Programmed cell death. Apoptose. (betyder at falde af på græsk) Alberts. Essential Cell Biology. Kap.18, side 625

Transkript

1 Programmed cell death. Apoptose (betyder at falde af på græsk) Alberts. Essential Cell Biology. Kap.18, side 625

2 Programmeret celledød eller apoptose er en central proces der styrer udviklingen af multicellulære organismer. Her ses hvordan apoptose 18_18_sculpts_digits.jpg styrer fjernelse af celler mellem fingrene på en mus. De lysegrønne celler er i apoptose

3 Det samme som forrige slide Downloaded from: StudentConsult (on 8 October :42 PM) 2005 Elsevier

4 Utrolig mange celler dør (ved apoptose) under udviklingen. Omkring halvdelen af alle nerveceller dør næsten med det samme. Nogle celler dør fordi de ikke længere skal bruges som f.eks haletudsens hale. I nervesystemet under udvikling er det for at tilpasse antallet af nerveceller til de celler der skal have nervekontakt. I den voksne organisme sørger apoptosen for at holde antallet af celler konstant så celledeling og apoptose matches præcist. Hvis ikke ville vævene vokse eller mindskes. Fra Haletudse til frø

5 Celler kan blive skadet og dø af necrose. Necrotiske celler svulmer og springer og frigør deres indhold hvilket giver inflammatoriske reaktioner og immunreaktioner mod stoffer der normalt ikke findes uden for cellen. Omvendt med apoptotiske celler der dør uden at gå istykker og frigøre noget celleindhóld, derfor er cytosolen stadig tæt farvet. Der er fyldt med vescicler der vil blive frigjort og som stadig har membran.

6 Her ses Nekrotiske celler der lyserer og som invaderes af fagocytotiske celler som giver inflamation Downloaded from: StudentConsult (on 8 October :42 PM) 2005 Elsevier

7 Apoptotiske celler skrumper og afsnører derpå apoptotiske legemer, der spises af andre celler. Det vigtige ved apoptose er at celleindholdet ikke frigøres som det gør ved nekrose.

8 Det ses her hvordan den apoptotiske celle skrumper og hvordan der dannes apototiske legemer. Det ses også at nabocellerne er upåvirkede Downloaded from: StudentConsult (on 8 October :42 PM) 2005 Elsevier

9 Figure 12.03: Apoptosis versus necrosis. Der er mange stimuli der starter apoptose Mangel på vækstfaktorer DNA skader fra γ stråling eller kemoterapeutiske stoffer Cytoskeletskader eller ER dysfunktion Varme, kulde og osmotiske stress Løsning fra underlaget (anoikis)

10 Den apoptotiske celle: 1. Cellen skrumper, kromosom kondensering 2. Kernemembranen opløses og DNA brydes i stykker, kernen fragmenterer. 3. Der dannes blebs (som er udposninger af membranen). 4. Der dannes vakuoler i cytoplasma. 5. Cellen opløses i apoptotiske legemer. 6. Phosphatidylserin redistribueres fra indersiden af membranen til ydersiden af membranen. Andre celler bruger det til at kende den døende celle

11 En intracellulær proteolytisk cascade er ansvarlig for apoptosen Apoptose afhænger af en række cystein-metalloproteaser med cystein i deres aktive site (caspaser). De kløver proteinerne efter en asparaginsyre. 14 caspaser er blevet identificeret. Caspaser dannes som inaktive procaspaser der aktiveres af proteolytisk kløvning. Adaptor proteinet Apaf-1 bringer mange inaktive procaspaser sammen og en ganske lille aktivitet starter processen. Så snart der er en aktiv caspase aktiverer den de næste o.s.v. Det aktive caspase enzym består af to af disse dvs det er en tetramer Fig A

12 Men hvordan aktiveres så initiator Caspaserne. Initiator Caspaserne findes som monomere med et prodomæne der indeholder protein bindende motiver som caspaserecruitment domænet (CARD) og death effector domænet (DED), fælles kaldes de death fold Figure 12.07: Initiator Caspaser aktiveres når et adaptorprotein binder deres prodomæne og bringer dem sammen som dimere.

13 Hver aktiveret caspase kan kløve mange procaspaser og aktivere dem. På den måde kan aktivering af nogle få initiator caspaser hurtigt blive til mange ved en kædereaktion. Caspaserne kløver derpå en lang række proteiner Fig B

14 Man snakker om initiator caspaser og effektor caspaser. Initiator caspaser kløver andre procaspaser og effektor caspaser kløver andre proteiner. Caspase 8 og 9 er de kendte initiator caspaser og caspase 3 den kendteste effektor caspase. Apoptotisk signal initiator pro-caspase - initiator caspase effector pro-caspase effektor caspase - proteinkløvning

