Petrifilm. Type YM til bestemmelse af Gær og Skimmel. Aflæsningsguide og brugsvejledning

Transkript

1 Aflæsningsguide og brugsvejledning 3 Petrifilm Type YM til bestemmelse af Gær og Skimmel Det er nemt at tælle gær og skimmel kolonier på Petrifilm type YM plader. En indikator i mediet farver kolonierne, hvilket giver god kontrast og letter tællingen. Se efter følgende kendetegn for at adskille gær og skimmel på Petrifilmen: GÆR - Små kolonier - Kolonier med veldefinerede kanter - Rødbrune til blågrønne i farven - Hvælvede kolonier "3D" - Ingen kerne (mørkt område) i centrum af kolonien Yeast count = 44 Figure 1 SKIMMEL - Store kolonier - Diffuse kanter - Forskellige farver (skimmel kan producere egne pigmenter) - Kolonierne virker "flade" - Indeholder tit en markeret kerne i centrum af kolonien Kolonierne i fig. l er eksempler på typiske gærsvampe ; små veldefinerede blågrønne kolonier uden kerne. Gær CFU = 44 Fig. 2 viser eksempler på typiske skimmelsvampe; store udflydende multi-farvede kolonier med mørke kerneområder. Skimmel CFU = 27. Mold count = 27 Figure 2

2 Gærsvampe Petrifilm type YM pladen i fig. 3 indeholder 21 store grønne diffuse skimmelkolonier med mørke centre samt et højt antal gærkolonier. Disse er små, brune, velafgrænsede og uden mørke centre. Når antallet af kolonier overstiger 150 og dermed er vanskeligt at tælle, gør den gule kvardrering af underfilmen det muligt at anslå antallet af CFU. Vækstområdet på Petrifilm type YM udgør ca. 30 cm2. Antal kolonier i en repræsentativ firkant (I cm 2 ) bestemmes og multipliceres med 30 for at få det anslåede antal CFU. I fig. 3 er det anslåede gær CFU = 480. Yeast count = 480 (estimate); Mold count = 21 Figure 3 Petrifilmen i fig. 4 indeholder et meget højt antal gærsvampe kolonier. Resultatet registreres som overvokset (TNTC - Too Numerous To Count). De små blå kolonier langs kanten (se rammen) viser, at det drejer sig om et stort antal gærsvampe, og ikke skimmelsvampe som i fig. 9. I tilfælde med ekstremt højt antal gær kolonier på en Petrifilm type YM, er der tilsyneladende kun vækst langs kanten af vækstområdet (fig. 5). Resultatet registreres som overvokset. Det reelle antal CFU på denne Petrifilm er> Er De i tvivl om Petrifilmen er overvokset, kan den kontrolleres ved at løfte overfilmen. Gelen vil følge med overfilmen op. Hvis resultatet er overvokset, vil der på gelens underside være hvide kolonier. Yeast count = TNTC (actual count < 10 4 ) Figure 4 Yeast count = TNTC (actual count < 10 6 ) Figure 5 Yeast count = TNTC Figure 6

3 Skimmelsvampe Skimmel kolonierne på Petrifilm type YM pladen i fig. 7 er store, forskelligt farvede, har diffuse kanter og mørke centre. De er begyndt at vokse sammen og sporulere. Tælling fortages lettest ved at inddele Petrifilmen i sektioner, og derefter tælle de mørke centre i hver sektion. Den afmærkede sektion i fig. 7 har 15 skimmel kolonier. Skimmel CFU på Petrifilmen er 59. Mold count = 59 Figure 7 Bemærk den varierende pigmentering og de udflydende kanter på kolonierne på Petrifilmen i fig. 8. Dette skyldes et højt antal kolonier samt sporulering. Anslå antallet af CFU ved at tælle mørke centre. Der er 4 sådanne i den viste ramme. Anslået skimmel CFU på fig. 8 bliver derfor 120. Som ved alle andre pladespredningsteknikker, kan overvækst resultere i atypisk koloniudseende. Korrekt fortynding af prøvematerialet er vigtig for at opnå pålidelige resultater. Petrifilm type YM pladerne i fig. 9 og loer I: 10 og I: 100 fortyndinger af samme prøve. Kolonierne på Petrifilmen i fig. 9 er mange, små og utydelige hvilket gør dem svære at tælle eller anslå. Petrifilmen indeholder også en luftblære fremkommet ved ukorrekt inokulering. Korrekt fortynding af produktet, der sikrer et koloniantal mellem 15 og 150, gør tællingen nem. Skimmelsvampene i fig. loer store, har diffuse kanter og mørke centre (skimmel CFU = 58). Den lave fortynding, med påfølgende koloni tæthed på Petrifilmen i fig. 9, har forhindret kolonierne i at vokse frem med det typiske udseende. Mold count = 120 (estimate) Figure 8 Mold count = TNTC Figure 9 Mold count = 58 Figure 10

