Page1 Udarbejdet i samarbejde mellem: Kåre Lehmann, Annabeth Høgh Petersen, Anne Rusborg Nygaard og Jørn M. Clausen
Page2 VIGTIGT: SKIFT PIPETTE SPIDSER/TIPS EFTER HVER GANG!! Så undgår du at forurene dine prøver og de forskellige reagenser :-) God fornøjelse
Page3 OBS: Lærernote om risikoen for, at eleverne finder ud af, at blodtypegenetikken ikke passer sammen med forældrenes. Da der jo altid vil være en lille sandsynlighed for, at en elevs forældre ikke er elevens rigtige forældre, er dette forsøg en lille smule prekært, da man kan komme til at stå i den situation, at man som lærer skal forklare, hvorfor genetikken ikke passer sammen. Ganske vist er det kun eleverne, der testes og ikke forældrene, men hvis eleven kender forældrenes blodtyper eller i løbet af forsøgsperioden beder forældrene om disse, kan man det være at genetikke ikke passer sammen. Derfor er det vigtigt at gøre sig overvejelser om dette før øvelsen. Det svarer dog næsten til de overvejelser, som læreren skal gøre ved brug af ELDON kort, men disse kort er ikke godkendt til klinisk brug og man kan altid begrunde uforenelighed med kortenes usikkerhed. Der er selvfølgelig også usikkerhed ved denne metode, men under alle omstændigheder kan det være fornuftigt at lade eleverne kende denne problemstilling forud og evt. kun lade de elever, der vil deltage frivilligt udføre testen.
Page4 A) Oprensning af genomisk DNA (DeoxyriboNucleicAcid) (Denne del tager ca. 3 timer) Oprensningen forudsætter elevernes fortrolighed med at anvende Mikropipetter Centrifuge Podepind -og at de forstår princippet i proceduren. Oprensningen tager ca. 3 timer. Den kan ikke opdeles, men kombineres med at eleverne støber agarose gelerne, så de er klar til brug eller at der undervises i laboratoriet i den time, hvor inkuberingen finder sted. 1. Høst celler fra mundhulen med en steril vatpind ved at gnide vatpinden mod indersiden af kinden. Se figur 1. 2. Klip træpinden over ved bomuldskanten og kom træpind med bomuld i et 2 ml rør. Skriv jeres gruppe nummer på røret. Sakse rengøres mest effektivt for DNA-rester ved neddypning i 0,5M NaOH (alkalisk hydrolyse), og efterfølgende afskylning og afspritning. Dette foretages af læreren. Skal eleverne gøre det selv, bruges sæbevand og afspritning. Figur 1 Udtagning af prøve og afklipning i mikrocentrifugerør. Til oprensning af genomisk DNA anvendes QIAamp DNA Investigator Kit Det er vigtigt at eleverne mærker deres rør, så ombytning i centrifugerne undgås! 3. Tilsæt 400 µl Buffer ATL og 20 µl proteinase K til hvert rør med prøve.
Page5 Buffer ATL nedbryder (lyserer) cellemembraner og kernemembraner, da det indeholder natriumdodecylsulfat, der er et sæbestof. Dette frigør DNAet. Proteinase K, er et proteinspaltende enzym, der fordøjer DNA-nedbrydende proteiner, således DNAet ikke bliver nedbrudt. ATL- og AL-bufferne kan danne bundfald. Dette kan opløses i varmt vandbad. 4. Vortex prøven i 10 sekunder. 5. Inkuber prøven ved 56 C i 60 min. Vortex prøven i 10 sekunder hvert 10. min under inkuberingen. 6. Efter endt inkubering centrifuges prøven kort. 7. Tilsæt 400 µl Buffer AL og vortex prøven i 15 sekunder og centrifuger prøven kort. Buffer AL indeholder guanidinhydrochlorid, der er et salt, der ødelægger proteinerne, og herved beskytter DNAet imod at blive nedbrudt. 8. Inkuber prøven ved 70 C i 10 min. Vortex prøven i 10 sekunder hvert 3. min under inkuberingen. (Imens prøven inkuberer kan man med fordel støbe gelerne under punkt B). Figur 2 Oprensningens hovedtrin.