15 Proteiner af Bcl-2 familien Proteiner af Bcl-2 familien er centrale i apoptosen. Der er proapoptotiske og antiapoptotiske medlemmer af familien. Bcl-2 er antiapoptotisk Bad inaktiverer Bcl-2 og er proapoptotisk Bax og Bak som laver porer i mitochondrierne er proapoptotiske Bid som aktiverer Bax og Bak er proapoptotisk

16 Bcl-2 er antiapoptotisk fordi det binder til aktivationsfaktoren (adaptorproteinet) Apaf så den ikke kan bringe initiatorprocaspaserne sammen. Man kan så initiere apoptose ved at aktivere en hæmmer af Bcl-2, (Bad f.eks.) Bcl-2 er antiapoptotisk f.eks. Bad Bad er proapoptotisk Bcl-2 hæmmer aktiveringen af effektorcaspaser ved at hæmme aktiveringen af intiator procaspaser

17

18 Bax og Bak er proapoptotiske proteiner fordi de laver en pore i mitochondriemembranen det såkaldte permeability transition pore complex (PTPC) så Cytochrom C kan komme ud. Cytochrom C binder til et adaptor protein (Apaf-1) 18_22_Bcl_2_family.jpg som binder og aggregerer procaspase 9 molekyler som aktiverer hinanden.

19 De proapoptotiske Cytochrom C lækker ud gennem permeability transition pore complex (PTPC) som styres af en række Bcl-2 proteiner som Bax,Bak og Bid Apaf og procaspase -9 spiller en afgørende rolle i hjernens normale udvikling

20 Figure 12.17: Cytochrome c frigørelsen fra et mitochondrie

21 Ekstracellulær kontrol med celledeling, cellevækst og apoptose s. 628 Et befrugtet museæg og et befrugtet menneskeæg har samme størrelse alligevel ender menneskeægget med at blive til et individ af meget større størrelse, hvad betinger det? Hvad bestemmer at elefanten får en lang snabel? Hvorfor bliver leveren ikke 10 gange så stor? Det hele bestemmes af forholdet mellem cellevækst og celledeling på den ene side og programmeret celledød på den anden side.

22 De ekstracellulære signaler der stimulerer celledeling, cellevækst og celleoverlevelse Mitogener der stimulerer celledeling (celleproliferation) Vækstfaktorer der stimulerer cellevækst (forøgelse af cellemasse) Overlevelsesfaktorer der undertrykker apoptose

23 Mitogener stimulerer celledeling (celleproliferation) Eksempel: Retinoblastoma(Rb) proteinet holder visse genregulatoriske proteiner inaktive så transkription af cellecyclus proteiner ikke kan foregå 18_23_01_mitogens.jpg Ordet retinoblastoma kommer fra at proteinet blev opdaget ved en tumour i retina i øjet hvor proteinet var defekt og der derfor foregik for mange celledelinger

24 Når et mitogen stimulerer sin receptor ophæves hæmningen f.eks. PDGF 18_23_02_mitogens.jpg Ras MAPkinaser Gen regulatorisk protein Nydannede Cyclin- Cdk`er fosforylerer Retinoblastoma(Rb)

25 Vækstfaktorer stimulerer celler til at akkumulere proteiner og andre makromolekyler der stimulerer protein syntese og hæmmer protein degradering. 18_25_growth_factors.jpg ras MAP kinase Gen regulatorisk protein PDGF og andre mitogener kan både virke som mitogener (stimulere celledeling) og som vækstfaktorer (stimulere cellevækst)

26 En fibroblast cellekultur i vækst. Der er tilsat serum som indeholder både vækstfaktorer og mutagener så cellerne både gror og deler sig 18_24_SEM_fibroblast.jpg Celler i deling

27 Apoptose startes udefra på to måder Mangel på overlevelsesfaktor Aktivering af dødsreceptorer

28 Naboceller konkurerer om overlevelsesfaktorer. Dvs at ved stor celletæthed induceres apoptose Dette er vigtigt for at forhindre proliferation udover en ønsket tæthed, kaldes density-dependent inhibition of cell division.

29 Target cellerne laver survival factors. Der dannes for mange nerveceller og de konkurerer hinanden ud med hensyn til survival factors. De der ikke får nok går i apoptose og derved tilpasses antallet 18_27_nerve_target.jpg at nerveceller til antallet af modtagerceller.

