Maxwell CSC Blood RNA Kit

Transkript

1 TEKNISK VEJLEDNING Maxwell CSC Blood RNA Kit Brugsanvisning for produktet AS1410 Forsigtig: Håndter cartridges forsigtigt; kanterne af forseglingen kan være skarpe. BRUGSANVISNING FOR PRODUKTET AS Woods Hollow Rd. Madison, WI USA MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Germany Revideret 5/18 TM434

2 Maxwell CSC RNA Blood Kit Al teknisk litteratur er tilgængelig på: Du er velkommen til at besøge vores websted, hvor du kan verificere, at du anvender den nyeste version af denne tekniske vejledning. Kontakt teknisk service hos Promega via , hvis du har spørgsmål om brugen af dette system: 1. Beskrivelse Produktkomponenter, opbevaringsforhold og symboler Tilsigtet anvendelse af produktet Begrænsninger i brugen Inden du går i gang: Klargøring af opløsninger Oprensning af RNA fra frisk fuldtblod i EDTA indsamlingsglas A. Forberedelse af fuldblodsprøver B. Forberedelse af Maxwell CSC cartridge Instrumentprocedure Post-oprensning Fejlfinding Etablering af et ribonukleosefrit miljø Henvisninger Relaterede produkter Liste over ændringer Maxwell CSC RNA Blood Kit fås kun i bestemte lande. Dette produkt opfylder de grundlæggende krav i EU-direktiv 98/79/EF vedrørende medicinsk udstyr til in vitro diagnostik. 1. Beskrivelse Maxwell CSC RNA Blood Kit (a, b) benyttes sammen med Maxwell CSC instrumentet og er en nem metode til effektiv, automatisk oprensning af RNA fra friske (ikke frosne) humane blodprøver, indsamlet i EDTA-glas. Maxwell CSC instrumentet leveres med forprogrammerede oprensningsmetoder. Det er beregnet til brug med prædispenserede reagenscartridges og yderligere reagenser, der leveres med kittet, hvilket maksimerer enkeltheden og bekvemmeligheden. Instrumentet kan behandle op til 16 prøver på cirka 60 minutter, og det oprensede RNA kan benyttes direkte i en lang række efterfølgende, forstærker-baserede applikationer så som RT-PCR. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

3 1. Beskrivelse (fortsat) Maxwell CSC RNA Blood Kit oprenser RNA ved hjælp af paramagnetiske partikler, som giver en mobil fast fase, som optimerer prøvetagning, vask og oprensning af RNA. Maxwell CSC instrumentet er håndteringsinstrument for magnetisk partikel. Dette system muliggør effektiv binding af RNA til de paramagnetiske partikler i den første brønd i en prædispenseret cartridge og fører prøven gennem cartridgens brønde. Denne metode med magnetisk indsamling undgår normale problemer med håndteringssystemer til væsker så som tilstoppede spidser eller partiel overføring af reagenser, som medfører en suboptimal rensningsproces, som det er tilfældet for andre udbredte systemer. 2. Produktkomponenter, opbevaringsforhold og symboler PRODUKT STØRRELSE KAT.# Maxwell CSC RNA Blood Kit 48 preps AS1410 Til in vitro diagnostik. Kun til professionel anvendelse. Tilstrækkelig til 48 automatiserede isoleringer fra blodprøver. Maxwell CSC cartridges er kun beregnet til éngangsbrug. 15 C 30 C 6010TB 48 Inkluderer: 48 Maxwell CSC RNA Blood Cartridges 4 100ml Solution A 30ml Solution B 20ml Lysis Buffer 2 vials DNase I (lyophilized) 900µl 1-Thioglycerol 100µl Blue Dye 2 1ml Proteinase K (PK) Solution 25ml Nuclease-Free Water 50 CSC/RSC Plungers 50 Elution Tubes (0.5ml) Opbevaringsforhold: Ved modtagelsen fjernes 1-thioglycerol til opbevaring ved 2 C 10 C. De øvrige komponenter i kittet opbevares ved rumtemperatur (15 C 30 C). 1-thioglycerol kan opbevares ved rumtemperatur (15 C 30 C), hvor det er stabilt i op til 9 måneder. Rehydreret DNase I opbevares ved 30 C til -10 C. Må ikke fryses og optøs mere end 10 gange. 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