Page6 9. Efter endt inkubering centrifuges prøven kort. 10. Tilsæt 200 µl 100 % ethanol og vortex prøven i 15 sekunder. Centrifuger kort. DNAet vil udfælde ved tilsætningen af ethanol. 11. Overfør lysatet (væsken) til en QIAamp MinElute kolonne. Centrifuger ved 8000 rpm i 1 min. Dna et fra prøven vil nu bindes til membranen, som sidder i kolonnen. Efter centrifugeringen overføres kolonnen til et nyt opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. 12. Tilsæt 500 µl Buffer AW1 til kolonnen. Centrifuger ved 8000 rpm i 1 min. (Det bundne dna vaskes rent for andre stoffer). Herefter overføres kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. Buffer AW1 indeholder også et guadinium salt samt ethanol. 13. Tilsæt 700 µl Buffer AW2. Centrifuger ved 8000 rpm i 1 min. (Endnu en vask af det bundne dna). Herefter overføres kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. 14. Tilsæt 700 µl 100 % ethanol. Centrifuger ved 8000 rpm i 1 min. (Sidste vask af det bundne dna!)herefter overføres kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. DNA fælder ikke ud i opløsningen, da ethanol-koncentrationen kun er 30% 15. Centrifuger ved 14.000 rpm i 3 min (gøres for at trække al ethanolen ud af membranen, så den lettere tørrer) 16. Overfør kolonnen til et 1,5 ml eppendorf rør og inkuber minimum 10 min. ved stuetemperatur eller 3 min. ved 56 C. (Tørring af membranen) Det gl. opsamlingsrør smides ud. 17. Tilsæt 30 µl Buffer ATE til kolonnen og inkuber i 5 min. ved stuetemperatur. Det bundne dna genopløses nu. 18. Centrifuger ved 14.000 rpm i 1 min. Dna et befinder sig nu i væsken igen. 19. Gentag trin 17 og 18 for at sikre, at mest mulig dna bliver elueret.
Page7 Figur 3 Mikrosøjle og opsamlingsrør 20. Mikrocentrifugerøret indeholder nu DNA-prøven. Kolonnen smides ud. DNA-prøverne kan nu benyttes til agarose-gelelektroforese under punkt B). STOP-PUNKT! Hvis I arbejder videre næste dag kan i opbevare DNA prøverne ved 4⁰C ellers skal I fryse prøverne ned ved -20⁰C. B) Gelelektroforese af oprenset genomisk DNA. B1: Støbning af en 1 % agarose gel (nok til 3 stk.) Hvis der går mere end 1 uge mellem I skal bruge DNA-gelen og PCR-gelerne, er det bedst i støber gelerne ad 2 omgange. Hvis I gør det, husk da at korrigere mængden af agarose og buffer. 1. Rengør 3 gelkar og tilhørende kamme i 70 % ethanol. 2. Spænd gelbakkerne fast i de medfølgende klemmer, så de tætnes i begge ender. Se figur 4. Figur 4 Støbeklemme til gelbakker.
Page8 3. Tag en 250 ml bluecap flaske og vej 1,5 g agarose af i flasken. 4. Tilsæt 140 ml 1xTAE buffer til bluecap flasken, læg en omrører-magnet i og sæt låget løst på. 5. Sæt flasken med agarose-opløsningen på varmepladen og varm til kogepunktet under omrøring. Se figur 5. Opløsningen skal koge et par minutter før al agarosen er opløst. Hvis jeres laboratorie har en mikroovn kan denne anvendes i stedet for varmepladen. Figur 5 Varmeplade med bluecap til smeltning af agarosen. 6. Check at opløsningen er helt klar (intet uopløst agarose må være tilbage). 7. Tag omrører-magneten op. (Gøres bedst med en magnet-henter og pas på den meget varme opløsning!) 8. Tag nitrilhandsker på. 9. Tilsæt 10 ml 1xTAE+EtBr opløsning til de 140 ml opløst agarose, og bland ved at svinge flasken rundt nogle gange. Sikkerhed: EtBr (Ethidium bromid) anvendes til farvning af DNA og fluorescerer i UV lys. Ethidiumbromid er stærkt mutagen, men bruges i denne øvelse i så lav koncentration, at der ikke er nogen sikkerhedsforanstaltninger ud over brug af nitrilhandsker. Husk at bruge handsker (nitrilhandsker, de er blå) ved håndteringen af EtBr, da det er mutagen! UV-lys er skadeligt for øjnene. Derfor skal man normalt bruge beskyttelsesbriller ved brug af transilluminatorer, men den her anvendte model er afskærmet og kan ikke ved normalt brug forårsage skade.
