Enzyme-linked receptors p557- p566

Transkript

1 Enzyme-linked receptors p557- p

2 Hvor sidder receptoren er agonisten lipid permeabel? 16_09_molecules_bind.jpg

3 Peptid-ligander binder til membran associerede receptorer Receptorer A A A A B A B B Cellen overlever A A A B B B Cellen deler sig proliferation A A A B C B B C C D D D Cellen specialiserer sig - differentiering Cellen dør - apoptosis

4 Receptorer med indbygget kinase aktivitet Ligand bindende domæne Ydersiden Kinase domæne Indersiden Fosforylering af Tyrosin, Serin, Threonin

5 Tænd/sluk af et signal 2 løsninger 16_15_molec_switches.jpg Hvor meget et protein er fosforyleret afspejler en balance mellem kinasers og fosfatasers aktivitet. GTP koncentrationen er højere end GDP, derfor er sandsynligheden for at GTP sætter sig når GDP er frigjort meget stor.

6 Hvilke aminosyrer fosforyleres? 04_03_20 amino acids.jpg Indeholder en OH grupper, der kan phosphoryleres

7 Fosforylering Substrater: Serin, Threonin, Tyrosin, Histidin Effekt: Aktivering / inaktivering af en signaleringskaskade

8 Signal De fleste fosfataser stimuleres ved en stignig i substrate koncentrationen, dvs i koncentrationen af fosforyleret protein Second messenger - Enzymer Protein Fosfatase Hvor meget et protein er fosforyleret afspejler en balance mellem kinasers og fosfatasers aktivitet Protein Protein- P Protein Kinase, ATP Second messenger - Enzymer Signal

9 Protein Tyrosine Phosphatase PTP1B Cys 215 Tyrosin-fosfatasen har et aktivt center, der genkender substratets fosforylerede tyrosi. Dette center indeholder sekvensen: 215 Cys-Ser-Ala-Gly-Ile-Gly-Arg 221

10 Defosforylering Dannelse af et cysteinyl fosfat-intermediate O Hydrolysis af intermediatet HO P O - OH Phosphate O HO V O - OH Vanadate

11 Enzymkoblede receptorer har kun ét transmembranelt segment - receptorens ydre/ligand-bindende domæne er forbundet med det intracellulære kinase-domæne via en α-helix Ligand bindende domæne The hydrocarbon core of a membrane is typically 30Å A membrane spanning sequence consists of about 20 predominantly non-polar and uncharged amino acids arranged in an α-helical configuration Kinase domæne 3.6 residues per turn

12 Polaritetsskala til identifikation af aminosyrer i den transmembranale α-helix Phe 3.7 kcal/mol Met Ile Leu Val Cys Trp Ala Thr Gly Ser Pro Tyr His Gln Asn Glu Lys Asp Arg Den energi, der skal til for at bringe en aminosyre i α-helixen fra at være i kontakt med membranens indre til at være i kontaktmed den ydre, vandige fase. G > 0 Det vil være koste energi at føre aminosyren Phe fra det indre af membranen til den ydre, vandige fase overførslen er derfor højt u-favorabel G < 0 Overførsel af den positive ladning i aminosyren Arg fra det indre af membranen til den ydre, vandige fase er højt favorabel Berg, Tymoczko, Stryer Biochemistry, Fifth edition

13 Problem En konformations ændring kan ikke forplante sig igennem α-helixen! Ligand bindende domæne Løsning Dimerisering efterfulgt af en gensidig fosforylering den alternative løsning Dimerisering Kinase domæne Fosforylering

14 16_30_rec_tyro_kinase.jpg Agonisten er en dimer Dannelse af en stabil receptor dimer Autophosphorylering af tyrosiner Docking sites for proteiner, der har et SH2 domæne

15 16_30_rec_tyro_kinase.jpg Agonisten er en dimer Dannelse af en stabil receptor dimer Autophosphorylering af tyrosiner Docking sites for proteiner, der har et SH2 domæne Adaptor proteiner fungerer som en stikdåse

