BACTEC PZA Test Medium Culture Vials

Transkript

1 TILSIGTET BRUG BACTEC PZA Test Medium Culture Vials Middlebrook 7H12 Medium ph 6.0 PP071JAA MA /06 Dansk BACTEC PZA Test Medium (Middlebrook 7H12 bouillon, ph 6,0) er specielt udviklet til at udføre følsomhedsundersøgelse med Mycobacterium tuberculosis mod pyrazinamid (PZA). Primære brug er med BACTEC 460TB-instrumentet. RESUMÉ OG FORKLARING BACTEC radiometrisk teknik bruges til antimikrobiel følsomhedsundersøgelse af primære anti-mykobakterielle medikamenter (streptomycin, isoniazid, rifampin og ethambutol). 1-4 Med denne teknik måles 14 CO 2, der er produceret af mykobakterier fra stofskiftet af et 14 C-mærket substrat, som findes i BACTEC 12B-mediet, kvantitativt. Hvis der tilsættes et antimikrobielt stof til mediet, inhiberes mykobakterielle isolater, som er følsomme overfor antimikrobielle stoffer, og den genererede mængde 14 CO 2 reduceres. Butler og medarbejdere 5 foreslog en forbedret konventionel metode til følsomhedsundersøgelse af PZA, der kræver et særligt 7H10 agarmedie med ph 5,5. En begrænsning i denne metode er, at ved en ph på 5,5 er der mange isolater af M. tuberculosis, som enten ikke vokser eller vokser dårligt. BACTEC 12B-mediet kan ikke bruges til følsomhedsundersøgelse af PZA, eftersom dette medikament kun er aktivt ved lavere ph-værdier. 5 Heifets et al. foreslog en radiometrisk metode til testning af PZA-følsomhed ved brug af BACTEC 12B-mediet ved ph 5,5. Denne metode krævede reducering af ph-værdien på hver individuelle flaske fra 6,8 til 5,5, når først væksten var startet i dyrkningsglasset. 6 Ved ph 5,5 var der adskillige isolater, som ikke voksede i 12B-mediet, selvom de generelt indsamlede resultater i 12B ph 5,5 var bedre end dem, der blev indsamlet ved brug af 7H10 ph 5,5. Senere blev det foreslået at tilsætte æggeblomme for at forbedre væksten af mykobakterier. 7 Dette resulterede i mere rapporterlige resultater, men tilsætningen af frisk æggeblomme var besværlig og ikke praktisk for et rutine-klinisk laboratorium. Salfinger og Heifets rapporterede efter yderligere undersøgelser, at MIC af PZA blev forøget med en forøgelse i ph på mediet fra 5,5 til 6,8. 8 Ved brug af en modifikation af de ovennævnte udgivne radiometriske følsomhedsprocedurer anbefalede Salfinger et al. brugen af BACTEC 12B-medie ved ph 5,9 til 6,0 (BACTEC PZA Test Medium) med en koncentration af PZA, som er højere end den, der blev benyttet i det konventionelle faste medie (ph 5,5). 9 PROCEDURENS PRINCIPPER BACTEC PZA Test Medium er et modificeret 7H12-medie med en reduceret ph på 6,0. Ved denne ph kan PZAaktivitet mod mykobakterier fastslås uden at hindre væksten af de fleste M. tuberculosis isolater. For at kompensere for forøgelsen i ph-værdien bruges der en højere koncentration af PZA (100 µg/ml) i BACTEC-testen i sammenligning med den konventionelle test (25 50 µg/ml). PZA-testmediet indeholder et 14 C-mærket substrat. Når mykobakterier vokser i dette medie, nedbryder de det mærkede substrat, og 14 CO 2 afgives i atmosfæren over mediet indeni det forseglede dyrkningsglas. BACTEC 460TB-instrumentet tester for tilstedeværelsen af 14 CO 2 ved at fjerne gassen fra glasset og overføre den til et elektrometer, hvor mængden af ionisering konverteres til et tal kaldt et vækstindeks (GI Growth Index). Hastigheden og mængden af produceret 14 CO 2 i mediet er direkte proportionalt med hastigheden og mængden af vækst i mediet. Når det anti-mykobakterielle medikament PZA tilsættes mediet, inhibiteres væksten af følsomme mykobakterier. Dette angives af reduktionen af 14 CO 2 -produktion i sammenligning med en forøgelsestendens i kontrollen. Hvis organismerne er modstandsdygtige, forekommer der en smule eller ingen væsktundertrykkelse i testsglasset. REAGENSER Indhold* pr. glas (4 ml) PZA-testmedie (endelig ph 6,0 ± 0,2): 7H9 bouillon... 0,47 % w/v Caseinhydrolysat... 0,10 % w/v Bovint serumalbumin... 0,50 % w/v Catalase enheder 14 C-substrat... 4 µci Demineraliseret vand (ml)... 4 q.s. *Suppleret som påkrævet for at opnå ydelseskriterier.

