8.1 Experimental setup

Transkript

1 8 Appendix Contents 8 Appendix Experimental setup Raw data Pilot experiment: Maturation with LPS Pilot experiment: Isolation kits, maturation with LPS and CD11c Pilot experiment: Column types Maturation with CD11c CD11c distribution Internalization of CD11c Maturation with CD11c BU Internalization of CD11c 3.9 and BU CD11c distribution Protocols DC differentiation and flow cytometry protocol Flow cytometric analysis protocol Internalization protocol T18 protocol Analysebrugsanvisning

2 8.1 Experimental setup Dish no Sample aliases Date Monocyte isolation method 1.1 AB paa PBMC Isotype paa PBMC 3.1 U AB U CD3-CD19 U CD14 ISO U AB ISO U CD3-CD19 ISO U CD M AB M CD3-CD19 M CD14 ISO M AB ISO M CD3-CD19 ISO M CD MS U ISO MS U 4.2 LS U LS U CD3 CD19 ISO LS U ISO LS U CD3 CD LS M LS M CD3 CD19 ISO LS M ISO LS M CD3 CD LS ISO LS LS ISO LS CD14 U CD14 U CD3 CD19 ISO CD14 U ISO CD14 U CD3 CD CD14 M ISO CD14 M f Gl U ISO 4-f Gl U 3-f Gl U ISO 3-f Gl U Column type Maturation stimulus Analysis Sections Flow (astrios) Monocyte MS - Flow Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II MS LPS Flow MS - Flow MS - Flow MS LPS Flow Monocyte Isolation Kit II MS CD11c 3.9 Flow Monocyte MS CD11c 3.9 Flow Isolation Kit II CD14 + -kit MS - Flow CD14 + -kit MS LPS Flow Monocyte D - Flow Isolation Kit II Microscopy f Gl M ISO 4-f Gl M 3-f Gl M ISO 3-f Gl M f Ny U ISO 4-f Ny U 3-f Gl U ISO 3-f Ny U f Ny M ISO 4-f Ny M 3-f Ny M ISO 3-f Ny M f U ISO 4-f U 3-f U ISO 3-f U f M ISO 4-f M 3-f M ISO 3-f M f 1ug 3.9 ISO 4-f 1ug f 1ug 3.9 ISO 3-f 1ug Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II D LPS Flow Microscopy LS - Flow Microscopy LS LPS Flow Microscopy D - Flow Microscopy D LPS Flow Microscopy D CD11c 3.9 Flow Microscopy

3 6.4 4-f 5ug 3.9 ISO 4-f 5ug f 5ug 3.9 ISO 3-f 5ug M 1 ISO M 1 M 2 ISO M 2 M 3 ISO M PBMC 1 ISO PBMC 1 PBMC 2 ISO PBMC 2 PBMC 3 ISO PBMC PM 1 ISO PM 1 PM 2 ISO PM 2 PM 3 ISO PM WB 1 ISO WB 1 WB 2 ISO WB 2 WB 3 ISO WB M ISO M 9.2 U ISO U 9.3 CD11c 4 CD11c 37 IgG 4 IgG U U T+B ISO U ISO U T+B 10.2 M M T+B ISO M ISO M T+B ug 1 ug T+B ISO 1 ug ISO 1 ug T+B ug 5 ug T+B ISO 5 ug ISO 5 ug T+B BU15 4 BU15 37 IgG 4 IgG BU15 4 BU15 37 IgG 4 IgG WB 1 ISO WB 1 WB 2 ISO WB PBMC 1 ISO PBMC 1 PBMC 2 ISO PBMC M 1 ISO M 1 M 2 ISO M Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II D CD11c 3.9 Flow Microscopy MS - Flow Flow CD14 + -kit MS - Flow Flow CD14 + -kit MS LPS Flow CD14 + -kit MS - Flow Monocyte D - Confocal Isolation Kit II microscopy Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II Monocyte Isolation Kit II D - Flow D LPS Flow D CD11c BU15 Flow D CD11c BU15 Flow D - Confocal microscopy Flow D - Confocal microscopy Flow Flow Flow Monocyte MS - Flow Isolation Kit II Figure 8.1. Overview over the experimental setup. Each culture dish was numbered throughout the experiment, and for each dish is listed the procedures of the DCs in it; monocyte isolation kit, column used for separation, maturation stimulus and analysis method(s). Aliases for samples from each dish is listed the same way they were used in flow. The date for each experiment analysis is listed. Section numbers are listed for the ease of finding a given sample in the appendix. 64

4 8.2 Raw data Pilot experiment: Maturation with LPS Figure 8.2. Raw flow cytometric data for dish 3.1. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD14-PE, HLA-DR-APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG2a,k- APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 65

5 Figure 8.3. Raw flow cytometric data for dish 3.2. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD14-PE, HLA-DR-APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG2a,k- APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 66

6 8.2.2 Pilot experiment: Isolation kits, maturation with LPS and CD11c 3.9 Figure 8.4. Raw flow cytometric data for dish 4.1. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for HLA-DR- APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE. Corresponding isotypes were used; IgG2a,k-APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k- PE. 67

9 Figure 8.7. Raw flow cytometric data for dish 4.4. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for HLA-DR- APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE. Corresponding isotypes were used; IgG2a,k-APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k- PE. 70

10 Figure 8.8. Raw flow cytometric data for dish 4.5. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for HLA-DR- APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE. Corresponding isotypes were used; IgG2a,k-APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k- PE. 71

12 Figure Raw flow cytometric data for dish 4.7. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for HLA-DR- APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE. Corresponding isotypes were used; IgG2a,k-APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k- PE. 73

13 8.2.3 Pilot experiment: Column types Figure Raw flow cytometric data for dish 5.1. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD14-PE, HLA-DR-APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG2a,k- APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 74

14 Figure Raw flow cytometric data for dish 5.2. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD14-PE, HLA-DR-APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG2a,k- APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 75

17 D column, immature Dish 5.1 D column, mature Dish 5.2 LS column, immature Dish 5.3 LS column, mature X20 Dish 5.4 Figure Phase contrast microscopy images (20x objective) of immature (left images) and mature (right images) DC populations. Top images are DCs generated from monocytes isolated with Monocyte Isolation Kit II using a D column, bottom images are DCs generated from monocytes isolated with Monocyte Isolation Kit II using a LS column. 78

18 8.2.4 Maturation with CD11c 3.9 Figure Raw flow cytometric data for dish 6.1. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD14-PE, HLA-DR-APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG2a,k- APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 79

22 D column, immature Dish 6.1 D column, LPS mature Dish 6.2 D column, 1 µg/ml 3.9 Dish 6.3 D column, 5 µg/ml 3.9 X20 Dish 6.4 Figure Phase contrast microscopy images (20x objective) of DC populations: Immature (top left image), cultured with LPS for 24 hours (top right images), cultured with 1 µg/ml CD11c 3.9 for 24 hours (bottom left) and cultures with 5 µg/ml CD11c 3.9 for 24 hours. 83

23 8.2.5 CD11c distribution CD11c distribution in whole blood Figure Raw flow cytometric data for dish 8.4. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD14-PE, HLA-DR-APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG2a,k- APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 84

24 CD11c distribution in PBMCs Figure Raw flow cytometric data for dish 8.2. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD14-PE, HLA-DR-APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG2a,k- APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 85

25 CD11c distribution in monocytes isolated with Monocyte Isolation Kit II Figure Raw flow cytometric data for dish 8.1. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD14-PE, HLA-DR-APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG2a,k- APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 86

26 CD11c distribution in monocytes isolated with CD14 + kit Figure Raw flow cytometric data for dish 8.3. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD14-PE, HLA-DR-APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG2a,k- APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 87

27 CD11c distribution in PBMCs analyzed on Astrios MoFlo Figure Raw flow cytometric data for dish 1.1. Top 2 dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Bottom 3 dot plots: The y-axis represents the fluorescence intensity for respectively CD14-FITC, CD141-APC and HLA-DR-APC-H7, x-axis represents fluorescence intensity for CD11c-PE. 88

28 8.2.6 Internalization of CD11c 3.9 Figure Raw flow cytometric data for dish 9.1. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for HLA-DR- APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE. Corresponding isotypes were used; IgG2a,k-APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k- PE. 89

29 Figure Raw flow cytometric data for dish 9.2. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for HLA-DR- APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE. Corresponding isotypes were used; IgG2a,k-APC-H7, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k- PE. 90

30 Figure Dish 9.3, IgG incubated at 4 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. Figure Dish 9.3, IgG incubated at 37 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. 91

31 Figure Dish 9.3, CD11c 3.9 incubated at 4 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. Figure Dish 9.3, CD11c 3.9 incubated at 37 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. 92

32 Figure Dish 9.3, secondary stain control with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. 93

33 MFI Isotype subtracted CD11c C 24,78 23,65 CD11c C 17,99 17,04 IgG 4 C 1,13 - IgG 37 C 0,95 - Calculation Internalization % CD11c 3.9 (23,65-17,04)/23,65*100 27,95 Figure CD11c 3.9 internalization flow cytometric data and percentage calculations thereof. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD11c antibodies stained with Goat-anti-mouse Alexa

34 8.2.7 Maturation with CD11c BU15 Figure Raw flow cytometric data for dish Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for HLA-DR- APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG2a,k-APC-H7, IgG1,k-Pe- Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 95

35 Figure Raw flow cytometric data for dish Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for HLA-DR- APC-H7, CD80-Pe-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG2a,k-APC-H7, IgG1,k-Pe- Cy5, IgG1,k-APC, IgG1,k-PE, IgG2a,k-FITC and IgG1,k-APC 96

38 MFI Isotype subtracted CD11c C 36,39 33,56 CD11c C 30,06 28,1 CD11c BU15 4 C 38,45 35,62 CD11c BU15 37 C 33,08 31,12 IgG 4 C 2,83 - IgG 37 C 1,96 - Calculation Internalization % CD11c 3.9 (33,56-28,1)/33,56*100 16,27 CD11c BU15 (35,62-31,12)/35,62*100 12,63 Figure CD11c 3.9 and BU15 internalization flow cytometric data and percentage calculations thereof. Dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD11c antibodies stained with Goat-anti-mouse Alexa

39 8.2.8 Internalization of CD11c 3.9 and BU15 Figure Dish 11.1, IgG incubated at 4 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. Figure Dish 11.1, IgG incubated at 4 o C for 60 minutes. Stained with HLA-DR Alexa 647, 100x objective. 100

40 Figure Dish 11.1, IgG incubated at 37 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. Figure Dish 11.1, IgG incubated at 37 o C for 60 minutes. Stained with HLA-DR Alexa 647, 100x objective. 101

41 Figure Dish incubated 4 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. Figure Dish 11.1, 3.9 incubated 4 o C for 60 minutes. Stained with HLA-DR Alexa 647, 100x objective. 102

42 Figure Dish incubated 37 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. Figure Dish 11.1, 3.9 incubated 37 o C for 60 minutes. Stained with HLA-DR Alexa 647, 100x objective. 103

43 Figure Dish 11.1, BU15 incubated at 4 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. Figure Dish 11.1, BU15 incubated at 4 o C for 60 minutes. Stained with HLA-DR Alexa 647, 100x objective. 104

44 Figure Dish 11.1, BU15 incubated 37 o C for 60 minutes. Stained with Goat-anti-mouse Alexa 488, 100x objective. Figure Dish 11.1, BU15 incubated at 37 o C for 60 minutes. Stained with HLA-DR Alexa 647, 100x objective. 105

45 8.2.9 CD11c distribution CD11c distribution in whole blood Figure Raw flow cytometric data for dish 7.1. Let and middle dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Right dot plot: The y-axis represents forward scatter area (FSC-A), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD11c-PE, CD14-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG2a,k-FITC and IgG1,k- APC. 106

46 CD11c distribution in PBMCs Figure Raw flow cytometric data for dish 7.2. Let and middle dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Right dot plot: The y-axis represents forward scatter area (FSC-A), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD11c-PE, CD14-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG2a,k-FITC and IgG1,k- APC. 107

47 CD11c distribution in monocytes isolated with Monocyte Isolation Kit II Figure Raw flow cytometric data for dish 7.3. Let and middle dot plots: The y-axis represents side scatter height (SSC-H), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Right dot plot: The y-axis represents forward scatter area (FSC-A), x-axis represents the forward scatter height (FSC-H). Histograms: The y-axis represents the cell count, x-axis represents fluorescence intensity for CD11c-PE, CD14-PE, CD3-FITC and CD19-APC. Corresponding isotypes were used; IgG1,k-PE, IgG1,k-Pe-Cy5, IgG2a,k-FITC and IgG1,k- APC. 108

48 8.3 Protocols DC differentiation and flow cytometry protocol Differentiering af dendritiske celler fra monocytter isoleret med Monocyte Isolation Kit II Forsøgsopsætning Dag 0 - Oprensning af PBMC med Lymphoprep - Monocyt isolering - Tilsætning af medie + cytokiner Dag 3 - Tilsætning af medie + cytokiner Dag 5 - Tilsætning af medie + cytokiner Dag 6-24 timer før høst af modne dendritiske celler tilføjes modnings stimulus Dag 7 - Høst af umodne og modne dendritiske celler Materialer - Fuldblod (friskt, udtaget samme dag som opsætning) - Lymphoprep, densitet 1.077± g/ml (sterilt) (Medinor, ) - EDTA (Sigma, E5134, Cas ) - Trypan blå (0.4 %) (Sigma, 93595) - RPMI 1640 med 25mM HEPES uden glutamin (Invitrogen/Life Technologies, ) - L-Glutamine (stock konc. 100mM) (Invitrogen, ) - Penicillin/Streptomycin (P: 10,000 U/ml / S: 10,000 μl/ml) (Sigma-Aldrich, P433) - FCS (fra LSR-gruppen, lot nr. 41G2300K, aliquot 23) - Human GM-CSF (stock 100 μg/ml) (Peprotech, ) - Human IL-4 (stock 100 μg/ml) (Peprotech, ) - LPS (stock 10μg/ml) (Sigma, E.coli 0111:34) - BSA (Sigma, A2153, Cas ) - Natriumazid (Merck, , Cas ) - PBS + 1% formaldehyd (VWR, ) - 1X PBS (Amresco, E ML) - Monocyte isolation kit II (Miltenyi, ) - MS Columns (Miltenyi, ) - MACS Separator (Miltenyi, ) - MACS MultiStand (Miltenyi, ) Opskrifter RMPI % P/S, 500 ml - 5ml P/S tilsættes 500 ml RPMI1640 RP-10 (150 ml) - RPMI1640 med 1 % P/S (135.5 ml) - 2mM L-glutamine (1.5 ml) - 10% varmeinaktiveret FCS (15 ml) - Behøves ikke sterilfiltrering, da alle komponenter er sterile. Skal holdes sterilt PBS + 1 mm EDTA, 200 ml - 0,4 ml EDTA (stock 0,5 M) opløses i 200 ml 1XPBS Antistoffer - HLA-DR-APC-H7 (BD, ) - CD80-PE-Cy5 (BD, ) - CD86-PE (BD, ) - CD83-APC (BD, ) - CD14-PE (BD, ) - CD3-FITC (BD, ) - CD19-APC (BD, ) - IgG2a,k-APC-H7 (BD, ) - IgG1,k-PE (BD, ) - IgG1-APC (BD, ) - IgG1,k-PE-Cy5 (BD, ) - IgG2a,k-FITC (BD, ) Plast - 50 ml centrifugerør (VWR, ) - 15 ml centrifugerør (VWR, ) ml oktagonal flaske (Gusselin P250B-50) ml flaske (Greher, 8215) - Sterile pasteurpipetter (Copan, 200CS01) - Cell-culture petridish 6cm (Nunc, ) - Q-max syringe filter (Frisenette, CAPS S) - 50/60 ml engangssprøjte (Henke Sass Wolf, ml engangssprøjte (Braun, V) - Engangskanyle, 80 mm x 2.1 mm (Braun, ) - PP FACS rør (Falcon, ) - PS FACS rør (Falcon, ) PBS % BSA % natriumazid, 100 ml - 99 ml 1XPBS + 1 ml natriumazid (fra stockopløsning på 1 %) blandes mg BSA hældes forsigtigt oven på opløsningen vil langsomt sive ned i opløsningen. Vent til BSA er opløst (op til 20 minutter) - Sterilfiltreres Miltenyi kit buffer (PBS % BSA + 2mM EDTA), 100 ml - 0,4 ml EDTA (stock 0,5 M) opløses i ca 80 ml 1XPBS mg BSA hældes forsigtigt oven på opløsningen vil langsomt sive ned i opløsningen. Vent til BSA er opløst (op til 20 minutter) - Top med 1XPBS indtil slutvolumen er på 100 ml - Sterilfiltreres 109

49 Fremgangsmåde Dag 0 Oprensning af PBMC fra fuldblod 1. Fortynd blod 1:2 i RPMI1640 (stuetemperatur) o Der bruges ml fuldblod 2. Fordel den fortyndede fuldblod på 15 ml centrifugerør (ca. 5 ml/rør) og lejr FORSIGTIGT 2,5 ml Lymphoprep (stuetemperatur for den rette densitet) under fuldblod med en kanyle 3. Lagdel celler ved at gradientcentrifugere i 2 trin: I. 180 g, o C, 20 min, acceleration 2, bremse 0 4. Sug herefter ca. 2 ml af supernatanten fra og centrifuger igen: II. 380 g, o C, 20 min, acceleration 2, bremse 0 5. Høst interfasen, og saml 2 interfaser i et 15 ml rør med 10 ml koldt PBS + 1 mm EDTA. Fyld derefter rørene op med PBS+1 mm EDTA til 15 ml 6. Vask cellerne 3 gange i ca. 10 ml koldt PBS+1 mm EDTA- pool celler undervejs så man efter 2. vask har samplet alle interfaser i et 15 ml rør 7. Vask: I. 300 g, 4 o C, 10 min, acc. 2, bremse 0 II. 300 g, 4 o C, 10 min, acc. 2, bremse 0 8. Efter 3. vask, resuspender cellerne i koldt PBS + 1 mm EDTA o Opløst i ml 9. Tæl cellerne i hæmocytometer med trypanblå (10 μl celler+10 μl trypanblå) Celle tal = (talte celler/talte kvadranter) x 2 x 10 4 x antal ml suspension Celle tal: Monocyt isolering med Monocyte Isolation Kit II 1. Centrifuger cellerne: I. 300 g, 4 o C, 10 min, acc. 5, bremse 2 2. Sug supernatanten helt fra, og resuspender cellerne i 30 μl buffer per 10 7 totale antal celler 3. Tilføj 10 μl FcR Blocking Reagent per 10 7 totale antal celler 4. Tilføj 10 μl Biotin-Antibody Cocktail per 10 7 totale antal celler 5. Pipetter op og ned for at blande grundigt, og inkuber ved 4-10 o C i 10 minutter 6. Tilføj 30 μl buffer per 10 7 totale antal celler 7. Tilføj 20 μl Anti-Biotin MicroBeads per 10 7 totale antal celler 8. Pipetter op og ned for at blande grundigt, og inkuber ved 4-10 o C i 15 minutter 9. Vask cellerne med 1 ml buffer og centrifuger: II. 300 g, 4 o C, 10 min, acc. 5, bremse Sug supernatanten helt fra, og resuspender cellerne i 500 μl buffer (op til 10 8 celler per 500 μl) 11. Sæt MACS Separator magneten på MultiStanden/sæt VarioMACS magneten op, og sæt en MS/LS Column i magneten med en spildbeholder under til opsamling. Skyl MS/LS Column ved at hælde 500/3000 μl buffer i og lade det løbe igennem 12. Sæt et opsamlingsrør under, og hæld cellesuspensionen i MS/LS Column. Lad cellerne sive igennem, dette kan tage et par minutter 13. Vask MS/LS Column 3 gange med 500/3000 μl buffer for at få de sidste monocytter med, og lad MS/LS Column blive helt tom mellem hver vask 14. Centrifuger cellerne: III. 300 g, 4 o C, 10 min, acc. 5, bremse 2 110

50 15. Sug supernatanten helt fra og resuspender cellerne i RP10 medie 16. Tæl cellerne i hæmocytometer med trypanblå (10 μl celler + 10 μl trypanblå) Celle tal = (talte celler/talte kvadranter) x 2 x 10 4 x antal ml suspension Celle tal: 17. Indstil cellerne på ca. 5 x 10 5 celler/ml, tilføj GM-CSF og IL-4 (se opskrift nederst på siden), og så ud i skåle (ca 3 x 10 6 celler i 6 cm skåle eller 5 x 10 6 i 10 cm skåle) Tilsætning af RP-10 medie med cytokiner 1. Optø og slyng cytokinerne. Cytokinerne antages for friske i op til 5 dage ved 4 o C efter optøning 2. Der tilsættes 6 ml 37 o C varmt medie til 6 cm skåle (10 ml i 10 cm skåle) indeholdende: o RP-10 = o GM-CSF 60 ng/ml medie (stock 100 μg/ml) = o IL ng/ml medie (stock 100 μg/ml) = 3. Stil skålen tilbage I 37 o C CO 2 inkubatoren indtil dag 3 o Antal skåle Dag 3 Tilsætning af medie + cytokiner 1. Der tilsættes 0.6 ml 37 o C varmt medie til 6 cm skåle (1 ml til 10 cm skåle) indeholdende: o RP-10= o GM-CSF 600 ng/ml medie (stock 100 μg/ml) = o IL-4-1 μg/ml medie (stock 100 μg/ml)= 2. Skålen sættes tilbage i inkubatoren indtil dag 5 Dag 5 Tilsætning af RP-10 medie med cytokiner 1. Der tilsættes 6 ml 37 o C varmt medie til 6 cm skåle (10 ml til 10 cm skåle) indeholdende: o RP-10 = o GM-CSF 60 ng/ml medie (stock 100 μg/ml) = o IL ng/ml medie (stock 100 μg/ml) = 2. Skålen sættes tilbage i inkubatoren indtil dag 7 (dag 6 for skåle der skal modnes) Dag 6 Tilsætning af modningsstimulus 24 timer inden høst af modne celler 1. Tilsæt 10 ng/ml medie LPS til de skåle med DC er der skal modnes (stock 10 μg/ml, dvs. fortynd LPS 1:1000 i skålen, 1 μl LPS/ml medie) Tilsæt 1-2 μg/ml CD11c antistof til de skåle med DC er der skal modnes med CD11c (3.9 eller BU15) 2. Sæt skålene tilbage i inkubator i 24 timer Dag 7 Høst af celler 1. Tag billeder af celler må kun være udenfor inkubatoren i få minutter da de trækker deres veils til sig når de bliver kolde 2. Høst de non-adherente og semi-adherente celler ved at lade mediet allerede til stede i skålen løbe over skålen fra flere sider og flere gange med en pasteur pipette, mens skålen holdes på skrå. Skyl efter med nyt medium 3. Overfør cellerne (hvis flere skåle, pool cellerne) i et 50 ml centrifugerør, og centrifuger cellerne ved 300 g, 6 min, 22 o C, acc. 6 bremse Resuspender cellerne i PBS % BSA % natriumazid. Tæl levende cellerne i trypan blå (10 μl trypanblå + 10 μl cellesuspension): 111

51 Celletal = (antal talte celler/antal talte kvadranter) x 2 x 10 4 x ml celler Celletal: Flow cytometric analysis protocol Flowcytometri analyse OBS - cellerne holdes på is under samtlige steps fremefter 1. Indstil cellerne på 2-10 x 10 6 celler/ml i PBS % BSA % natriumazid (mindst 1 x 10 5 celler per FACS rør) 2. Gør PP FACS rør klar med antistoffer samt evt. isotypekontroller for de forskellige markører (se skema) AB Rør Antal μl Isotype Rør Antal μl HLA-DR-APC-H7 (BD, ) CD80-PE-Cy5 (BD, ) CD86-PE (BD, ) CD83-APC (BD, ) 5 IgG2a,k-APC-H7 (BD, ) 20 IgG1,k-PE-Cy5 (BD, ) 20 IgG1,k-PE (BD, ) 20 IgG1,k-APC (BD, ) CD14-PE (BD, ) 20 IgG1,k-PE (BD, ) 20 CD19-APC (BD, ) CD3-FITC (BD, ) 20 IgG1,k-APC (BD, ) 15 IgG2a,k-FITC (BD, ) Overfør 100 μl cellesuspension (passende til ca celler) til PP FACS rør indeholdende antistoffer og til et andet rør indeholdende isotype kontroller 4. Inkuber rørene ½ time ved 4 o C under sølvpapir 5. Tilsæt 2 ml PBS % BSA % natriumazid pr. rør 6. Centrifuger rørene i 5 min, 0 o C, 300 g, bremse 2 7. Hæld supernatanten fra og resuspender pellet i 2 ml PBS % BSA % natriumazid pr. rør 8. Centrifuger rørene i 5 min, 0 o C, 300 g, bremse 2 9. Hæld supernatanaten fra og resuspender cellerne i 300 μl PBS + 1 % formaldehyd. Analyser cellerne i flowcytometer eller gem ved 4 o C i maks 7 dage. 10. Filtrer celler i et 70 μm filter inden flowkørsel, hvis der køres på Astrios 112

52 8.3.3 Internalization protocol Internaliserings assay Revideret fra Lotte Pugholms Internalization assay ver 2.0, Materialer Ultra-LEAF purified mouse anti human CD11c clone 3.9 (Biolegend, ) Ultra-LEAF purified mouse anti human CD11c clone BU15 (Biolegend, ) LEAF purified mouse IgG1,k (Biolegend, ) Alexa 488 F(ab ) 2 Goat anti mouse IgG (H+L) (Jackson Immunoresearch, ) HLA-DR-Alexa 647 (Biolegend, ) DAPI (LIM fryseren) Mounting medium (Svend Birkelunds hjemmelavede) Formaldehyde (VWR, ) Triton X-100 (Sigma, X100)( ) BSA (Sigma, A2153, Cas ) Natriumazid (Merck, , Cas ) PP rør (Falcon, ) Polysin slides (Thermo, J2800AMNZ) Dækglas 15 x 15 mm (VWR, ECN ) PAP-pen (Sigma-aldrich, EA) Buffer 1: 1 X PBS % BSA Buffer 2: 1 X PBS % BSA % natrium azid Fremgangsmåde 1. Tæl DC er og indstil koncentrationen til 2.5 x 10 6 celler/ml i buffer 1 2. Label 6 PP rør CD11c o C, CD11c o C, CD11c BU15 4 o C, CD11c BU15 37 o C, IgG 4 o C og IgG 37 o C, og overfør 400 μl cellesuspension til de 3 rør med X 4 o C 3. Tilføj 4 μg antistof til hvert rør (slutkoncentration bliver da 10 μg/ml) og inkuber på is i 30 min 4. Tilføj 500 μl buffer 1 til rørerne og centrifuger ved 300 g i 5 min ved 4 o C 5. Resuspender i 350 μl buffer 1 og overfør 200 μl til de tilsvarende rør med X 37 o C 6. Rør med X 4 o C sættes tilbage på is i 60 minutter, og rør med X 37 o C sættes i inkubator ved 37 o C i 60 min 7. Efter 60 min sættes alle rør på is i 15 min for at stoppe internaliseringen 8. Vask med 200 μl buffer 2 og centrifuger ved 300 g i 5 min ved 4 o C 9. Resuspender i 150 μl af buffer 2, og overfør 100 μl til nye rør tilsvarende med labels CD11c 4 + st, CD11c 37 + st, IgG 4 + st og IgG 37 + st 10. De oprindelige rør sættes på is mens de nye rør med X Y + st bliver strippet for antistoffer 113

53 Staining til konfokal mikroskopi Obs: Hver gang der vaskes, suges der meget forsigtigt af, for ikke at løsrive cellerne på slidet. Sørg for at slides ikke får direkte lys mens der arbejdes med dem. 1. Tegn en ring på ca cm i diameter med en Pap-pen på hvert polysin slide (i stinkskab) og placer objektglassene i et fugtigt kammer 2. Udtag μl cellesuspension (ca celler/slide) og vent 15 min 3. Supernatanten suges bort og cellerne fikseres i 100 μl 3.7 % formaldehyd i 20 min ved 4 o C. Husk at holde kammeret tæt med parafilm, da formaldehyd koncentrationen er høj 4. Formaldehyd suges fra, og der vaskes 2 gange med PBS 5. Der tilføjes 100 μl 0.2 % Triton X for at permeabilisere cellerne. Inkuberer i 7 min ved stuetemperatur 6. Triton X suges fra, og der vaskes 2 gange med PBS 7. Supernatanten suges fra, og der tilføjes 100 μl fortyndet (1:50) sekundært antistof (Goat-anti mouse F(ab ) 2 Alexa 488) for at staine CD11c og IgG. Inkuberer ved 37 o C i 30 min 8. Antistof suges fra, og der vaskes 3 gange med PBS 9. Supernatanten suges bort og cellerne fikseres i 100 μl 3.7 % formaldehyd i 20 minutter ved 4 o C. Husk at holde kammeret tæt med parafilm, da formaldehyd koncentrationen er høj (der fikseres igen for at sørge for at HLA-DR-Alexa647 ikke kan binde til frie ender på det sekundære antistof) 10. Formaldehyd suges fra, og der vaskes 2 gange med PBS 11. Der tilføjes 100 μl fortyndet (1:100) HLA-DR-Alexa647 til at staine membranen. Inkuberes ved 37 o C i 30 min 12. Antistof suges fra, og der vaskes 3 gange med PBS 13. Der tilføjes 100 μl fortyndet (1:1000) DAPI som kernestain. Inkuberer i 10 min ved stuetemperatur 14. DAPI suges fra, og der vaskes 3 gange med PBS 15. Der suges så meget væske af slides som muligt, og der lejres 5 μl mounting medium på hvert slide. Et dækglas lægges over og fæstnes med tape Staining til flow cytometri 1. Der tilføjes 2 μl sekundært antistof (Goat-anti-mouse F(ab)2 Alexa 488) til hvert rør, og de inkuberer mørkt i 30 min ved 4 o C 2. Tilsæt 2 ml af buffer 2 til hvert rør, og centrifuger ved 300 g i 5 min ved 4 o C 3. Hæld supernatanten fra, og resuspender igen i 2 ml af buffer 2 til hvert rør, og centrifuger ved 300 g i 5 min ved 4 o C 4. Hæld supernatanten fra, og resuspender i 300 μl buffer 2 hvis cellerne analyseres med det samme, eller i 300 μl PBS + 1 % formaldehyd hvis der går mere end 4 timer til cellerne kan analyseres 114

54 8.3.4 T18 protocol Dyrkning af T18 klon (bogen) Medie RPMI 1640 med 25mM HEPES uden glutamin (Invitrogen/Life Technologies, ) L-Glutamine (stock konc. 100mM) (Invitrogen, ) 10% FCS (fra LSR-gruppen, lot nr. 41G2300K, aliquot 23) IgG mouse (stockopløsning 1 mg/ml) (Jackson Immuno Research, ) IL-2 (stockopløsning 1 ug/ml) (Peprotech, ) Feederceller HLA-DRB1*;0401 bestrålet (1800Rad Cs gamma) Plast 12-brønds bakker (Nunc, ) 24-brønds bakker (Nunc, ) Dag 0 1. Tæl T-cellerne i hæmocytometer med trypanbplå og indstil cellekoncentrationen til 10 5 levende celler/ml i medie 2. Sæt T-cellerne sammen med feederceller (10 7 celler/ml) (PBMC 5:1 T-celler) i en dyrkningsskål (1 ml i 12- brønds- 0,5 ml i 24-brønds bakker) 3. Tilføj til hver brønd 10 ng/ml (20 IU) IL-2 samt 10 µg/ml IgG mouse til aktivering 4. Inkuber ved 37 grader, 5-7,5% CO 2 Dag 3 5a. Hurtigt groende T-celler: Resuspender cellerne med en pipette, og overfør halvdelen af cellerne til en ny, identisk dyrkningsskål. Tilføj varmt medie indeholdende 20 IU/ml IL-2 (ca 10 ng/ml) så volumenet fordobles i hver skål 5b. Langsomt groende T-celler: Resuspender cellerne og tilføj 20 IU/ml IL-2 (ikke nyt medie) Dag 6/7 6. Tæl cellerne i hæmocytometer med trypanblå for at undersøge viabiliteten (det forventes at en stor del af cellerne er døde, da feedercellerne på dette tidspunkt er døde som resultat af bestrålingen på dag 0) 7. Vask cellerne og indstil cellekoncentrationen til 5x10 5 levende T-celler pr ml i medie med 20 IU IL-2, så ud i nye brønde Dag 9/10 7. Tæl cellerne i hæmocytometer med trypanblå. Frasorter evt døde celer ved gradient centrifugering (?) 8a. Skal der bruges flere T-celler, gentag da proceduren fra dag 0 i en ny 10-dages cyklus 8b. Skal T-cellerne bruges til forsøg skal de gå i 24 timer uden IL-2 i mediet, vask derfor i varmt medie, centrifuger ved 300 g i 5 minutter og indstil cellekoncentrationen til 5x10 5 T-celler pr ml medie Obs: Jo længere T-cellerne er i kultur, desto mere ændrer deres fænotype sig, da der bliver selekteret for de T-celler der gror bedst i kultur 115

55 8.4 Analysebrugsanvisning Analysebrugsanvisning Login: HSTAAU, Password: HSTAAU Sikkerhed i forbindelse med fremstilling af reagenser Det er de koncentrerede stoffer eller stockopløsninger, der skal oplyses. Navn Cas. nr. Koncentration H/R-sætninger P/S-sætninger Piktogram (Billede) Affaldsgruppe Natriumazid % H302: Farlig ved indtagelse. H412: Skadelig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. P : I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: I tilfælde af ubehag ring til en GIFTINFORMATION/læge. P273: Undgå udledning til miljøet. X EUH032: Udvikler meget giftig gas ved kontakt med syre. Triton X % H302: Farlig ved indtagelse. H318: - Forårsager alvorlig øjenskade P280: - Bær beskyttelseshandsker/ beskyttelsestøj/ øjenbeskyttelse/ ansigtsbeskyttelse X H411: Giftig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger P : I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: I tilfælde af ubehag ring til en GIFTINFORMATION/læge. P : VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 116

56 Sikkerhed på de fortyndede stoffer. Det er slutkoncentrationen på de sammenblandede regenser, der skal oplyses. Navn Cas. nr. Koncentrat ion H/R-sætninger P/S-sætninger Piktogram (Billede) Affaldsgruppe Lymphoprep: 9,1 % natriumdiatrizoat + 5,7% Polysaccharid 9,1 % natriumdiatrizoat 5,7% Polysacchari d H361: Mistænkes for at skade det P280: Bær beskyttelsesufødte barn. handsker/øjenbeskyttelse. H317: Kan forårsage allergisk P : VED hudreaktion. KONTAKT MED H334: Kan forårsage allergi- eller ØJNENE: Skyl forsigtigt B astmasymptomer eller åndedræts- med vand i flere minutter. besvær ved indånding. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres H412: Skadelig for vandlevende let. Fortsæt skylning. organismer, med langvarige virkninger. P314: Søg lægehjælp ved ubehag. Trypanblå 0,4% P273: Undgå udledning til miljøet. 0,4% H350: Kan fremkalde kræft P201: Indhent særlige anvisninger før brug. P : VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. B Pencillin/stre ptomycin opløsning H317: Kan forårsage allergisk hudreaktion P280: bær beskyttelseshandsker/øj enbeskyttelse B P VED KONTAKT MED HUDEN: Vask med rigeligt vand 117

57 PBS + 1% formaldehyd 1% koncentratio n H351: Mistænkt for at fremkalde kræft H217 Kan forårsage allergisk hudreaktion P202: Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået P280 Bær beskyttelseshandsker/øj enbeskyttelse H P : Ved eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp Natriumazid 0,01% Ikke farlig Ikke farlig Anvendelse af personlige værnemidler og særlige forholdsregler ved brug enkelte reagenser. Navn Værnemidler/handsketype/forholdsregler Lymphoprep Pen/strep Trypanblå PBS + 1% formaldehyd Triton X Nitril handsker Handsker Nitril handsker Nitril handsker, stinkskab Nitril handsker Studienr.: Dato: Navn:Fie Søndergaard Projekt laborant: Brita Holst Jensen Vejleder: Ralf Agger Godkendelse: Dato Underskrift 118