4 Fosfatase reaktion Alle levende celler indeholder enzymet fosfatase. Ved tilstedeværelse af fosfatase aktiveres indikatoren i Petrifilm type YM pladerne og farver gær og skimmel kolonierne blågrønne. Yeast and Mold count = 0 Figure 11 Yeast and Mold count = 0 Figure 12 Visse rå såvel som behandlede levnedsmidler, der indeholder levende celler (og dermed også fosfatase), kan også fremkalde denne farvereaktion. Der er to typer på "falsk" blå farvereaktion; en jævn blåfarvning af hele udsæds-området på Petrifilmen eller små kraftigt farvede prikker samme sted (oftest set ved prøver af krydderier eller granulerede produkter). Farvereaktion fremkaldt af "naturlig" fosfatase kan elimineres eller reduceres ved een eller flere af følgende teknikker: 1. Fortynding: Hvis fortynding af prøven er mulig, vil det fjerne den blå baggrundsfarve og reducere antallet af kraftigt farvede prikker. 2. Supernatant: Lad prøvematerialet bundfælde i 3-5 minutter efter homogenisering for at undgå større produkt partikler, der kan fremkalde de kraftigt farvede prikker. 3. Inkubationstemperatur. Inkuber Petrifilmen ved C. Fosfatase reaktionen sker hurtigere ved højere temperaturer. 4. Kontroller og noter. Kontroller Petrifilm type YM pladerne efter timers inkubering. Fosfatase reaktion fremkaldt af "naturlig" fosfatase kan forekomme allerede på dette tidspunkt. Noter evt. farveforandringer til hjælp ved senere aflæsning af Petrifilmen. Petrifilm type YM pladen i fig. II er et eksempel på en plade med jævn blåfarvning af hele udsædsområdet fremkaldt af "naturlig" fosfatase fra det testede produkt. Det "prikkede" udseende skyldes produktpartikler i den valgte fortynding. Check kanten af udsædsområdet for at skelne denne Petrifilm fra en plade med overvækst. Gær og skimmel CFU = O. (Se også fig. 4 og 5) Fig. 12 er et eksempel på en Petrifilm type YM plade med små kraftigt farvede prikker fremkaldt af produktpartikler. Bemærk den ofte uregelmæssige facon og variationerne i den blå farve. Gær og skimmel CFU = O. Et andet eksempel på farvede prikker fremkaldt af naturlig fosfatase ses i fig. 13. Prikkerne er meget små, uregelmæssige og kraftigt blå. I modsætning dertil er gærsvampe kolonierne små, regelmæssige og blågrønne med veldefinerede kanter. Skimmelsvampene fremtræder som store, forskelligt farvede kolonier med diffuse kanter og mørke centre. På pladen i fig. 13 er gær CFU = 7 og skimmel CFU = 7. Yeast count = 7; Mold count = 7 Figure 13

5 Fig. 14 er det samme produkt som testet i fig. 13. I dette tilfælde har partikler i fortyndingen fået lov til at bundfælde sig i 3-5 minutter inden udsæd. Der er stadig nogle få prikker forårsaget af "produkt-fosfatase" (se rammerne), men hovedparten er elimineret. Gær CFU = 12 og skimmel CFU = 4. Yeast count = 12; Mold count = 4 Figure 14 Tid & Temperatur Korrekt inkuberingstid og temperatur er vigtig for at sikre fremvækst af de i levnedsmiddelhenseende interessante gær og skimmel svampe. Disse er ofte langsomtvoksende og følsomme overfor høje temperaturer. For at sikre korrekt vækst skal Petrifilm type YM plader inkuberes ved 20-2YC (rumtemperatur) og kontrolleres for vækst efter både 3 og 5 døgn. Da skimmelkolonierne vokser mellem over- og underfilmen, er der ingen risiko for spredning af sporer og forøget koloni antal ved håndtering af Petrifilmen. Inkubering af Petrifilm type YM plader ved højere temperatur end den anbefalede, giver ingen garanti for hurtigere resultater, men vil derimod ofte medføre unøjagtige tællinger som illustreret ved fig. 15 og 16. Det drejer sig om identiske plader af samme produkt og fortynding, men inkuberet ved forskellige tid / temperatur kombinationer. Gær CFU = overvokset. (Inkuberet 3 dage ved 35 C) Gær CFU = overvokset (bestemt til > 10 7 ) Skimmel CFU = anslået til 120 (Inkuberet 5 dage ved rumtemperatur)

6 Mikroskop differentiering Gær og skimmel svampe udgør en meget stor gruppe organismer, og kan ofte vanskeligt adskilles makroskopisk. Positiv identifikation kan foretages ved hjælp af et mikroskop eller ved dyrkning på specialsubstrater. Løft overfilmen og pluk kolonier til videre identifikation fra gelen. Overfør kolonien til en dråbe sterilt vand på et objektglas, læg dækglas over og undersøg morfologien i mikroskopet. Eksempel på gærsvampe Skimmelsvampe med mycelium i forskellig udformning. Benyt identifikationsnøgler hvis endelig bestemmelse ønskes.

7 3M Petrifilm Type YM til bestemmelse af Gær og Skimmel Brugsvejledning Opbevaring Petrifilm Petrifilm Petrifilm 1 Uåbnede pakninger opbevares i køleskab og bruges inden udløbsdatoen trykt på foliepakken. 2 Genlukning af den åbnede pakke foretages med tape eller den medfølgende klemme. 3 Åbnede pakker Petrifilm opbevares ved 20 C og max. 50% relativ fugtighed. Bruges indenfor een måned. Bemærk; bør IKKE opbevares på køl. Prøveforberedelse 4 Fremstil 1:10 eller højere fortynding af prøven. Afvej eller afpipetter levnedsmidlet i en steril beholder (stomacherpose, flaske eller lignende). 5 Tilsæt den nødvendige mængde fortyndingsvæske ; benyt 0,1% peptonvand, PBS, 0,9% saltvand eller lign. Undgå fortyndingsvæsker med natriumcitrat eller thiosulfat. 6 Homogeniser prøven i henhold til den valgte procedure. Udsæd 7 Placer Petrifilmen på et hårdt, plant underlag og løft overfilmen. 8 Placer 1 ml. prøve midt på underfilmen. Hold pipetten lodret, så forbliver væsken samlet. 9 Lad overfilmen komme i berøring med dråben og lad den herefter falde ned over prøvevæsken.

8 Hold ved tværbjælken på 10 sprederen og placer den på overfilmen ovenpå prøvevæsken, så kanterne af sprederen flugter med Petrifilmen. Fordel prøven over et cirkulært 11 område ved at trykke forsigtigt på centrum af sprederen. Undgå at sprederen vipper eller glider. Løft sprederen. Lad Petrifilmen ligge stille et minut mens gelen 12 stivner. Inkubering Interpretation <70 F 13 Inkuber Petrifilmene med den klare side op i 3-5 dage ved C. Op til 20 Petrifilm kan lægges i hver stak. Benyt evt. en kolonitæller ved 14 aflæsningen af Petrifilmene. Referer til Petrifilm YM Aflæsningsguide på de foregående sider for tolkning af resultater. Øvrige kommentarer Trin 9 og 10 er unikke for PetrifilmTM Type VM Husk at inokulere og sprede een PetrifilmTM af gangen. Inkubering af PetrifilmTM Type YM i en plastpose kan fremme koloniudviklingen. Date Version Février Microbiology Products 3M Health Care Ltd 3M House Morley Street Loughborough LEICS LE11 1EP Tel: (01509) For Europe, please contact : Laboratoires 3M Santé Tél. : (33) Fax : (33) M and Petrifilm are trademarks of the 3M Company Whirl-Pak is a trademark of Nasco