennemsnit Variation Fortynding 1 (1:10) Fortynding 2 (1:50) 1,46 μg/ml 1,53 μg/ml 6,0% 6,1% Mellem tester Gennemsnit Variation Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 1,52 μg/ml 1,49 μg/ml 1,60 μg/ml Bemærk: De citerede værdier for testens specifikke ydelseskarakteristikker repræsenterer typiske resultater og skal ikke betragtes som specifikationer for dette kit. Følsomhed Kittets mindste detekteringsniveau er 9,0 ng/ml og et målbart koncentrationsområde mellem 9,0 til 350 ng/ml. Bemærk: De citerede værdier for testens følsomhed repræsenterer typiske resultater og skal ikke betragtes som specifikationer for dette kit. Specificitet Fraværelse af krydsreaktioner med andre plasma- eller serumkomponenter understøttes af den kendsgerning, at aflæsninger, som ikke kan skelnes fra nul, skyldes en vis MBL-mangel hos donorer, som ellers har normale værdier. Forventede værdier Se afsnit X (Referenceområder). XII. Begrænsninger 1. Brugeren skal være faguddannet og fortrolig med ELISA-tester og testproceduren. 2. Udtalt hæmolyserede eller lipæmiske prøver skal ikke anvendes. Der kan opnås uventede resultater for prøver indeholdende reumatoid faktor, høje bilirubinniveauer eller andre cirkulerende immunkomplekser. Disse prøver bør analyseres ved hjælp af en anden metode. 3. Prøver, der er uden for området, skal gentages med andre fortyndinger. 4. Hvis der konstateres et nedsat MBL-niveau, kan dette aldrig tjene som en definitiv diagnose, men det skal snarere betragtes som tegn på en forstyrrelse af immunsystemet, der kræver yderligere diagnostisk undersøgelse. 5. Brug altid kontrolserummet til at kontrollere gyldigheden af kalibreringskurverne. Hvis kontrolserummet er uden for området, er resultaterne af testprøverne ikke pålidelige. Testen skal gentages. 6. Reagenter fra forskellige batcher må ikke ombyttes. 7. Rester af reagenter (f.eks. dødrum) må ikke blandes med indholdet af nyåbnede flasker. 8. Låg og flasker må ikke ombyttes. Låg skal skrues på de tilsvarende flasker igen. 9. Selvom de humane kalibrator- og kontrolsera er blevet testet for markører af specifikke sygdomsoverførende stoffer i overensstemmelse med de gældende EU-direktiver om GMP (god mikrobiologisk praksis), og disse var non-reaktive, skal alle komponenter af human oprindelse betragtes som potentielt smittefarlige. 10. Konserveringsstof: mertiolat 0,001%. 11. Brug nye pladeforseglinger til hver inkubation/hvert fiksationstrin i ELISA-testen for at undgå krydskontaminering. Brug ikke aluminiumsfolie. 12. Brug engangspipettespidser for alle overførsler for at undgå krydskontaminering. 13. Hver gang kittet anvendes, skal der tilberedes friske fortyndinger af kalibratorer, konjugat og buffere. 14. Brug ikke andre reagenter og mikrotiterplader end dem, der følger med kittet. 15. Natriumazid gør HRP uvirksom; brug ikke opløsninger, der indeholder natriumazid, og tilsæt ikke natriumazid til de leverede buffere. Brug ikke mertiolat, da dette kan påvirke kvaliteten af den enzymatiske farveudvikling. 16. Bortskaffelse af affald skal ske i henhold til laboratoriets regulativer. 17. Lad ikke brønde stå uden låg eller tørre alt for længe mellem inkubationstrinnene. XIII. Referencer 1. Turner, M.W. (1996) Immunol Today 17: Gadjeva, M. Thiel, S. Jensenius, J.C. (2001) Curr Opin Immunol 13: Klabunde, J. et al (2002) Parasitol Res 88(2): Thielens, N.M. et al (2001) J Immunol 166: Garred, P. (1999) J Clin Invest 104: ,9% 4,8% 11,2% ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit μl COAT MANNAN STOCK 1: μl CAL μl CONTROL μl HRP MOU Ab HUM MBL CONJ 1: ml BUF DIL STOCK 1: ml BUF WASH STOCK 1: x8 WELL 10 SEALS 5