16 Domains der er involveret i interaktion mellem Protein-Protein & Protein-Lipid Src-genet koder for en cytosolisk tyrosinkinase - Rous asian sarcoma tyrosin kinase SH1 SH2 SH3 PH Domainer svarer til det enzymatiske domæne i Src Omkring 100 aminosyrer, der også findes i Src SH2 domænet binder til et substrat, der indeholder sekvensen: -fosfotyrosin- glutaminsyre-glutaminsyre-isoleucin Omkring aminosyrer, der også findes i Src SH3 domænet binder sig til substrater med proline-rige sekvenser Omkring 110 aminosyrer, der også findes i Pleckstrin PH domainet binder sig til bådelipider og proteiner

17 Ved at gå på jagt efter SH2 domæner i et protein kan man få et indtryk af om proteinet vil binde til et fosforyleret tyrosinsite på en receptor

18 Vækstfaktor-receptor docking-induceret aktivering PI 3 Kinasen Src cytosolic tyrosine kinases Ras et GTP bindende protein Phospholipase Cγ spalter fosfolipider NB. Kun den ene monomer af receptor dimeren er vist

19 PI3 Kinasen har 2 SH2 domæner aktivering af PI3K medfører dannelse af phosphorylerede sites ved membranen, som binder andre kinaser PKB. PtdIns(3)P PtdIns(3,4)P 2 PtdIns(3,4,5)P 3 Membran Phosphoinositide 3 kinase PtdIns PtdIns(4)P PtdIns(4,5)P2 βpdge-receptor PI3-kinase SH3 N-SH2 C-SH2 P Tyrosin 708 / 719 Y-x-x-M-

20 NH 2 Active Catalytic domain SH3 SH2 Y 416 Y 527 COOH Myristoylation Src is born tyrosine Dephosphorylation of Y 527 phosphorylated at Y 527 breaks the SH2-binding, and the enzyme is exposes the catalytic domain locked and inactive and activates the kinase HOOC Y 527 P NH 2 SH3 SH2 Y 416 Inactive c-src kinase Belongs to the Src family of cytosolic tyrosine kinases (Src, Fyn, Lck.) SH2 and SH3 domains Myristoylated

21 16_31_active_Ras.jpg Ras Aktivering af det GTP-bindende protein Ras Sidder tilhæftet med en fedtsyrekæde

22 Dele af α-subuniten fra det trimere GTP-bindende 16_31_active_Ras.jpg protein minder om

23 Ras - aktiv 16_31_active_Ras.jpg GTP GDP Gennemsnitslevetid 1 min Guanin nukleotid Exchange faktor GTPase aktiverende Protein GTP Ras - inaktiv GDP Ras skal aktiveres af det Ras-activerende protein

24 PLC med og uden SH2 domæner PLC-β PH X Y PLC-γ SH2 SH3 PH X PH Y PLC-δ PH X Y

25 Ved kløvning frigør PLC to messengers: den vandopløselige IP 3 den membranfikserede DAG

26 16_25_PhospholipaseC.jpg DAG forbliver i membranen Trimere GTP bindende proteiner IP 3 frigives til den vandige fase

27 Stimulering af PI-3K, PKC og PKB med insulin

28 Stimulering af MAP-kaskaden med insulin en 6 trins-raket IRS insulin receptor substrate: Binder til den fosforylerede insulin receptor via sit SH2 domæne IRS fosforyleres dernæst på sine Tyrosiner af insulinreceptorens kinase-aktivitet

29 GBR2 et adaptor protein with to bindings domæner SH2 domænet binder GBR2 til IRS SH3 domænet binder GBR2 til Sos

30 Gennemsnitslevetid 1 min Ras - aktiv GDP GTP Sos Guanin nukleotid Exchange faktor GTPase aktiverende Protein GTP Ras - inaktiv GDP Sos et nukleotid exchange protein ved binding af Sos til GBR2 øges evnen hos Sos til at udskifte GDP med GTP på Ras

31 Mitogen Aktiverede Protein kinase signalering Raf-1 MEK Erk

32 16_32_MAP-kinase.jpg Raf Aktivering af den Mitogen Aktiverede Protein kinase kaskaden 3 forskellige enzymer!