2 Advarsler og forholdsregler: Til in vitro diagnostik. Dette produkt indeholder tørt naturgummi. Patogene mikroorganismer, deriblandt hepatitisvira og HIV, kan forekomme i kliniske prøver. Standard forholdsregler og institutionelle retningslinier skal overholdes ved håndtering af alle emner, der er kontamineret med blod og andre kropsvæsker. Procedurer skal udføres i et egnet sikkerhedsskab og korrekt ventileret område. Inokulerede dyrkningsglas skal testes på et BACTEC 460TB-instrument, der er udstyret med et BACTEC 460TB-stinkskab, som giver (HEPA) mikrofiltreret luft og undertryk i instrumenttestområdet. Inden brug skal hvert glas undersøges for tegn på beskadigelse, nedbrydning eller kontaminering såsom uklarhed, opsvulmet eller indsunket membran. Hvis et dyrkningsglas viser tegn på kontaminering MÅ DET IKKE BRUGES. Et kontamineret glas kan indeholde overtryk. Kontaminering af glasset er ikke nødvendigvis umiddelbart synlig. Dyrkningsglas, som viser tegn på beskadigelse, bør kasseres før inokulering. I sjældne tilfælde kan glasflaskerne være revnet, og halsen kan gå i stykker, når hætten fjernes eller under håndtering. I sjældne tilfælde kan et dyrkningsglas være utilstrækkeligt forseglet. I begge tilfælde kan glassets indhold løbe ud især hvis glasset vendes om. Hvis dyrkningsglasset er blevet inokuleret, skal det spildte produkt behandles med varsomhed, da det kan indeholde patogene organismer/stoffer. Sterilisér alle inokulerede dyrkningsglas vha. autoklavering, inden de smides ud. For at minimere risikoen for udslip under inokulering af præparatet i dyrkningsglas skal der bruges sprøjter med permanent fastmonterede kanyler eller Luer-Lok-spidser. Kontaminering Der skal udvises omhu for at forhindre, at prøven kontamineres under prøvetagningen og inokuleringen i BACTEC-glasset. En kontamineret prøve vil give en positiv aflæsning, men vil ikke angive et klinisk relevant resultat. Sådan kontaminering kan være et resultat af forkert vedligeholdelse af BACTEC-kanyler og slanger, dårlig rensning af membran eller funktionsfejl i BACTEC-kanylevarmelegemet (se håndbogen til betjening og vedligeholdelse af instrumentet). En sådan identifikation skal foretages af brugeren på grundlag af faktorer såsom typen af den isolerede organisme, tilstedeværelsen af den samme organisme i flere kulturer, sygdomsforløbet, relevant udstyrskontrol, osv. Opbevaringsinstruktioner BACTEC PZA Test Medium-dyrkningsglas skal opbevares et køligt (2 25 C) og tørt sted. Skriv Brug før dato udvendigt på hver pakke og brug det ældste parti først. Det er en god praksis at isolere radioaktivt materiale ved at opbevare det i et skab, som kun autoriseret personale kan få adgang til. Skabet skal være mærket med ordene Forsigtig: Radioktive materialer. Mediet må ikke udsættes for direkte klart lys. Start altid med at teste hvert dyrkningsglas på BACTEC 460TBinstrumentet for at etablere 5 10 % CO 2 atmosfæren i glasset og for at sortere glas med høje baggrundsaflæsninger fra. Hvis et glas har en GI-aflæsning på GI 20 eller mere ved den første screening, skal det kasseres. KLARGØRING AF PRÆPARAT Isolerede rene kulturer af M. tuberculosis skal friskdyrkes i BACTEC 12B-mediet og skal bruges til denne test, når de er i en aktiv vækstfase. Brug ikke gamle, nedkølede kulturer eller kulturer, der har vist GI-topaflæsninger i mere end en dag. PROCEDURE Vedlagte materialer BACTEC PZA Test Medium Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 