BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit

Transkript

1 BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit PP119JAA 2007/06 Dansk TILSIGTET BRUG BACTEC NAP TB-differentieringstest er en test til at differentiere Mycobacterium tuberculosis komplekset fra andre mycobacteria. Det bruges primært med BACTEC 460TB-systeminstrumentet. BACTEC NAP (ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenon) TBdifferentieringstest er anbefalet til brug med BACTEC 12B Medium til hurtig differentiering af TB komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum og M. microti) fra andre mycobacteria end M. tuberculosis (MOTT). Denne test bør anvendes i forbindelse med bakteriel morfologi i udstrygninger og vækstegenskaber i BACTEC 12B Medium. RESUMÉ OG FORKLARING BACTEC 12B Medium giver ikke mulighed for observation af kolonimorfologi, men GI-aflæsningen kan være karakteristisk for visse arter af mycobacteria. M. tuberculosis og M. bovis udviser langsom vækst med en 2 til 3 ganges forøgelse af den daglige GIaflæsning, mens andre mycobacteria (MOTT bacilli) kan udvise daglige forøgelser på op til 10 gange. M. tuberculosis vækst i BACTEC 12B Medium ses som små pletter eller klynger med et klart medium. Andre mycobacteria vokser i meget små partikler og kan medføre en let uklarhed i mediet. Udstrygninger foretaget fra et positivt hætteglas (GI = 100 eller mere) kan indikere hvilken type mycobacteria, der vokser i mediet. Slangeformer og klynger er karakteristiske for M. tuberculosis (M. bovis og M. kansasii kan også danne slangeformer). Andre mycobacteria udviser anden karakteristisk morfologi, såsom M. avium/m. intracellulare, som udviser forgrening med lange bakterietråde. BACTEC NAP testen hjælper yderligere ved en hurtig differentiering af M. tuberculosis, den vigtigste mycobacterie-art. Denne test er uafhængig af niacintesten. En prøve med aktiv voksende kultur er inokuleret i NAP hætteglasset, som indeholder en skive med 5 µg af NAP. Hætteglasset og kontrollen inkuberes, og væksten ved tilstedeværelsen af NAP monitoreres på BACTEC 460TB systeminstrument. Analyse af de daglige GI-aflæsninger i løbet af de næste 3 til 5 dage hjælper i differentieringen af TB komplekset fra andre mycobacteria. PROCEDURENS PRINCIPPER NAP (ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenon), et intermediært stof i chloramphenicolsyntesen, hæmmer mycobacteria i TB Komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum og M. microti) næsten fuldstændigt, mens andre mycobacteria udviser enten let eller ingen hæmning. Når mycobacterial vækst er hæmmet ved tilstedeværelsen af NAP, hæmmes udviklingen af 14 CO 2 også, hvilket vises enten ved ingen øgning eller en formindskelse i GI. Denne virkning på GI hjælper også ved identifikationen. REAGENSER BACTEC NAP Kit hætteglas indeholder en papirskive med følgende aktive ingredienser: ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenon 5 µg Advarsler og forholdsregler Til in vitro diagnostik. Dette produkt indeholder tørt naturgummi. Patogene mikroorganismer, deriblandt hepatitisvira og HIV, kan forekomme i kliniske prøver. Standard forholdsregler 1-4 og institutionelle retningslinier bør følges ved håndteringen af alle materialer, der er kontamineret med blod og andre legemsvæsker. Et hætteglas fra NAP differentieringstest MÅ IKKE ANVENDES, hvis det er tydeligt kontamineret, misfarvet eller ikke indeholder en skive. Fugtighed, især ved høje temperaturer, forårsager hurtig nedbrydning af NAP. Aseptiske teknikker og etablerede procedurer mod mikrobielle farer bør konstant iagttages. 