4 Sikkerhedsinformation: Reagenscartridges indeholder etanol, som er brændbart. 1-thioglycerol er giftigt. Guanidin-thiocyanat og guanidin-hydrochlorid (indgår i opløsning B og lysisbuffer) er skadelige og irriterende. Lysisbuffer kan muligvis udgøe en risiko for ufødte børn. Bær handsker og følg de standardmæssige sikkerhedsprocedurer under arbejde med disse stoffer. Komponenterne i Maxwell CSC RNA Blood Kit er beregnet til brug med potentielt infektiøse stoffer. Brugerne skal bære korrekt beskyttelsesudstyr (f.eks. handsker, en laboratoriekittel og beskyttelsesbriller) under håndteringen af infektiøse stoffer. Brugerne skal overholde institutionens retningslinjer vedrørende håndtering og kassering af alle infektiøse stoffer, som anvendes med dette system. Bemærk: Blegemiddel reagerer med ammoniumklorid og guanidin-thiocyanat og danner giftige dampe. Guanidin-thiocyanat og ammoniumklorid findes i hhv. opløsning B og opløsning A. Affald fra dette kit må ikke dekontamineres ved brug af blegemiddel. Forsigtig: Håndter cartridges og åbne lyofiliserede DNase I hætteglas med forsigtighed; kanterne kan være skarpe. Supplerende information: Maxwell CSC Blood RNA Blood Kit komponenterne er beregnet til og kvalitetskontrolleret til at fungere sammen. Det frarådes at blande kit-komponenter fra forskellige kits. Brug kun de komponenter, der findes i det pågældende kit. For yderligere sikkerhedsinformation henvises der til materialesikkerhedsdatabladet på: Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

5 2. Produktkomponenter, opbevaringsforhold og symboler (fortsat) Symbolforklaring Symbol Forklaring Symbol Forklaring Medicinsk udstyr til in vitro diagnostik Repræsentant 15 C 30 C Opbevares ved C Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Fabrikant Forsigtig Irriterende Karcinogen Gift Korrosivt Indeholder tilstrækkeligt til n tests Conformité Européenne Advarsel. Biologisk betinget fare. Advarsel. Klemningsfare. Bestillingsnummer Lotnummer Må ikke genbruges 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

6 3. Tilsigtet anvendelse af produktet Maxwell CSC RNA Blood Kit wer beregnet til sammen med Maxwell CSC instrumentet og Maxwell CSC RNA Blood oprensningsmetoden som et medicinsk udstyr til in vitro diagnostik (IVD) til at foretage automatisk isolation af RNA fra 2,5 ml prøver af humant fuldblod indsamlet i EDTA indsamlingsglas med et antal hvide blodlegemer (WBC) i intervallet til WBC pr. milliliter. Det oprensede RNA er egnet til brug i forstærker-baserede in vitro diagnoseprocedurer. Maxwell CSC RNA Blood Kit er beregnet til brug med 2,5 ml af humant fuldblod. Maxwell CSC Blood RNA Blood Kit er beregnet til brug ved en temperatur på mellem 15 C og 30 C. Brug uden for dette temperaturinterval kan medføre suboptimale resultater. Maxwell CSC RNA Blood Kit er ikke beregnet til brug som en del af en specifik diagnostisk test. Maxwell CSC RNA Blood Kit er kun beregnet til professionel brug. De diagnostiske resultater, som opnås ved brug af RNA, der er oprenset med dette system, skal fortolkes sammen med andre kliniske data eller laboratoriedata. 4. Begrænsninger i brugen Maxwell CSC RNA Blood Kit er kun beregnet til brug med prøver af humant fuldblod indsamlet i EDTA glas. Det er ikke beregnet til brug med prøver af ikke-blod så som knoglemarv eller blodplader, prøver opbevaret i andre indsamlingsglas eller prøver opbevaret under andre forhold end krævet til produktet. Maxwell CSC RNA Blood Kit er ikke beregnet til brug med ikke-humane prøver eller til oprensning af DNA. Maxwell CSC RNA Blood Kit præstationerne er evalueret ved at isolere RNA fra 2,5 ml humant fuldblod i EDTA indsamlingsglas. Det er ikke beregnet til prøver, der er større end eller mindre end 2,5 ml. Det er ikke beregnet til brug med fuldblod fra andre indsamlingsglas end EDTA-glas. Det er ikke beregnet til brug med prøver, der indeholder mindre end WBC pr. milliliter eller med prøver, der indholder mere end WBC pr. milliliter. Brugeren er ansvarlig for etableringen af de ydelseskarakteristika, der er nødvendige for efterfølgende diagnostiske anvendelser. Der skal inkluderes kontroller i alle efterfølgende diagnostiske anvendelser, som gør brug af RNA, der er oprenset vha. Maxwell CSC RNA Blood Kit. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