Page9 10. Lad gelopløsningen køle af i 5 min. 11. Hæld blandingen op i gelkarrene (ca. 40-50 ml per gel). Undgå luftbobler. Kom kammen i toppen af gelen. Lad gelen størkne. (20-30 min). Hvis I ikke bruger al agarose-opløsning til at støbe geler med, kan resten hældes i en pose, som smides i skrald når det er størknet. Husk at skylle flasken ren med vand mens den er varm. 12. De geler, som ikke skal bruges samme dag, kan gemmes i en plasticpose i køleskabet i op til 1 uge. B2: Gelelektroforese 1. Brug Nitrilhandsker ved håndteringen af gelen. 2. Løsn støbeforms-klemmen, tag kammen op af gelen og kom gelkaret over i et elektroforesekar. Brøndene fra kammen skal vende mod den negative pol i elektroforesekaret, og bunden af gelen skal vende mod den positive pol i elektroforesekaret. DNAet er negativladet og vil derfor vandre mod den positive pol. 3. Hæld 1xTAE Buffer i elektroforesekarret, så brøndene og gelen er dækket med bufferen. 4. Bland 2 µl DNA loading buffer med 10 µl oprenset DNA prøve i et nyt eppendorfrør. Husk at mærke det korrekt. Et nyt eppendorfrør for hver prøve. 5. Tilsæt 3 µl 1 kb DNA markør til den første brønd. 6. Tilsæt 10 µl af blandingen fra pkt.4 til den næste brønd osv. Der er plads til i 14 prøver/gel. 7. Når DNA markøren og alle prøverne er tilsat gelen sættes gelelektroforese-låget på. 8. Tilslut strømforsyningen til gelelektroforesekaret. VIGTIGT: Husk at sætte rødt stik i rødt hul og sort stik i sort hul i strømforsyningen. 9. Strømforsyningen indstilles på 90 V i 45 min. 10. Tryk start (RUN). Når strømmen er tilsluttet elektroforesekarret er der risiko for stød. Eleverne må derfor kun arbejde med opstillingen, hvis udstyret er godkendt til dette. Det vil gælde de medfølgende elektroforesekar.
Page10 11. Læg gelen på en UV-bakken (se figur 6)og tag et billede (anvend den medfølgende Geldoc) Figur 6 UV-tray til Gel Doc'en med gel på. 12. Gel Doc en anvendes på følgende måde: a) Tilslut Gel Doc en til den medfølgende labtop med USB-kablet. b) Tænd for strømforsyningen til Gel Doc en. c) Start PC en. d) Start Image Lab softwaren på skrivebordet på labtoppen e) Sæt UV-bakken med gelen ind i Gel Doc ens dør. Sørg for at magneterne griber bakken. f) Luk døren. g) Klik på den store grønne knap forrest på Gel Doc en. h) Gel Doc en detekterer og analyserer nu bakkens indhold med et forvalgt program. i) For at gemme billedet: klik på FILE og derefter SAVE AS og giv filen et navn inden du klikker på GEM. j) UV-bakken skal gøres ren med mild sæbevand eller milde opløsningsmidler som eks. den medfølgende 70 % Ethanolopløsning (Den tåler IKKE opvaskemaskine). Tør den til sidst af med fnugfrit papir. Støvpartikler fra papir vil kunne ses som lysende partikler på UV billederne. 13. Tolkning af agarosegelen. I de oprensede prøver kan der være genomisk DNA, RNA og protein. Det genomiske DNA spaltes let i mindre molekyler, hvis det håndteres hårdt under oprensningen, fx når man
Page11 ryster eller vortex er. Derfor vil mindre fragmenter vise sig som en hale efter båndet. Længere nede kan der forekomme bånd som skyldes bestemte molekyler fx ribosomalt RNA eller proteiner. Markørerne i de to bånd i siderne angiver bestemte længder af DNA. Afstanden mellem hvert bånd ses til højre i figur 7. En 1% agarose gel kan ikke separere DNA fragmenter større end 5000 bp specielt godt. Derfor vil det genomiske DNA ligge som et kompakt bånd over 10.000 bp markøren, ca. omkring 20-30.000 kb. Det humane genom består af ca. 3 millioner bp. Er det spaltet meget, vil båndet vise sig længere nede på gelen. rrna vil vise sig som 800 og 12-1400 kb-bånd. Hvis oprensningen er lykkedes, vil rrna båndene ikke vise sig, se figur 9. Ethidiumbromid binder sig til DNA. Når gelen belyses med uv-lys, vil DNA derfor vise sig som lysende bånd. Båndenes placering på gelen fortæller, hvor store DNAfragmenterne er. Lange molekyler vandrer langsommere gennem gelmaterialet fordi de tilbageholdes af gelens struktur, mens små molekyler vandrer længere. Derfor vil mindre DNA-fragmenter vise sig som en hale. Hvis oprensningen er lykkedes, vil man derfor kunne se et tydeligt bånd øverst, evt. med en hale. Figur 7: 1% agarosegel hvor der er loaded 7 oprensede genomiske DNA prøver på. I brønd 1 og 9 er der loaded 2 µl 1 kb DNA markør (Fermentas). Øverst i de 7 brønde med prøver ses et tydelig bånd, der indikerer, at der er intakt genomisk DNA i prøven. Det ses også at koncentrationerne i prøve 1-4 er betydelig højere i prøve 5-7. Hvis båndene ikke viser noget DNA overhovedet, vil man vælge ikke at lave PCR reaktioner med disse DNA prøver, da de ikke er oprenset tilstrækkeligt til, at der er nok rent genomisk DNA.
Page12 C) Polymerase Chain Reaction (PCR) med AB0 gene specifikke primere 1. Start med at tænde PCR maskinen og anvend følgende program. PCR-maskinen er allerede programmeret med dette program. Det hedder BIOTEK-1 og kan findes under de gemte protokoller (saved procotols) under MAIN. Vælg dette program og tryk RUN, når alle PCR rør med prøver er sat i maskinen. Temperatur Tid Cyklusser 95⁰C 11 min 1 95⁰C 30 sec 60⁰C 30 sec 35 72⁰C 1 min 72⁰C 5 min 1 10⁰C Pause For høj koncentration af template-dna i en PCR-reaktion kan give uspecifik binding af primerne. Man kan koncentrationsbestemme DNA spektrofotometrisk, men ældre udstyr kræver tit et alt for stort volumen end hvad vi har elueret. På baggrund af tidligere erfaring med forsøget anbefaler vi derfor: At fortynde de 50 µl eluat, der er tilbage efter elektroforesen 250x. (dvs 4µl eluat + 996 µl DNA-vand) Gør 2 PCR rør pr. prøve klar. Skriv på låget så du kan kende forskel på dine prøver. Grp. 1 navngiver sine rør: 1a og 1b Grp. 2 navngiver sine rør: 2a og 2b Osv. Tallet indikeret gruppens nummer, og bogstavet indikerer, hvilket primer mix der er anvendt (se nedenfor). 1. Sæt PCR rørerne på is. 2. Tilsæt 20 µl genomisk DNA (fortyndet 250x) til hvert rør.
Page13 3. Tilsæt 5 µl Exon6 primer mix (10 µm) til rør a 4. Tilsæt 5 µl Exon7 primer mix (10 µm) til rør b MEGET VIGTIGT: Skift pipette spids HVER GANG, så primer og prøver ikke forurenes eller bliver blandet med hinanden!!! 5. Bland følgende PCR reaktionsmix på is og i den givne rækkefølge (Hvis der blandes til flere prøver, multiplicer da volumenet med antallet af prøver+2, for at sikre der er nok) Pr. reaktion (prøve): 12,4 µl DNA H2O 5 µl DreamTaq Buffer (10x) 2 µl dntp mix (25 mm) 4 µl MgCl2 (25 mm) 1,6 µl Dream Taq Polymerase 6. Tilsæt 25 µl PCR reaktionsmix til hvert rør. 7. Når ALLES prøver er klar: Tag din isbakke med prøver hen til PCR maskinen. 8. Sæt hurtigt dine prøver i og luk PCR maskinen. Det er vigtigt at prøverne ikke står og venter i PCR-maskinen, fordi alles prøver ikke er klar! 9. Tjek at PCR programmet kører ved at tiden på 11 min tæller op. PCR programmet varer ca. 2 timer. D) Gelelektroforese af PCR produkter. Hvis man støbte 3 geler i begyndelsen af forsøget, tages de sidste 2 nu frem fra køleskabet. Husk at anvende nitril-handsker ved håndtering af gelerne. 1. Kom gelkaret over i et elektroforesekarret. Brøndene fra kammen skal vende mod den negative pol i elektroforesekaret, og bunden af gelen skal vende mod den positive pol i elektroforesekaret. DNAet er negativladet og vil derfor vandre mod den positive pol. 14. Hæld 1xTAE Buffer i elektroforesekaret, så brøndene og gelen er dækket med bufferen. 15. Bland 2 µl DNA loading buffer med 5 µl PCR prøve.
Page14 16. Tilsæt 3 µl 1 kb DNA markør til den første brønd. 17. Tilsæt 6 µl prøve (produktet fra pkt.13) til den næste brønd osv. 18. Når DNA markøren og alle prøverne er tilsat gelen sættes gelelektroforese-låget på. 19. Tilslut strømforsyningen til gelelektroforesekarret. VIGTIGT: Husk at sætte rødt stik i rødt hul og sort stik i sort hul i strømforsyningen. 20. Strømforsyningen indstilles på 90 V i 45 min. 21. Tryk start (RUN). 22. Læg gelen på en UV-bakken og tag et billede. Samme procedure som under punkt B2. Produktet af exon 6 forventes at være ca. 460 bp mens exon 7 er 650 bp. 23. Det tilbageværende PCR produkt fra alle prøver, som gav bånd, skal nu markeres som angivet nedenfor og sendes tilbage til Aalborg Universitet for efterfølgende sekventering. 24. Rørene markeres således: Gruppe x, exon 6 Gruppe x, exon 7 25. Sæt alle prøverne i den medfølgende blå frost-box og opbevar denne i fryseren indtil dagen for tilbagesendelse (alternativt dagen før afsendelse). 26. Når prøverne kommer tilbage til AAU vil de gennemgå en PCR-cleanup (proces, hvor taq-pol, dntp s og primer-rester fjernes), hvorefter de sendes til sekventering. (Normalt hos Eurofins i Tyskland.) Begge exons vil af prismæssige hensyn kun blive sekventeret med forward-primeren. 27. Resultaterne bliver returneret til skolen så snart de modtages retur fra sekventeringsfirmaet. For at tolke sekvens-resultaterne, er man nødt til at læse vejledningen grundigt igennem samt at downloade programmet Chromas Lite, som gratis kan downloades fra internettet. Dette gøre i samarbejde med læreren. Rigtig god fornøjelse!
Page15 Lærernote: Denne del af vejledningen, hvor man analyserer de filer, man får tilbage efter laboratorieanalysen, kan være lidt vanskelig at forstå. Derfor er den kun indsat i lærervejledningen. Læreren må så afgøre, om eleverne skal have den udleveret, eller om læreren vil analysere eksempler på resultaterne sammen med eleverne på klassen vha. f.eks. projektor, inden eleverne selv laver analysen. Før vi begynder Til analyse af sekvensresultaterne, skal I installere 2 programmer. Begge ligger på skrivebordet på den PC, der er med til GelDocen. Alternativt kan de hentes her: Chromas (til at kigge på elektroferogrammer): http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html CLC sequence Viewer (Til at kigge på FASTA sekvenser): http://www.clcbio.com/index.php?id=479 God fornøjelse! AB0 genet AB0 genet koder for glykosyltransferase og er lokaliseret på kromosom 9, hvor det strækker sig over 20.068 basepar. Genet består af 7 exons (kodende sekvenser) som samlet udgør et mrna transkript på 1580 nukleotider (nt). 1062 nt af mrna transkriptet oversættes til et 354 aminosyrer stort protein. Glykosyltransferase katalyserer overførslen af kulhydrater til H-antigenet, hvorved antigen strukturen for AB0 blodtyperne dannes. Glykosyltransferase, som henholdsvis A og B allellerne koder for, varierer minimalt i aminosyresekvensen, men katalyserer overførelsen af forskellige kulhydrater (transferase A: N- acetylgalactosamine eller transferase B: galactose) til H-antigenet, hvorved A og B antigenerne dannes. Individer med blod typen 0 producerer hverken A eller B antigen, hvilket skyldes en enkelt base-deletion i AB0 genet. Åben filen NG_006669.clc med CLC seqeunce Viewer. Vælg Fith width. Under Annotation types sørg for at Primer, SNP, mrna,deletion og CDS er markerede. I bør nu se følgende billede af sekvensen for AB0 genet:
Page16 Her kan I se: Sekvensen for genet (blå) Sekvensen for mrna transkriptet (grøn) Den sekvens der koder for protein kaldet CDS (gul) De positioner, kaldet single nucleotide polymorphisms (SNPs) hvor A, 0 og B allellerne er forskellige (lys grøn) I kan også se der hvor Exon6 og exon7 primerne anealer. Det er stykket mellem primerne, som er blevet amplificeret og sekventeret. Blodtypebestemmende AB0 allel-variationer For at finde ud af hvilken blodtype I har, skal I først undersøge om I har 0,1 eller 2 0-alleller. Hvis I ikke har en 0-allel, skal I herefter undersøge om I har en A eller B-allel eller begge to (og derfor har genotypen AA, BB, eller AB). Hvis I har én 0-allel, skal I herefter undersøge, om I har en A eller B-allel (og derfor har genotypen 0A eller 0B). ). Hvis I har to 0-alleller og derfor har genotypen 00, behøver I ikke undersøge mere (men tag alligevel et kig på resultaterne fra exon 7). Blodtype 0: Blodtype 0 er forskellig fra blodtype A allellen grundet en base deletion af en guanin base på Exon 6 (position 17727). Denne base deletion finder sted tæt på N-terminalen (den første del) af proteinet og vil medføre et frameshift, som resulterer i, at et andet protein bliver oversat. Dette protein er meget mindre (kun 116 aminosyrer) og er ikke i stand til at modificere H-antigenet Blodtype A/B: Allellerne der koder for A og B glykosyltransferase varierer med 7 nukleotider. De fleste af disse er placeret i exon 7, hvilket I kan se i NG_006669.clc Analyse af Exon 6 (bestemmelse af antallet af 0-alleller) For at finde ud af hvilken blodtype I har, skal I først undersøge om I har 0, én eller to 0-alleler. 0-allelen er bestemt ved en deletion af en enkelt base ( G ), som er placeret i exon 6 (på position 17727 i NG_006669.clc ).
Page17 Åben elektroferogrammet (.ab1 fil) fra exon 6 med Chromas Lite Søg på den sekvens (GAAGGATGTCCTCGTGGT), der kommer lige før mutationen. Nedenfor er et eksempel, hvor personen har deletionen på begge alleler (og derfor har blodtypen 0 ): Har personen ingen 0-allel, vil der være et G efter det T pilen peger på. Hvis en person har én 0-allel (og enten en A eller B allel) vil der mangle et G på den ene DNA-streng, men ikke på den anden. På figuren nedenfor kan I se, at der både er en grøn og en sort top, som viser at der kun er en deletion på den ene allel. Elektroferogrammet bliver herefter forskudt.
Page18 Analyse af Exon 7 (bestemmelse af antallet af A og B-alleller) Åben elektroferogrammet (.ab1 fil) fra exon 7 med Chromas Lite Søg på den sekvens der kommer lige før en af positionerne som er forskellige mellem A og B, fx GTCAGTGCTGGAGGTG, som kommer lige før den anden SNP (position 19044 som er et S. S betyder C eller G). Her er et eksempel hvor personen har et C på begge alleler: Da 0-allelen er ens med A-allelen i de positioner hvor A- og B-allelerne er forskellige, vil personen have genotypen AA eller A0 (afhængig af hvad analysen af exon 6 viste). Hvis der på positionen både er en top for et C og et G vil personen være enten 0B eller AB (igen afhængig af hvad analysen af exon 6 viste). Hvis der på positionen kun er et G vil personen have genotypen BB. Når I har undersøgt denne position, kan I vælge nogle af de andre (kig i NG_006669.clc, find sekvensen lige før en postion og søg med denne sekvens i Chromas Lite). Resultatet skulle gerne vise det samme. Nu bør I kende jeres genotype, og udfra denne også jeres fænotype.