5 Skal altid anvendes inde i et biologisk sikkerhedsskab. Undgå enhver kontakt med skiven. Efter anvendelse skal prøvebeholdere og andre kontaminerede materialer steriliseres i en autoklave. Inden brug skal hvert glas kontrolleres for tegn på beskadigelse. Dyrkningsglas, som viser tegn på beskadigelse, bør kasseres før inokulering. I sjældne tilfælde kan glasflaskerne være revnet, og halsen kan gå i stykker, når hætten fjernes eller under håndtering. I sjældne tilfælde kan et dyrkningsglas også være utilstrækkeligt forseglet. I begge tilfælde kan glassets indhold løbe ud, især hvis glasset vendes om. Hvis dyrkningsglasset er blevet inokuleret, skal det spildte produkt behandles med varsomhed, da det kan indeholde patogene organismer/stoffer. Sterilisér alle inokulerede dyrkningsglas vha. autoklavering, inden de kasseres. Positive dyrkningsglas til videredyrkning eller farvning: Inden prøvetagning er det nødvendigt at frigøre gas, som kan samle sig på grund af det mikrobielle stofskifte. Der skal konstant anvendes sterile teknikker og etablerede forholdsregler mod mikrobielle farer. Procedurer skal udføres i et egnet biologisk sikkerhedsskab i et rum med passende ventilationssystem, som anbefalet af CDC. 5 Benyt passende beskyttelseskittel, maske og handsker, mens der håndteres præparater og kulturer af potentielle patogener. Følg CDC- og OSHA-anbefalingerne.

2 For at minimere risikoen for lækage under inokuleringen skal der bruges sprøjter med permanent fastmonterede kanyler eller fastgjorte Luer-Lok-spidser. Dette stofs toksicitet er ikke blevet undersøgt. Der bør tages passende hensyn under anvendelsen for at undgå udsættelse for stoffet. Opbevaring BACTEC NAP hætteglas skal opbevares i køleskab ved 2 8 C væk fra direkte sollys. Må ikke udsættes for varme eller høje temperaturer, da NAP er varmelabilt. Udløbsdatoen gælder for det uåbnede hætteglas, når det opbevares som anvist. PRØVEINDSAMLING Aktivt voksende kulturer i BACTEC 12B Medium kan bruges til at udføre NAP testen. Testkulturen bør være ren og fri for nonmycobacteriel kontaminering. PROCEDURER Vedlagte materialer: Ti hætteglas, der hver indeholder én NAP skive. Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt: BACTEC 460TB Instrument, BACTEC 12B Medium, tuberkulinsprøjte med permanent fastmonteret kanyle, desinfektionsmiddel, spritserviet, BACTEC fortyndningsvæske. Yderligere oplysninger findes i BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual (MA-0029). Når et BACTEC 12B Medium hætteglas udviser GI 10 eller mere, skal hætteglasset testes dagligt, indtil GI når op på Kontrollér, at kulturen ikke er kontamineret ved at udføre en gramfarvning eller kontroludsåning. Homogenisér kulturen med en tuberkulinsprøjte (permanent fastmonteret kanyle) og brug den samme sprøjte til at overføre 1 ml aseptisk til NAP hætteglasset. Tør toppen af NAP hætteglasset og kontrollens (original kultur) hætteglas af med et egnet desinfektionsmiddel, efterfulgt af aftørring med en spritserviet. Test begge hætteglas på BACTEC instrumentet med det samme for at udrense med 5 10 % CO 2. Se bort fra aflæsningerne. Inkubér ved 37 C ± 1 C eller ved den optimale temperatur og test dagligt i de næste 2 til 6 dage. Notér den daglige GI for NAP hætteglasset og det originale hætteglas, som fungerer som kontrol. Hvis GI er mere end 100, skal kulturen fortyndes på følgende vis inden inokulering af NAP hætteglasset: GI ingen fortynding GI ,8 ml ind i et friskt BACTEC 12B Medium hætteglas GI ,6 ml ind i et friskt BACTEC 12B Medium hætteglas GI ,4 ml ind i et friskt BACTEC 12B Medium hætteglas GI ,3 ml ind i et friskt BACTEC 12B Medium hætteglas GI ,2 ml ind i et friskt BACTEC 12B Medium hætteglas GI 999 mere 0,1 ml ind i et friskt BACTEC 