tester) } BACTEC 12B Medium Se Bestilling BACTEC 460TB instrument Tuberkulinsprøjte med permanent fastmonteret kanyle 5 ml sprøjte Desinfektionsmiddel 70 % isopropylalkohol Klargøring af medikamentmediet a. Frysetørret PZA-medikament stilles til rådighed separat sammen med en særlig PZArekonstitueringsvæske. b. Rens toppen af glasset med en alkoholvædet serviet. Tilsæt 5 ml rekonstitueringsvæske sterielt med en sprøjte til dyrkningsglasset med den frysetørrede PZA. Bland grundigt. Når det er fuldstændigt opløst, vil dette give en stamopløsning på 4000 µg PZA/mL. c. Før inokuleringen, efter at have renset toppen af glasset med en alkoholvædet serviet, tilsættes 0,1 ml af PZA-stamopløsningen i hvert PZA-medieglas ved brug af en 1 ml sprøjte. Resultant PZA-koncentrationen er 100 µg PZA/mL af medie. 2

3 Forholdsregler: Klargør ikke PZA med vand eller noget andet tilsætningsstof end rekonstitueringsvæsken. Rekonstitueringsvæskens mængde i glasset kan variere. Mål nøjagtigt 5 ml fra det medfølgende glas, når PZA-pulveret rekonstitueres. Tilsættelse af den korrekte mængde testmedikament i mediet er kritisk for funktionen af følsomhedstesten. Tilsæt nøjagtigt 0,1 ml stamopløsning ved brug af en 1 ml tuberkulinsprøjte. Klargøring af kontrollen Et PZA-testmedie uden noget medikament bruges som en kontrol. Tilsæt 0,1 ml rekonstitueringsvæske til kontrolglasset før inokulering af kulturen. Rekonstitueringsvæsken indeholder en vækstfremmende substans, polyoxyethylenstearat (POES). Det er nødvendigt at have rekonstitueringsvæske i alle de inokulerede dyrkningsglas. Klargøring af podestof Der må kun bruges aktivt voksende kulturer til opstilling af denne test. Brug ikke overgroede, opbevarede kulturer eller kulturer, der har vokset i andre medier. a. Testkulturen skal videredyrkes i et BACTEC 12B-medieglas (katalognr ) suppleret med 0,1 ml rekonstitueringsvæske pr. glas. b. Inkubér ved 37 C ± 1 C og test glasset dagligt på BACTEC 460TB-instrumentet. c. Når først den daglige GI når , bruges dette glas til inokulering af følsomhedstesten. d. Hvis GI er højere end , tilsættes friskt 12B-medie til det første vækstglas ifølge den tabel, som er vist herunder. Ved fortynding skal den fortynding, der blev brugt, noteres til fremtidigt brug. GI : Ingen fortynding GI : Tilsæt 1,0 ml af 12B-medie GI : Tilsæt 1,5 ml af 12B-medie GI : Tilsæt 2,0 ml af 12B-medie GI : Tilsæt 2,5 ml af 12B-medie GI : Tilsæt 3,5 ml af 12B-medie Bland grundigt før brug. Undgå glasaflæsninger på 999, som har overskredet GI-toppunktet. Inokulering af testen a. Rens toppen på alle dyrkningsglassene med 70 % alkoholvædet serviet før sprøjten indsættes. b. Bland testkulturen i 12B-mediet grundigt ved brug af en 1,0 ml tuberkulinsprøjte med en permanent fastmonteret kanyle. c. Tilsæt 0,1 ml af dette podestof i kontrolglasset og PZA-glasset. FORTYND IKKE KULTUREN TIL KONTROLLEN som anbefalet for andre medikamenter (f.eks. isoniazid, streptomycin, ethambutol, rifampin, osv.). d. Desinficér toppen af gummimembranen med et passende desinfektionsmiddel og rens derefter med en 70 % alkoholvædet serviet. BEMÆRK: Der bør udvises forsigtighed, når der håndteres dyrkningsglas under udførelse af test. Glasmembranerne kan blive kontamineret med kulturorganismer. Inkubation og testning a. Alle de inokulerede dyrkningsglas (inklusive kontrolglas) bør testes på BACTEC 460TB-instrumentet før inkubation for at sikre en 5 % CO 2 atmosfære. Hvis dette ikke blev gjort tidligere, kan