30 Ekstracellulære overlevelsesfaktorer hæmmer apoptose. Normalt hæmmer Bad Bcl-2. Når en overlevelsesfaktor sætter sig på receptoren stimuleres PI3 kinasen som stimulerer proteinkinase B(PKB). Den fosforylerer og inaktiverer Bad og Bcl-2 bliver aktiv og hæmmer apoptose PI-3 kinase- PKB signalvejen f.eks. Bax

31 Fra overlevelsesfaktorreceptoren over PI-3 kinasen og PKB (kaldet Akt) til hæmning af apoptose. PI-3 kinasen binder til phosphotyrosin på receptoren, den aktiveres og fosforylerer PI (4,5)P2 til PI(3,4,5)P3). Denne fungerer som docking site for en Phosphatidyl dependent kinase (PDK1) og for PKB som bliver aktiveret. Hvordan vækststimulering hæmmer apoptose Aktiveret PKB

32 Ekstracellulære overlevelsesfaktorer hæmmer apoptose. Normalt hæmmer Bad Bcl-2. Når en overlevelsesfaktor sætter sig på receptoren stimuleres PI3 kinasen som stimulerer proteinkinase B(PKB). Den fosforylerer og inaktiverer Bad og Bcl-2 bliver aktiv og hæmmer apoptose f.eks. Bax

33 I nærvær af overlevelsesfaktor stimuleres også ekspressionen af Bcl-2 Bcl-2 er antiapoptotisk

34 Apoptoseprocessen kan også startes udefra ved aktivering af døds receptorer som tilhører TNF receptorfamilien. En kendt dødsreceptor er CD95 (også kaldet Fas eller Apo-1). Receptorerne clustrer og binder adaptorproteiner der binder procaspaser ( her procaspase 8) som aktiverer hinanden. (står ikke i bogen skal ikke kunnes) Killer lymphocytes har en vigtig rolle i at fjerne kræftceller. Visse kræftceller udskiller et protein der binder til Fas liganden på Killer Lymphocytterne og undslipper derved destruktion

35 Der er andre væksthæmmere end FAS, det er agonister som hæmmer vækst og proliferation men i modsætning til FAS ikke laver apoptose. I muskler findes f.eks. Myostatin et signalprotein 18_29_myostatin_gene.jpg der stopper vækst uden lave apoptose. Hvis det muteres fås meget store muskler som her i en Belgian Blue ko.

36 Celleskrumpning er et af de karakteristiske tegn på apoptose men er celleskrumpningen et signal til apoptose??

37 NIH 3T3 celler efter voksende tid i højt salt medium For at undersøge det tilsætter vi en høj salt koncentration som skrumper cellerne uden at de har fået nogen egentlig apoptotisk stimuli. Starter det apoptose? Hvis ja hvilken signalvej er så involveret? Herfra og ud er kun for sjov og skal ikke terpes til eksamen 25μm 1.5 hours 3 hours 4.5 hours 5.5 hours High salt (687 mosm)

38 Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts Friis et al. J. Physiol (2005). Vol.567.2, pp

39 Western blot analysis of shrinkage-induced changes in the level of p38 MAPK phosphorylation in NIH 3T3 cells Forsøg Linda Schneider With Antibodies to phospho-p38 MAPK (thr180/tyr182)) Same results for phospho-jnk1

40 Western blot analysis of shrinkage-induced changes in the level of p38 MAPK phosphorylation in NIH 3T3 cells and in RACV 12 A 3 cells With Antibodies to phospho-p38 MAPK (thr180/tyr182)) Rac is upstream of p38

41 P53 genomets vogter Den cellulære concentration af p53 stiger når der forekommer DNA skader, kontrollen er post-transkriptionel idet translationen af eksisterende mrna øges. Samtidig stabiliseres p53 også og holder længere. Ilt mangel kan også inducere p53 ligesom celleskrumpning kan P53 er en essentiel nødbremse i cellecyklus når DNA skader opstår, hvilket bevises af at p53 genet er muteret i op til halvdelen af alle kræfttilfælde Når det forhøjede p53 niveau har stoppet cellens cyklus får cellen tid til at rette skaderne, niveauet af p53 falder igen og cyklus fortsætter. Er skaderne for store startes apoptose (programmeret celledød)

42 Hyperosmotic shock induces phosphorylation at Ser15 of the transcription factor p53 and translocation of pp53 to the nucleus

43 Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts Friis et al. J. Physiol (2005). Vol.567.2, pp Denne artikel er ikke pensum, det er bare en sjov historie der belyser det emne vi gennemgår. De næste 10 slides er fra vores artikel

44 Caspase 3 activity in NIH 3T3 wt and RacV12A3 cells Caspase 3 activity, nmol pna/min per mg protein Rac is part of the signalling sequence upstream to caspase-3 Up to 4.5 hours there are no necrotic cells

45 Model for signalering efter celleskrumpning Short time effects Isotonic Hypertonic inhibited Shrinkage Volume censors stimulated Integrins Rho Rac Growth factor receptors JNK P38 P53 Ras PI3K Erk1/2 Akt/PKB

46 Fosfo-PDGFRβ py857 Intensity, relative values Intensitetsforhold +/- PDGF-BB 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0, Inkubationstider Time after addition of PDGF-BB Isoton Sucrose Cell shrinkage inhibits the sensitivity of the PDGFRβ dramatically Intensity, relative values 30,00 Intensitetsforhold +/- PDGF-BB 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Fosfo-Mek Inkubationstider Intensity, relative values 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Fosfo-Erk1/ Inkubationstider