7 5. Inden du går i gang: Klargøring af opløsninger 1-thioglycerol/opløsning B Forbered en 1-thioglycerol/opløsning B blanding med en af følgende fremgangsmåder: Tilsæt 600 µl 1-thioglycerol til flasken med opløsning B, og omrør grundigt. 1-thioglycerol er viskøst, og der kræves omhyggelig pipettering for præcis måling. Inden bruges skal 1-thioglycerol/opløsning B afkøles på is eller ved 2 C 10 C. Alternativt: forbered mindre mængder ved at tilsætte 20 µl 1-thioglycerol pr. milliliter opløsning B. Forbered 200 µl afkølet 1-thioglycerol/opløsning pr. prøve. Bemærk: Forberedt 1-thioglycerol/opløsning B kan opbevares ved 2 C 10 C, hvor dete r stabilt i op til 30 dage. DNase I Tilsæt 275 µl nukleasefrit vand til hætteglasset med lyofiliseret DNase I. Vend glasst om for at skylle DNase I af undersiden af låget, og ryst forsigtigt for at blande; brug ikke vortex-mixeren. Tislt 25 µl blåt farvestof til den rekonstituterede DNase I som en visuel hjælp ved pipettering og forberedelse af cartridges. Hver oprensning kræver 10 µl forberedt DNase I opløsning. Rekonstitueret DNase I opbevares ved 30 C til -10 C. Rekonstitueret DNase I må ikke fryses og optøs mere end 10 gange. Forsigtig: Hætteglasset med DNase I skal åbnes forsigtigt; glassets kanter kan være skarpe. 6. Oprensning af RNA fra frisk fuldtblod i EDTA indsamlingsglas Oprethold et RNase-frit miljø under behandlingen. Anvend altid RNase-fri og aerosol-resistente pipettespidser. Skift handsker hyppigt for at reducere muligheden for RNase-kontamination. Se afsnit 10, Etablering af et ribonukleasefrit miljø, for detaljer. Materialer, som skal leveres af brugeren fuldblod i EDTA indsamlingsglas (ikke forsttetfrozen); blod kan opbevares iop til 3 dage ved 2 C 10 C inden oprensning mikrocentrifuge 10 ml serologiske pipetter (sterile) pipettetorer og RNase-fri, sterile, aerosol-resistente pipettespidser 15 ml glas (sterile) centrifuge med udsvingsrotor 6 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

8 6.A. Forberedelse af fuldblodsprøver 1. Overfør 2,5 ml godt omrødt fuldblod (ikke frosset) fra EDTA indsamlingsglasset til et sterilt 15 ml glas. 2. Tilsæt 7,5 ml opløsning A, og vend glasset 5 10 gange for at blande. Dette er et differential-lysistrin; de røde blodlegemer lyses, og de røde blodlegemer forbliver intakte. 3. Inkuber lysater i 10 minutter ved rumtemperatur. Under inkuberingen vendes prøverne to gange som i trin 2 for at blande dem. 4. Centrifuger glassene ved g i 10 minutter i en udsvingsrotor. 5. Fjern det øverste lag ved dekantering eller pipettering. Roter glasset kortvarigt for at samle den resterende væske i bunden af glasset. Fjern og kasser så meget som muligt af det resterende øverste lag som muligt med en pipette uden at berøre den synlige kugle af hvide blodlegemer. 6. Tilsæt 200 µl afkølet 1-thioglycerol/opløsning B til kuglen, og kør det i vortex-mixeren for at genopøse kuglen. 7. Tilsæt 200 µl lysisbuffer og 25 µl proteinase K til den genopløste kugle. Bland ved at køre glasset i vortexmixeren i sekunder. Bemærk: Hvis det er nødvendigt at standse under den indledende procedure, kan prøverne opbevares efter trin 7 ved 30 C til 10 C i op til 5 dage. Ved disse opbevaringstemperaturer vil prøverne evt. ikke fryse helt. Når man er klar til at genoptage oprensningen af prøverme, optøs glassene ved rumtemperatur i 10 minutter, inden der fortsættes til næste trin. 8. Inkuber ved rumtemperatur i 10 minutter. Under inkuberingen forberedes cartridges som beskrevet i afsnit 6.B. 9. Tilsæt lysat til brønd nr. 1 i Maxwell CSC RNA Blood cartridge (den største brønd i cartridge). Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

9 6.B. Forberedelse af Maxwell CSC cartridge 1. Skift handsker inden håndtering af Maxwell CSC RNA Blood cartridges, CSC/RSC plungers og elueringsrør. Cartridges placeres på Maxwell CSC bakken uden for instrumentet, og bakken med cartridges og prøverne føres derpå ind i instrumentet til oprensning. Placer de cartridges, der skal benyttes, i Maxwell CSC bakken (fig. 2). Placer hver enkel cartridge i bakken med brønd nr. 1 (den største brønd i cartridge) længst væk fra elueringsrørene. Tryk cartridge ned og klik den fast. Kontroller, at begge ender af cartridge er helt på plads i bakken. Træk forsigtigt forseglingen tilbage, således at hele forseglingen fjernes fra toppen af cartridge. Sørg for at fjerne al forseglingstape og eventuelt tilbageværende klæbemiddel fra cartridge. Forsigtig: Håndter cartridges forsigtigt; kanterne af forseglingen kan være skarpe. 2. Anbring én CSC/RSC plunger i brønd nr. 8 i hver cartridge. Bemærk: Der må kun bruges de plungers, der følger med Maxwell CSC RNA Blood Kit. Plungers til Maxwell 16 LEV og SEV Kits er ikke kompatible med Maxwell CSC instrumentet. 3. Placer et tomt elueringsrør på elueringsrørpladsen for hver enkel cartridge i Maxwell CSC bakken. Bemærk: Der må kun bruges de elueringsrør, der følger med Maxwell CSC RNA Blood Kit. Andre elueringsrør er muligvis ikke kompatible med Maxwell CSC instrumentet og kan påvirke RNA oprensningen. 4. Tilsæt 50 µl nukleasefrit vand til bunden af hvert elueringsrør. Elueringsrørene skal forblive åbne under RNA oprensningen. Bemærk: Der må kun bruges det nukleasefrie vand, der følger med Maxwell CSC RNA Blood Kit. Brug af andre elueringsbuffere kan evt. påvirke RNA oprensningen. 5. Tilsæt 10 µl rekonstitueret DNase I (blå) til brønd nr. 4 (gul) i hver cartridge. Den resulterende grønne farve er en visuel indikator af, at der er tilsat DNase I opløsning til brønd nr Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

10 6.B. Forberedelse af Maxwell CSC cartridge (fortsat) Bemærkninger om forberedelse af Maxwell CSC RNA Blood cartridge 1. Anbring cartridges centralt på bakken, hvis du behandler færre end 16 prøver. 2. Tør spild af prøver eller reagens på Maxwell CSC bakken af som angivet i Maxwell CSC Instrument Operating Manual. Anvend ikke blegemiddel på instrumentets dele Brøndenes indhold 1. Bindingsopløsning 2. Magnetiske partikler 3. Vaskeopløsning 4. DNase I buffer 5. Bindingsopløsning 6. Vaskeopløsning 7. Vaskeopløsning 8. Tom Brugertilsætning til brønde 1. Forbehandlet prøvelysat µl forberedt DNase I 8. CSC/RSC plunger Fig. 1. Maxwell CSC cartridge Denne illustration viser indholdet i en cartridge. Den forbehandlede blodprøvelysat tilsættes til brønd nr. 1, 10 µl DNase I tilsættes til brønd nr. 4, og der placeres en CSC/RSC plunger i brønd nr TB 11339TA Fig. 2. Opsætning og konfiguration af Maxwell CSC bakke. Der tilsættes nukleasefrit vand (50 µl) til elueringsrørene som vist. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