dyrkningsglassene testes øjeblikkeligt efter inokuleringen. b. Inkubér glas ved 37 C ± 1 C. c. Test PZA- og kontrolglassene dagligt på BACTEC 460TB-instrumentet, indtil GI-værdien på kontrolglasset når 200 eller mere. Kvalitetskontrol Brug IKKE glas efter deres udløbsdato. Brug ikke glas, der har revner, eller som er defekte. Kassér dyrkningsglas på korrekt vis. Oplysninger om kvalitetskontrol for BACTEC 460TB-instrumentet findes i betjenings- og vedligeholdelseshåndbogen til BACTEC 460TB og 460. Som enhver anden undersøgelse af medikamentfølsomhed, er kvaliteten på podestoffet meget kritisk. Brug kun aktivt voksende kulturer i 12B-mediet med passende fortynding. Under ideelle forhold skulle kontrollen have en GI-værdi på 200 inden for 4 til 7 dage. Hvis der opnås en GIværdi på 200 i kontrollen på mindre end 4 dage, er dette er tegn på, at podestoffet er for tungt. Medmindre resultaterne er helt tydelige, skal testen gentages. Hvis der opnås en GI-værdi på 200 i kontrollen i løbet af mere end 7 10 dage, er dette et tegn på en dårlig kvalitet podestof (dvs. lav levedygtighed, lav begyndende GIaflæsning på podestoffet eller dårlig fortynding) og resultaterne kan være misvisende. GI-værdien i kontrollen og medikamentglassene skal følges omhyggeligt, indtil der er opnået tydelige resultater. Gentag testen, hvis der opstår tvivl. Hvis GI-værdien i medikamentglasset er tæt på 10 % af den i kontrollen, skal glassene testes i yderligere 1 3 dage. Dette vil hjælpe med at drage en konklusion om følsomhedsmønsteret på testkulturen. Hvis resultaterne ikke kan tolkes, skal testen gentages med et isolat, der har vokset i et friskt BACTEC 12B-medie (katalognr ). Brug altid H37Rv (ATCC 27294) som en følsomhedskontrol og H37Rv PZA-R (ATCC 35828) som en modstandskontrol. 3

4 Krav til kvalitetskontrol skal udføres i overensstemmelse med gældende lokale, statslige og/eller nationale regulativer eller akkrediteringskrav og Deres laboratoriums standardkvalitetskontrolprocedurer. Det anbefales, at brugeren læser de relevante NCCLS-retningslinier og CLIA-regulativer for passende kvalitetskontrolpraksis. TOLKNING AF RESULTATER Instrumentet udlæser direkte på en vækstindeksskala fra Vækstindekset er faktisk en måling af organismers stofskifteaktivitet i mediet. Når GI-værdien på kontrolglasset når 200 eller mere, tolkes resultaterne som følger: GI i medikamentglasset er < 9 % af GI i kontrolglasset = Følsom GI i medikamentglasset er > 11 % af GI i kontrolglasset = Modstandsdygtig GI i medikamentglasset er mellem 9 % og 11 % (inklusive) af GI i kontrolglasset = Grænse PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Vækstindekstallet reflekterer den hastighed og mængde vækst, som forekommer i mediet, men kan ikke bruges til at kvantificere kolonidannende enheder pr. ml. Kolonimorfologi og pigmenteringskarakteristika kan kun bestemmes på faste medier. Afskæringspunktet på cirka 10 % kan bruges som et cirkaskøn af modstand eller følsomhed baseret på GI-aflæsningen. BACTEC PZA-følsomhedtesten anbefales kun for M. tuberculosis komplekse isolater. Brugbarheden af PZA eller følsomhedsundersøgelsesmetoden for andre mykobakterier end tuberkulose (MOTT) kendes ikke. FORVENTEDE VÆRDIER Der skulle være en gradvis forøgelse af GI-værdien på kontrolglasset. I testglasset vil GI-værdien måske forblive den samme, eller den kan stige eller falde, alt efter testorganismernes følsomhed (se eksempel 1 og 2). Normalt vil BACTEC-resultaterne kunne