33 MAP-KKK MAP-KK Raf MEK 1/2 MEKK MAPK ERK 1/2 p38 cjun JNK

34 Hvordan afkobler vi signalet Desensibilisering/Nedregulering af receptoren Defosforylering af P-Tyr på receptoren Defosforylering af P-sites på down-stream elementer i signaleringskaskaden Spaltning af GTP til GDP

35 Inaktivering internalisering af agonist-receptor komplekset βark: β-adrenergic protein kinase βarr: β-arrestin

36 Mutationer - I Tropomyocin danner er spiral Det extracellulære domæne af tyrosinkinase-receptoren udskiftes med en nonmuskulær tropomyosin Dimerization Increased kinase activity

37 Mutationer - II Tab af extracellulært ligand-bindings domæne Resulterer i en konstitutiv aktiv receptor Udskiftning af aminosyren Valin med Glutamin resultere i dimerisering af to receptorer i fravær af ligand

38 Punktmutationer tyrosin udskiftes med alanin 16_33_Mutant_proteins.jpg Bemærk at den signalering, der normalt er nedstrøms, udebliver

39 16_34_Ras_transmits.jpg Konstitutiv aktiv Ras

40 Den velfungerende kaskade 16_35_act_in_pathway.jpg

41 16_35_act_in_pathway.jpg GDP bliver ikke udskiftet med GTP GTP sidder permanent i Ras-sitet

42 16_35_act_in_pathway.jpg Intet signal også selvom Ras er konstitutiv aktiv

43 Receptor stimulering??? Ændring i gentranskription

44 Receptor stimulering fører til en øget gen-transcription 16_24_cAMP_activate.jpg

45 16_24_cAMP_activate.jpg Receptor stimulering fører til en øget transcription check hvilke elementer, der er bragt på banen

46 16_36_Cytokine_recpt.jpg Reseptoren har ingen kinase aktivitet men det har JAK Receptor stimulering fører til en øget transcription

47 16_36_Cytokine_recpt.jpg Reseptoren har ingen kinase aktivitet Receptor stimulering fører til en øget transcription check hvilke elementer, der er bragt på banenen

48 16_37_TGF_B_receptor.jpg Receptor stimulering fører til en øget transcription

49 16_37_TGF_B_receptor.jpg Receptor stimulering fører til en øget transcription check hvilke elementer, der er bragt på banenen

50 16_38_Signal_pathways.jpg Cross talk - Hvem modulerer hvem?

51 Downstream signaling camp PKA - aktiv Proteiner fosforyleres på forskellige sites

52 Hvordan påviser man tilstedeværelsen og den subcellulære lokalisering af elementer i en signaleringskaskade?

53 Pharmakologisk angrebsvinkel

54 Isotonic 300 mosm Hypotonic 150 mosm Fortyndes cellers ekstracellulære miljø sker der følgende: Cellerne svulmer initielt som osmometrer Svulmningen fører til aktivering af en række membranbundne transportsystemer for ioner og organiske osmolytter Cellen taber osmolytter og vand Cellen genvinder sit volumen Water KCl-cotransporter Organic osmolyte channel Separate K + and Cl - channels Ehrlich ascites tumor cell, Hoffmann 1979

55 Det volumenregulatoriske response kræver PLA 2 aktivitet 2000 Cell volume, fl RO Control Hæmning af PLA Time, min

56 Celle svulmning Aktivering af PLA 2 aktivitet Aktivering af transportsystemer for osmolytter netto tab af osmolytter justering af cellevolumet

57 Påvisning af tilstedeværelse af de formodede elementer i signaleringskaskaden ved elektroforese og Westernblot Er der en PLA 2 tilstede? Alle proteiner er indpakket i SDS

58 Proteinerne er adskildt efter størrelse i gelen små molekyler er vandret længst

59 Alle bånd er overført fra gelen til en special-membran hvor proteinerne visualiseres med en proteinfarvning Molekylevægten er kendt men hvilket protein er der tale om?

60 Identifikation af PLA 2 subtypen med specifikke antistoffer

61

62 Identifikation af PLA 2 subtypen med Western blot og specifikke antistoffer cpla 2α Enzymet er både i cytosolen og i kernen - men er det altid det?

63 Subcellulær lokalisering Translocation of cpla 2α from the cytosol to the perinuclear membrane following cell swelling Confocal cross sections through one single Ehrlich cells Green: cpla 2α, FITC-conjugated antibody Red: Plasma membrane Tetramethyl-rhodamine cojugated wheat germ agglutinin 0.25 µm Pedersen, Lambert, Thoroed, Hoffmann Eur J Biochem 267, , 2000

64 Er proteiner i tæt kontakt med hinanden? Protein komponenter skal sidde tæt for at FRET systemet fungerer

65 Fint signal Bemærk at signalet forsvinder idet øjeblik PKA er aktiveret