11 7. Instrumentprocedure Maxwell CSC RNA Blood metoden kan downloades fra the Promega websiden: tools/maxwellcscmethod. Se Maxwell CSC Methods Installation Technical Manual #TM401 for mere detaljeret information. Hvis du har mistanke om, at instrumentet kan være forurenet med RNase, renses instrumentet inden processen med en opløsning af sæbe så som Steris LpH. Følg anvisningerne i afsnittet Rengøring og vedligeholdelse i Maxwell CSC Instrument Operating Manual. 1. Tænd for Maxwell CSC instrumentet og tablet-pcen. Instrumentets brugerinterface starter automatisk, og instrumentet gennemfører en selvkontrol og sætter alle bevægelige dele tilbage til udgangspositionen. 2. Vælg Start på hjem-skærmbilledet. 3. Scan eller indtast metode-stregkoden på Maxwell CSC Blood RNA Kit mærkaten for automatisk at vælge den metode, der skal køre (fig. 3). Bemærk: Maxwell CSC RNA Blood Kit metode-stregkoden kræves for at køre RNA oprensning på Maxwell CSC instrumentet. Kittets mærkat indeholder to stregkoder. Metode-stregkoden er vist i fig. 3. Hvis stregkoden ikke kan scannes, kontakt Promega Technical Services. 4. Vælg de positioner i cartridges, der skal behandles (se Maxwell CSC Instrument Operating Manual), og indscan eller indtast manuelt de nødvendige informationer til sporing af prøverne. Fravælg evt. ubenyttede positioner. Vælg Fortsæt, når al information om prøverne er indlæst TA Fig. 3. Kit-mærkat, der viser den metode-stregkode, der skal scannes. Den røde ramme og pilen foroven på mærkaten angiver metode-stregkoden på kittets mærkat Scan denne stregkode for at starte en oprensningsprocedure. 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

12 7. Instrumentprocedure (fortsat) 5. Verificer på tablet-pcen, at prøverne er påfyldt brønd nr. 1 i cartridges (som angivet i afsnit 6 B), at cartridges er indført i instrumentet, at elueringsrør med 50 μl nukleasefrit vand er isat og er åbne, og at plungers er placeret i brønd nr Placer Maxwell CSC bakken med de forberedte cartridges på Maxwell CSC instrumentets platform. Kontroller, at bakken er anbragt således i Maxwell CSC instrumentet, at elueringsrørene er tættest på døren. Bakken kan kun være i instrumentet, når den vendes på denne måde. Kontroller at du har vendt bakken korrekt, hvis du har svært ved at anbringe bakken på platformen. Kontroller, at bakken står vandret på instrumentets platform. Bemærk: Hold Maxwell CSC bakken i siderne for at undgå at cartridges flytter sig fra deres plads i bakken. Advarsel: Klemningsfare. 7. Bekræft, at alle anførte forberedelser er udført, og tryk på Start for at lukke instrumentets dør og starte processen. 8. Maxwell CSC instrumentet starter oprensningsproceduren med det samme. Skærmen viser de udførte trin og den omtrentlige tid, der er tilbage af processen. Bemærk: Hvis processen standses, inden den er afsluttet, vasker instrumentet partiklerne af plungers og skubber plungers ned i brønd nr. 8 i cartridge. Prøverne går tabt. Forsøg ikke at oprense prøver igen, for hvilke instrumentproceduren blev afbrudt. 9. Når processen er udført, vil tablet-pc-skærmen vise en meddelelse om, at metoden er afsluttet. Afslutning af processen 10. Følg skærminstruktionerne efter afslutning af metoden for at åbne døren. Kontroller, at plungers befinder sig i brønd nr. 8 i cartridges, når processen er afsluttet. Tag bakken ud af instrumentet, og tag de eluerede prøver ud af bakken. Hvis ikke alle plungers er fjernet fra plunger bar: a. Efter en afbrudt proces: følg anvisningerne på skærmen for at foretage Clean-Up proceduren. b. Efter en korrekt afsluttet proces:, vælg Clean-Up proceduren fra indstillings-skærmbilledet. 11. Tilluk og tag elueringsrørene med RNA ud af instrumentet straks efter afslutningen af processen for at forhindre fordampning af eluaterne. Tag Maxwell CSC bakken ud af instrumentet. Bemærk: Tag fat i bakkens sider, når den fjernes fra instrumentets platform. RNA-prøver kan opbevares natten over ved 30 C til 10 C, eller under 60 C til længere tids opbevaring. Sørg for at fjerne prøverne fra instrumentet, inden instrumentets UV-saniteringsprotokol køres, for at undgå at beskadige den oprensede nukelinsyre. 12. Fjern cartridges og plungers fra Maxwell CSC bakken, og bortskaf dem som farligt affald i henhold til din institutions procedurer. Cartridges, plungers og elueringsrør er kun beregnet til engangsbrug. Maxwell CSC cartridges, CSC/RSC plungers og elueringsrør må ikke genbruges. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