12B Medium hætteglas end 1 dag Kulturen må ikke vokse udover den optimale GI værdi (999). Hvis kulturen er vokset for meget, skal den kontroludsås i et BACTEC 12B Medium hætteglas, inkuberes og testes dagligt, indtil det ønskede GI opnås. Hvis vækst på et fast medium skal testes, skal der laves en suspension ved at skrabe nogle få repræsentative kolonier og emulgere dem i et glas med sterilt vand eller BACTEC fortyndingsvæske. Justér suspensionens uklarhed, så at den ligner McFarland nr. 1 standard. Inokulér 0,1 ml af denne suspension ind i et BACTEC 12B Medium hætteglas. Inkubér og test dagligt på BACTEC 460TB systeminstrumentet. Når GI når , følges ovenstående procedure. KVALITETSKONTROL Følgende positive og negative kontroller bør omfattes i hvert testparti for at sikre nøjagtigheden af testproceduren. M. tuberculosis, H37Rv ATCC nr M. kansasii ATCC nr M. intracellulare ATCC nr M. avium ATCC nr *Yderligere oplysninger findes i BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual (MA-0029). BRUG IKKE glas efter deres udløbsdato. BRUG IKKE glas med revner eller fejl. Kassér glasset på passende vis. Kvalitetskontrolcertifikater er vedlagt hvert NAP sæt. Kvalitetskontrolcertifikater viser de testorganismer, der blev brugt til denne produkttype. Som en del af den daglige vedligeholdelsesplan, skal funktionstestglas (BACTEC Performance Test Kit) testes på BACTECinstrumentet. Hvis aflæsningerne er lave, selvom funktionstestglassene blev testet korrekt, kan dette tilkendegive mulige problemer med instrumentet (se BACTEC PTK indlægsseddel, PP-046JAA). Den påkrævede kvalitetskontrol skal udføres i overensstemmelse med lokale og nationale regulativer eller akkrediteringskrav og brugerens laboratoriums standard kvalitetskontrolprocedurer. Det anbefales, at brugeren læser de relevante NCCLS-retningslinier og CLIA-regulativer for passende kvalitetskontrolpraksis. TOLKNING AF RESULTATER Kontrollens daglige GI (oprindelige kulturglas) vil fortsætte med at stige. I NAP testglasset vil formindskelsen eller forøgelsen afhænge af mycobacteria arterne. En formindsket eller uændret GI tyder på TB komplekset, mens en forøget GI tyder på MOTT bacilli. Følgende kriterier passer til næsten alle mycobacteria i NAP glasset: 2

3 TB komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum) to på hinanden signifikante formindskelser i GI efter inokuleringen let, men ikke signifikant forøgelse i de første to dage og derefter a formindskelse eller ingen forøgelse i GI MOTT bacilli daglig GI aflæsning stiger til over 400 indenfor fire dage en let formindskelse eller ingen stigning i de første en til tre dage efter inokulation, og derefter to på hinanden følgende daglige signifikante stigninger efter dag to En signifikant stigning eller fald betyder en ændring på 20 % fra én dag til den næste. PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Separation af TB komplekset fra MOTT ved BACTEC NAP TB-differentieringstesten er kun mulig med isolerede, rene kulturer. En blandet kultur af TB komplekset og MOTT bacilli vil resultere i en stigning af GI, hvilket kun tyder på MOTT bacilli. Kontaminering med andre bakterier end mycobacteria kan også resultere i en falsk stigning i GI, når kontaminanten udnytter substratet. NAP glas bør kontrolleres visuelt for eventuel tydelig kontaminering og/eller uklarhed. En udstrygning for AFB fra NAP glasset i tilfælde af stigende GI er til hjælp ved bekræftelsen af tilstedeværelse af MOTT bacilli og TB eller kontaminerende bakterier. Nogle M. kansasii stammer kan blive hæmmet af NAP i den grad, at resultaterne kan være ukorrekte. Yderligere specifikation skal udføres ved andre metoder. På grund af de biologiske materialers beskaffenhed i medieprodukter og den iboende varians blandt organismer, skal brugeren være opmærksom på potentielt varierende resultater i opsamlingen af visse organismer. FORVENTEDE VÆRDIER Rapporteringstiden for resultater varierer fra 2 til 6 dage afhængigt af de mycobacterielle arter. Resultater bør kun rapporteres, når der ses en klar tendens. Hvis GI er uændret, bør identifikationen af TB komplekset ikke tolkes i mindre end 4 dage. Gennemsnitstiden for fuldførelsen af NAP testen er blevet rapporteret til at være 4 dage. 6,7-11 NAP testresultater skal understøttes af vækstegenskaber og morfologi af AFB på en syrefast farvet udstrygning. Udstrygningen kan også betyde tilstedeværelse af blandede kulturer eller kontaminering. FUNKTIONSDATA Selvom de fleste NAP tests er nemme at tolke, kræver visse tests yderligere inkubationstid for at kunne demonstrere en klar tendens. Det er vigtigst med mycobacteria, som er delvist hæmmede af NAP og viser en langsom eller forsinket stigning i GI eller en længere latenstid ved tilstedeværelsen af NAP (dvs. visse stammer af M. kansasii, M. gastri, M. szulgai, M. terrae og M. triviale). Alle MOTT bacilli, der blev undersøgt i løbet af NAP evalueringen, udviste en stigning i GI indenfor 5 til 6 dage. 5,7 Men visse M. kansasii stammer kan blive hæmmet mere end sædvanligt af NAP og kan blive fejlidentificeret i testen. Inkubation ved den optimale temperatur er nødvendigt for at opnå korrekte resultater. Mycobacteria, såsom M. chelonae og M. marinum, som vokser ved temperaturer lavere end 37 C, og M. xenopi som vokser ved højere temperaturer, kan give ukorrekte resultater, hvis de testes ved 37 C. I tilfælde, hvor den optimale inkubationstemperatur ikke er kendt, bør testen udføres ved mere end én temperatur. I tidligere undersøgelser blev den samlede følsomhed og specificitet af testen anslået til at være %. 7,10 BESTILLING Kat. nr. Beskrivelse BACTEC NAP TB Differentiation Kit, 5 µg NAP pr. glas, 10 glas pr. karton BACTEC 12B Medium, 4 ml, 100 pr. karton LITTERATUR 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 2. Garner, J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 4. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Kent, P.T. et al. Public health mycobacteriology, a guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Division of Laboratory Training and Consultation. Atlanta, GA, Gross, W.M. et al. Radiometric selective inhibition tests for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21: , Laszlo, A. et al. Evaluation of a rapid radiometric differentiation test for the Mycobacterium tuberculosis complex by selective inhibition with ρ-nitro- α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone. J. Clin. Microbiol., 19: , Libonati, J.P. et al. Identification and direct drug susceptibility testing of mycobacteria by the radiometric method. Abstract C300, A.S.M. Meeting, St. Louis, MO Morgan, M.A. et al. Evaluation of the ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone differential test for identification of Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol., 21: ,

4 10. Siddiqi, S.H. et al. Rapid radiometric methods to detect and differentiate Mycobacterium tuberculosis / M. bovis from other mycobacterial species. Amer. Rev. Respir. Dis., 130: , Stager, C.E. et al. Identification of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear-positive specimens by direct inoculation of the BACTEC NAP Test. Abstract C267, A.S.M. Annual Meeting, Las Vegas, NV,

5 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, BACTEC and Luer-Lok are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD.