Effekt af kobber forurening på grave adfærd hos marine invertebrater Forsøgsvejledning af Annemette Palmqvist Institut for Miljø, Samfund og Rumlig Forandring (ENSPAC) Roskilde Universitet September 2015
Baggrund I forbindelse med forureningshændelser, f.eks. i forbindelse med udvinding af metaller i miner eller de ofte spektakulære olie katastrofer (f.eks. Deepwater Horizon, Baltic Carrier osv), er offentlighedens fokus oftest på de synlige dyr som fugle, pattedyr og fisk. I nogen tilfælde er der også fokus på de spiselige arter af krebsdyr og evt. muslinger (primært som tab af udbytte), mens det er mere sjældent man i medierne hører om de usynlige hvirvelløse dyr som lever på og nedgravet i havbunden (det dyresamfund der er knyttet til havbunden kaldes det bentiske samfund). Der er dog flere grunde til at vi bør interessere os særligt for disse usynlige bunddyr. For det første danner de fødegrundlaget for mange af vores spisefisk, fugle og nogle havpattedyr, og hvis de forsvinder fra et forurenet område forsvinder dermed også eksistensgrundlaget for de dyr vi i første omgang har fokus på at bevare. For det andet har de vigtige roller i forbindelse med omsætningen af organisk materiale i det marine miljø. Figur 1. Til venstre: sedimentsøjle som viser hvordan havbunden vertikalt fordeler sig på en oxideret zone øverst (det lyse lag) og en anoxisk zone nedenfor (det sorte lag). Til højre: udsnit af sedimentsøjle, hvor man kan se hvordan sedimentet omkring gravegange bliver iltet af dyrenes graveaktivitet. Organisk materiale (f.eks. døde alger og zooplankton) fra vandsøjlen sedimenterer på havbunden hvor det blandes med mineralske partikler. Havbundens sediment (mudder/bundmateriale) er opdelt i et oxideret (iltet) lag øverst og den dybere liggende anoxiske (iltfri) zone (figur 1, venstre). Uden tilstedeværelse af gravende dyr vil den iltede zone typisk kun være ca. 1 cm dyb (afhængig af hvor mudret eller sandet sedimentet er; jo mere mudret desto mindre vil det iltede lag være og jo mere sandet desto dybere vil det iltede lag typisk være). Den mest effektive mikrobielle (dvs. bakterier, alger og svampe) omsætning af organisk materiale foregår i den iltede zone. Der er også bakterier der kan klare sig uden ilt (fakultativt anaerobe) og nogle som slet ikke kan tåle ilt (obligat anearobe), men deres omsætning af organisk materiale er betydeligt langsommere end de bakterier, alger og svampe der bruger ilt til deres omsætning af det organiske materiale. Dyr som lever nedgravet i havbunden kan være med til at ilte sedimentet på to måder; for det første ved at trække iltet vand med ned i sedimentet i forbindelse med deres graveaktivitet (bioturbation), og for det andet ved aktivt at pumpe iltet vand gennem deres gravegange (bioirrigation). Dyrenes bioturbation og bioirrigation kan desuden medvirke til at frigive og nedbryde kemiske stoffer (hvoraf nogle er giftige) som måtte være fanget i sediment fasen. På den måde kan disse gravende dyr indirekte medvirke til at stimulere den mikrobielle nedbrydning af både det organiske materiale og andre kemiske stoffer. Derudover er nogle af disse bentiske dyr såkaldte sedimentædere. Sedimentædere lever af det organiske materiale (incl. mikroorganismer) i sedimentet. Typisk for dem er, at de indtager sediment, optager en del af det organiske materiale fra sedimentet mens de mineralske partikler udskilles fra dyret sammen med den resterende del af det organiske materiale. De fleste sedimentædere må indtage flere gange deres egen kropsvægt i sediment om dagen for at få tilstrækkeligt føde ud af sedimentet. På den måde arbejdes sedimentet grundigt igennem og 2
sedimentæderne bidrager direkte og indirekte (ved at ilte sedimentet) til nedbrydningen af organisk materiale. En stor del af de giftstoffer som udledes til det vandige miljø (ferskvand og havvand) ender i havbundens sediment. Det gælder både mange metaller og en stor del at de organiske stoffer der udledes. Sediment levende organismer, og i særlig grad sedimentædere, vil naturligvis påvirkes af de giftige kemikalier alene pga. deres levevis og levested. Dette kan have en betydelig indvirkning på den mikrobielle nedbrydning af organisk materiale, såvel som for omsætning, frigivelse og dermed biotilgængelighed af de pågældende giftstoffer. I hvilket omfang de sedimentlevende dyr forsvinder i forbindelse med en forureningshændelse vil altså have betydning for hvor lang tid økosystemet er om at komme sig efter forureningen. I danske kystnære områder findes mange forskellige sediment levende dyrearter. På det lave vand (ned til ca. 10 m dybde) lever bl.a. flere muslingearter (f.eks. Østersø muslingen Macoma baltica, hjertemuslingen Cerastoderma edule og sandmuslingen Mya arenaria), krebsdyr (f.eks. slikkrebsen, Corophium volutator) og børsteorm (f.eks. sandormen Arenicola marina og frynseormen Nereis diversicolor). Nogle af disse er sedimentædere, nogle er filtratorer og atter andre benytter sig af flere forskellige fødesøgningsstrategier. De to bentiske organismer I vil komme til at lave forsøg med hører til i dette lavtvandssamfund (også kaldet Macoma samfundet opkaldt efter en af de muslinge arter, Macoma baltica, man ofte finder i samfundet). Det drejer sig om to muslingearter som har lignende fødesøgningsstrategier, men lever forskellige steder i sedimentet. Figur 3. Til venstre, et billede af den almindelige hjertemusling halvt nedgravet i sedimentet. Læg mærke til de to ånderør som stikker frem fra skallen. Til højre, en tegning som viser hvordan muslingens fod hjælper med at holde den på plads i sedimentet mens dens ånderør stikker op over sediment overfladen for at nå det overliggende vand. Den første, hjertemuslingen (Cerastoderma edule) er filtrator. Den lever nedgravet i sedimentet tæt på overfladen (på mindre end 5 cm dybde så dens korte ånderør kan nå op til overfladen), hvor den holder sig på plads med sin fod, mens den filtrerer partikler ud af det overliggende vand gennem sine ånderør (figur 3). Hjertemuslingen er relativt mobil, og kan foretage lange spring vha. sin fod. Den graver sig hurtigt ned i sedimentet igen hvis den bliver forstyrret af den ene eller anden grund. Den almindelige hjertemusling er udbredt over store dele af verden, og på lavvandsområder i de fleste danske farvande, men kræver dog en vis saltholdighed (fra ca. 8-9 promille til 35 promille salinitet). Den almindelige hjertemusling bliver op til 5-6 cm stor, og det to skaller kan lukke helt tæt sammen. I dette forsøg vil I få mulighed for at sammenligne graveaktiviteten hos to forskellige størrelser af hjertemuslinger under forskellige grader af kobber forurening. Den anden bentiske organisme I kommer til at arbejde med, sandmuslingen (Mya arenaria), er ligeledes filtrator. Den sidder dog dybere i sedimentet end hjertemuslingen (ned til ca. 30 cm dybde for store individer), og har et længere ånderør som den stikker op til overfladen for at få adgang til iltrigt og planktonholdigt vand). På den måde bidrager sandmuslingen til at ilte sedimentet ned i de dybere lag. Sandmuslingen er ligesom hjertemuslingen udbredt over en 3
stor del af verden - og benyttes bl.a. i USA som spisemusling - og tåler saltholdigheder helt ned til 5 promille, mens dens optimale salinitet er ca. 25-35 promille. Sandmuslingen bliver op til ca. 15 cm lang, og er altid åben i bagenden (åbningen bliver større med alderen), hvorfra dens to sammenvoksede ånderør kommer ud, så den kan ikke lukke sine to skaller tæt. I dette forsøg kommer i til at arbejde med relativt små individer af sandmuslingen (< 2cm). Figur 4. Til venstre, ses sandmuslingen Mya arenaria nogle med foden ude (forberedelse til nedgravning). Til højre, et billede som viser hvordan sandmuslingen sidder nedgravet i sedimentet og stikker ånderøret op til overfladen. Formålet med øvelsen Det overordnede formål med øvelsen er at undersøge hvordan kobber forurening af sedimentet påvirker sediment associerede (i dette tilfælde gravende) organismer. Målet med øvelsen er desuden at blive introduceret til det typiske design af koncentrationrespons forsøg, samt at blive bekendt med biologien og økologien af nogle bentiske invertebrater (hvirvelløse dyr). Metoder I kommer til at arbejde med sediment med 4 kobberkoncentrationer (250, 500, 1000 og 2000 mg kobber/kg tørt sediment; kobber tilsat i form af Cl 2 Cu*2H 2 O) og 1 kontrol (0 mg/kg tilsat kobber; der er dog en vis baggrundskoncentration af kobber, typisk < 50 mg/kg). Replikat 1 Koncentration (mg/kg) 0 250 500 1000 2000 Figur 5. Figuren viser opsætningen af et koncentration-respons forsøg. Forsøget består af et antal behandlinger (koncentrationer) inklusiv en kontrol som ikke har fået tilsat kemikalie (0 mg/kg). For hver behandling skal der være mindst 3 replikater for at sikre at observation af en eventuel effekt i en behandling ikke blot skyldes en tilfældighed. Replikat 3 For hver behandling er der 3 replikater (figur 5), som skal sikre at de effekter der observeres ikke skyldes tilfældigheder (ved at have replikater får man desuden mulighed for at lave statistik på resultaterne). 4
Hver gruppe står for at udføre eksperimentet på et ud af tre replikater for én art/størrelse. Hver gruppe vil dermed få tildelt 5 glas til sediment og vand, samt 5 individer af enten små hjertemuslinger, større hjertemuslinger eller sandmuslinger. Til hvert de 5 glas skal der overføres sediment med en af de 5 sediment typer. I alle 5 glas skal der desuden tilføres 120 ml rent havvand som overliggende vand. Ved overførslen er det meget vigtigt at sedimentet ikke hvirvles for meget op. Derfor hældes vandet ikke direkte ned på sedimentet, men derimod på en ske som holdes op mod indersiden af glasset. Efter tilførsel af vand til glassene, skal disse stå i mindst 15 minutter, til vandet igen er blevet klart nok til at man kan se sedimentoverfladen. Figur 6. Størrelsen af muslingen måles med en skydelære hen over det bredeste sted Mens I venter på at vandet igen er klart skal størrelsen på muslingerne bestemmes. Først sigtes muslingerne forsigtigt ud fra sedimentet i det udlevere glas. Størrelsen på muslingerne bestemmes ved at måle muslingen på det bredeste sted med en skydelære (figur 6), og målingerne noteres ned i den udleverede tabel. Efter måling af muslingerne kan forsøget startes op ved at muslingerne overføres til glassene med sediment og vand. Der skal startes et stopur ved starten af eksperimentet (dvs. når det første dyr overføres til glasset), og uret må først stoppes igen når hele forsøget er færdigt (dvs. efter 120 minutter). Overførslen af dyrene til glassene foregår bedst med en lille plastic ske eller en blød pincet, så muslingerne kan placeres nogenlunde midt i glasset. Inden I starter bør I læse nedenstående trin-for-trin vejledning grundigt igennem. Forsøget trin-for-trin: 1. Sediment (ca. 135 g til store hjertemuslinger og sandmuslinger, og ca. 80 g til små hjertemuslinger) overføres til glas mærket med de pågældende koncentrationer. 2. Ca. 120 ml vand overføres forsigtigt til hvert glas (uden at hvirvle sedimentet op) 3. Muslingerne sigtes forsigtigt ud af sedimentet i det udleverede glas 4. Muslingerne måles og fordeles i mærkede petriskåle (klar til overførsel til sediment) 5. De 5 individer overføres forsigtigt til hvert sit glas. Forsøg at lægge muslingen ca. midt i glasset, undgå at hvirvle sedimentet op. Start fra den laveste koncentration (kontrollen) og bevæg jer op gennem koncentrationsrækken. Brug ikke for langt tid mellem hver overførsel. Start stopuret når det første individ overføres 6. Allerede efter 2 minutter skal den første måling tages. Målingen foretages ved at man registrerer status på individet ud fra det nedenfor beskrevne nedgravningsindex (står også på den udleverede tabel), og noterer det i den udleverede tabel. 7. 5 minutter efter start af forsøget foretages den næste måling (som ovenfor), og herefter foretages målinger 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90 og 120 minutter efter start af forsøget. 5
8. Efter 120 minutters eksponering er forsøget færdigt. Nedgravningsindex: 1: Ligger på bunden med lukket skal 2: Ligger på bunden med åben skal (evt. foden ude) 3: Halvt nedgravet 4: Fuldstændigt nedgravet Indsamling af data Efter forsøget er afsluttet, eller undervejs når der er tid, skal resultaterne indføres i det forberedte excel regneark (i regnearket er det afmærket hvor data for hvert enkelt replikat skal stå), hvori data for alle replikater og arter/størrelser samles, så alle deltagere kan få hele datasættet med hjem. Basale statistiske udregninger (nogle af dem kan også udføres i excel) Middelværdi (M): (x 1 +x 2 +x 3 )/3; hvor x 1 -x 3 er den målte parameter (nedgravningsindex) for hhv. replikat 1-3 ved en given koncentration Varians: ((x 1 -M) 2 +(x 2 -M) 2 +(x 3 -M) 2 )/(3-1) Standard afvigelse (SD): varians; (SD=kvadratroden af variansen) Standard error (SE): SD/ 3; (SE=SD/kvadratroden af antal replikater i hver behandling) 95% konfidens-interval: Øvre grænse (UCL) = M + (t*se); (t = 4,303 ved 3 replikater) Nedre grænse (LCL) = M (t*se) Konfidens-interval opgives ofte som: Middelværdi ± (t*se), eller afbilledes som fejllinjer (error bars) i en figur 6
Analyse og diskussion af data (særligt som input til rapporter, men også til diskussion i plenum i det omfang der er tid) For at vurdere resultaterne af forsøget skal der fremstilles figurer der præsenterer data på den mest overskuelige måde. Det er en god idé at prøve forskellige fremstillingsmåder inden I vælger hvilke figurer I vil have med i rapporten. Forslag til figurer der kan afprøves: Det gennemsnitlige (for 3 replikater) nedgravningsindex for muslinger i hver af sedimenttyperne som funktion af eksponeringstid (dvs., tid på x-aksen, gennemsnitligt nedgravningsindex på y-aksen og de forskellige behandlinger som serier) (f.eks. som punkt diagram). Det gennemsnitlige nedgravningsindex for hver tid som funktion af kobber koncentration (bedst som søjlediagram) Gennemsnitlig tid til fuld nedgravning som funktion af sedimenttype for hver af arterne (kan både være som søjle diagram og punkt diagram. Desuden bør der i rapporten indgå enten en tabel eller en figur med den gennemsnitlige størrelse af muslingerne per kobber koncentration for hver af de enkelte muslingegrupper (arter/størrelser) Gennemsnitsværdier kan med fordel præsenteres sammen med deres standard afvigelse eller 95% konfidens-interval (både i figurer og evt. tabel), som et udtryk for variansen i data. Som en tommelfingerregel kan man gå ud fra at to middelværdier er statistisk signifikant forskellige hvis deres konfidens-intervaller ikke overlapper. Nogle af de punkter der kan diskuteres i plenum og som bør indgå i rapporterne er: Hvor lav en koncentration af kobber skal der til for at få en effekt på graveadfærden hos de tre grupper? Er der forskel på effekten hos små og større muslinger? Er der forskel på effekten hos de to forskellige arter? Hvilke konsekvenser kan en ændret graveaktivitet få for de to arter? Hvis I skulle vurdere farligheden af kobber, hvilken art/størrelse ville det så være bedst at vælge til det økotoksikologiske studium (baseret på jeres samlede resultater)? Mener I, baseret på jeres erfaring, at undvige adfærd i form af nedgravning er et sensitivt mål for giftighed? Foreslå og diskuter evt. andre ting man kunne måle på muslinger for at teste toksiciteten af giftstoffer i vandmiljøet. 7