13 8. Post-oprensning Verificer, at udbyttet og renheden af de oprensede RNA prøver opfylder de krav, der stilles af den efterfølgende diagnoseprocedure, inden de benyttes i den pågældende procedure. 9. Fejlfinding Kontakt venligst det lokale Promega-filialkontor eller -distributør, hvis du har spørgsmål, som ikke behandles her. Kontaktinformation kan findes på: techserv@promega.com Symptomer Koncentrationen af RNA i eluatet er mindre end forventet (en typisk prøve skal give et udbytte >50 ng/µl oprenset RNA.) Årsager og kommentarer Antallet af hvide blodlegemer i prøven er mindre end eller større end produktets tilsigtede anvendelsesområde på til WBC/ml. Kittet er optimeret til oprensning af RNA fra blodprøver med et antal hvide blodlegemer på til WBC/ml. Der er brugt en forkert mængde fuldblod. Hvis der tilsættes mere eller mindre end 2,5 ml fuldblod, kan det medføre lavere udbytte. Blodprøven er for gammel. Det bedste udbytte fås med friske blodprøver. Prøver, der er opbevaret ved 2 10 C i mere end 3 dage kan medføre nedsat udbytte. Prøven har været opbevaret under 2 C eller over 10 C inden oprensning. Ukorrekt opbevaringstemperatur kan medføre WBC-lysis eller nedbrydning af RNA. Der kan være tilsat RNaser under behandling eller kvantificering af prøverne. Se afsnit 10 for information om etablering af et ribonuklease-frit miljø. Utilstrækkelig fjernelse af øverste lag efter differential-lysis. Sørg for, at mest muligt af det øverste lag fjernes. Kuglen af hvide blodlegemer blev skadet under fjernelse af det øverste lag. Undgå at berøre kuglen af hvide blodlegemer, når det øverste lag fjernes. Ukorrekt type af prøve. Kittet er beregnet til brug med humant fuldblod. Andre typer af prøver (f.eks. knoglemarv, plasma, blodplader etc.) er ikke testet med dette kit. Ukorrekt glastype til indsamling af blod. Kittet er beregnet til brug med humant fuldblod i EDTA indsamlingsglas. Andre glastyper er ikke testet med dette kit, og de kan være inkompatible med oprensningskemien. 12 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

14 9. Fejlfinding (fortsat) Symptomer Lav RNA-kvalitet (eluater bør have et A 260 /A 280 forhold over 1,8 og et A 260 /A 230 forhold mellem 1,8 og 2,4.) Der er høje niveauer af DNA i eluaterne (eluaterne er kontamineret med DNA, hvilket kan interferere med efterfølgende processer). Forbehandlet lysat er for viskøst til at pipettere. Årsager og kommentarer Antallet af hvide blodlegemer i prøven er større end produktets tilsigtede anvendelsesområde på til WBC/ml. Kittet er optimeret til oprensning af RNA fra blodprøver med et antal hvide blodlegemer på til WBC/ml. Der er brugt en forkert mængde fuldblod. Hvis der tilsættes mere end 2,5 ml fuldblod, kan det medføre lavere udbytte. Blodprøven er for gammel. Det bedste udbytte fås med friske blodprøver. Prøver, der er opbevaret ved 2 C 10 C i mere end 3 dage kan medføre nedsat RNA-kvalitet. Prøven har været opbevaret under 2 C eller over 10 C inden oprensning. Ukorrekt opbevaringstemperatur kan medføre WBC-lysis eller nedbrydning af RNA. Utilstrækkelig fjernelse af øverste lag efter differential-lysis. Sørg for, at mest muligt af det øverste lag fjernes. Ukorrekt type af prøve. Kittet er beregnet til brug med humant fuldblod. Andre typer af prøver (f.eks. knoglemarv, plasma, blodplader etc.) er ikke testet med dette produkt. Antallet af hvide blodlegemer i prøven er større end produktets tilsigtede anvendelsesområde på til WBC/ml. Der er brugt en forkert mængde fuldblod. Tilsætning af mere end 2,5 ml fuldblod kan medføre DNA-kontaminering af eluater. Der er ikke blevet tilsat DNase til cartridge. Inspicer om muligt brønd nr. 4 i de brugte cartridges. Brønd nr. 4 skal være grøn (ikke gul), hvis der er blevet tilsat DNase til cartridges i afsnit 6 B, trin 5. Antallet af hvide blodlegemer i prøven var større end produktets tilsigtede anvendelsesområde på til WBC/ml. Der er brugt en forkert mængde fuldblod. Tilsætning af mere end 2,5 ml fuldblod kan medføre lysater, der er viskøse og vanskelige at pipettere. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

15 10. Etablering af et ribonukleosefrit miljø Ribonukleaser er særdeles vanskelige at inaktivere. Vær omhyggelig med at undgå introduktion af RNase aktivitet til RNA-prøverne under og efter isolering. Det er særlig vigtigt, hvis udgangsmaterialet var vanskeligt at fremskaffe eller ikke kan erstattes. Følgende bemærkninger kan bidrage til at forebygge utilsigtet kontamination af prøverne med RNase. 1. To af de mest almindelige kilder til kontamination med RNase er brugerens hænder og bakterier eller sporer på luftbårne partikler. For at undgå kontamination fra disse kilder skal der benyttes sterile teknikker ved håndtering af de reagenser, der følger med dette system. Brug altid handsker. Skift altid handsker, hvis der kan være forekommet kontakt med ribonukleaser. 2. Brug altid sterilt, engangs plastudstyr til håndtering af RNA. Disse materialer er generelt fri for RNase, og de kræver ikke forbehandling for at inaktivere RNase. 3. Ikke-sterilt glasudstyr, plastudstyrog elektroforesekamre skal behandles inden brugen for at sikre, at det er fri for RNase. Glasudstyr skal varmebehandles ved 200 C natten over, og plastudstyr skal skylles omhyggeligt med 0,1N NaOH, 1 mm EDTA efterfulgt af RNase-frit vand. Kommercielt tilgængelige produkter til fjernelse af RNase kan også benyttes i henhold til fabrikantens anvisninger. Bemærk: Elektroforesekamre kan være kontamineret med ribonukleaser, især RNase A, fra analyse af DNAprøver. Reserver om muligt et nyt eller et dekontamineret apparat alene til RNA-analyse. 4. Opløsninger, som ikke leveres sammen med systemet, behandles ved at tilsætte 0,1 %v/v DEPC i et stinkskab. De inkuberes natten over med omrøring ved rumtemperatur i stinkskabet. Autoklaveres i 30 minutter for at fjerne ethvert spor af DEPC. Forsigtig: DEPC mistænkes for at være et karcinogen, og det må kun benyttes i i et stinkskab. DEPC reagerer hurtigt med aminer og kan ikke bruges til at behandle Tris buffere. Bemærk: For alle efterfølgende processer er det afgørende, at man fortsætter med at beskytte RNA-prøverne mod RNaser. Brug rene handsker, og brug RNase-fri opløsninger og centrifugeringsglas. 11. Henvisninger 1. Clinical Laboratory Standards Institute (2007) Handling, transport, and storage of specimens for molecular methods. Denne kan læses online på: 2. Murray, P.R. et al. (2007) Manual of Clinical Microbiology, 9th Edition, ASM Press. 14 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18

16 12. Relaterede produkter Instrumenttilbehør Produkt Størrelse Kat.# Maxwell CSC instrument* 1 stk. AS4000 Maxwell RSC/CSC bakke 1 stk. SP6019 *Til in vitro diagnostik. Dette produkt leveres kun i bestemte lande. Maxwell CSC Reagent Kits En liste over tilgængelige Maxwell CSC oprensningskits findes på Liste over ændringer Der er foretaget følgende ændringer i version 5/18 af dette dokument: 1. Opdateret til at indeholde kravene i EU IVD direktiv (98/79/EF). (a) U.S. Pat. Nos. 6,027,945 and 6,368,800. (b) U.S. Pat. No og andre patenter. 2014, 2015, 2018 Promega Corporation. Alle rettigheder forbeholdes. Maxwell er et registreret varemærke tilhørende Promega Corporation. LpH er et registreret varemærke tilhørende Steris Corporation. Produkterne kan være dækket af anmeldte eller udstedte patenter eller kan have visse begrænsninger. Du er velkommen til at besøge vores hjemmeside for yderligere information. Alle priser og specifikationer kan ændres uden forudgående varsel. Produktfordringer kan ændres. Kontakt teknisk service hos Promega eller gå ind i Promegas online-katalog for at få de mest aktuelle informationer om Promega-produkterne. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM434 Revideret 5/18