indhentes i løbet af 4 til 7 dage. Til tider kan langsomt voksende kulturer tage længere tid. Resultater bør ikke tolkes i løbet af mindre end 4 dage eller efter mere end 21 dage. Eksempel nr. 1: PZA-følsomhed Daglige GI-aflæsninger GI-medikament GI-kontrol % Resultater: Kontrol x 100 = 0,8 % Følsom Medikament < 9 % 475 Eksempel nr. 2: PZA-modstandsdygtighed Daglige GI-aflæsninger GI-medikament GI-kontrol % Resultater: Kontrol x 100 = 86,5 % Modstandsdygtig 282 Medikament > 11 % FUNKTIONSDATA Baseret på et modificeret 7H12-medie ved ph 6,0 er den radiometriske BACTEC 460TB-teknik til dato den eneste kulturbaserede metode til PZA-følsomhedsundersøgelse, som anbefales af National Committee for Clinical Laboratory Standards. 14,15 I en undersøgelse udført af Pfyffer et al., resulterede undersøgelsen af følsomhed af M. tuberculosis for PZA i en overensstemmelse på mere end 96 %, når BACTEC 460TB PZA-medie og medikament blev sammenlignet med BACTEC MGIT 960 PZA-medie og medikament. Gennemsnitsventetiden for BACTEC 460TB PZA-testen var 5,4 dage, ikke indberegnet den tid, der tager at indhente en radiometrisk videredyrkning med et vækstindeks (GI) på BESTILLING Kat. nr. Beskrivelse BACTEC PZA Test Medium Culture Vials, 4 ml, ktn. af BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 tester) BACTEC 12B Medium BACTEC 460TB Instrument 4

5 LITTERATUR 1. Gross, W. M. and J.L. Hawkins, Radiometric selective inhibition test for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacteria bovis, and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21: Middlebrook, G. et al Automatable radiometric detection of growth of Mycobacterium tuberculosis in selective media. Amer. Rev. Resp. Dis. 115: Roberts, G.D. et al. Evaluation of the BACTEC radiometric method for recover of mycobacteria and drug susceptibility testing of M. tuberculosis from acid-fast smear positive specimens. J. Clin. Microbiol. 18: Siddiqi, S.H. et al Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 13: Butler, W.R. and J.O. Kiburn Improved method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide. J. Clin. Microbiol. 16: Heifets, L.B. and M. D. Iseman, Radiometric method for testing susceptibility of mycobacteria to pyrazinamide in 7H12 broth. J. Clin. Microbiol. 21: Woodley, C.L. and R. W. Smithwick, Radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in egg yolk enriched BACTEC 12B medium. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Salfinger, M. and L. Heifets, Determination of pyrazinamide MICs for Mycobacterium tuberculosis at different ph s by the radiometric method. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Salfinger, M. et al Rapid radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Res. Microbiol. 140: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. 11. Garner, J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 13. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Pfyffer, G.E., F. Palicova and S. Rüsch-Gerdes Testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide with the nonradiometric BACTEC MGIT 960 System. J. Clin. Microbiol. 40: National Committee for Clinical Laboratory Standards Tentative standard M24-T2. Susceptibility testing of mycobacteria, nocardia and other aerobic actinomycetes, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. 5

6 6

7 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, BACTEC, Luer-Lok and MGIT are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD.