Til in vitro diagnostisk medicinsk brug: n n REF 080-035 Tilsigtet anvendelse MycAssay Pneumocystis er indiceret til brug af kvalificerede laboratoriemedarbejdere til kvalitativ påvisning af Pneumocystis jirovecii genomisk DNA ekstraheret fra respirationsprøver fra de nedre luftveje (f.eks. bronkiale prøver) som en hjælp for diagnosticering hos voksne patienter, som mistænkes at have P. jirovecii-lungebetændelse. MycAssay Pneumocystis er blevet godkendt til brug med instrumenter i n, enten Mx3000P eller Mx3005P (ved anvendelse af MxPro softwareversion 4.10. Resumé og forklaring Pneumocystis jirovecii (tidligere carinii) lungebetændelse (PCP) er en almindelig opportunistisk lungebetændelse hos immunsvækkede patienter, især dem med fremskreden HIV-infektion og AIDS 1. Den erhverves typisk fra det omgivende samfund, og præsenterer sig som subakut, men fører til progressivt åndedrætssvigt og død 2, hvis den ikke behandles. Profylakse med trimethoprim-sulfamthoxazol (Bactrim eller Septrin) gives rutinemæssigt til mange risikopatienter, en praksis som væsentligt har reduceret forekomsten af PCP, men der sker gennembrud og de, der ikke ved at de er HIVpositive kan demonstrere AIDS med PCP 3. PCP forekommer også hos andre immunsvækkede patienter, inklusive modtagere af hele organtransplantater, hypogammaglobulinæmi, og kronisk leukæmi. Aktuelt er diagnosticeringen af PCP baseret på mikroskopi-metoder, da P. jirovecii ikke kan podes rutinemæssigt i mikrobiologilaboratorier. Bronkoalveolær lavage (BAL) er den foretrukne metode til indsamling af prøver. Almindelige metoder til diagnosticering omfatter immunofluorescens (IF) eller direkte fluorescens og histologisk farvning af prøver 4. er et molekylært diagnosesæt til påvisning af P. jirovecii baseret på Molecular Beacon 5 PCRteknologi. Hele testproceduren, inklusive udtrækning af DNA fra den kliniske prøve, kan gennemføres i løbet af 4 timer, eller kun 2 timer hvis ekstraheret DNA allerede er tilgængeligt. Denne analyse giver direkte fordele i form af forbedret laboratorieeffektivitet kombineret med en hurtig test, der medfører sandsynlige kliniske fordele. Testens diagnostiske præcision afhænger i stor udstrækning af prøvens kvalitet. Analysens principper Efter blanding af reagenserne i MycAssay Pneumocystis-sættet med en prøve, der indeholder den ønskede Pneumocystis DNA-sekvens (en del af den store Pneumocystis mitokondrial ribosomal underenhed), vil thermocycling resultere i DNA-amplifikation. Analysen indeholder også en Internal Amplification Control (IAC) sekvens, et DNA-fragment der ikke findes i Pneumocystis, andre fungale, bakterielle eller humane genomer, for at påvise PCR-hæmmende substancer og bekræfte funktionen af analysereagenserne. De amplificerede DNA-mål påvises ved hjælp af Molecular Beacons; enkeltstrengede oligonucleotid hybridiseringsprober, som danner en trin-og-spiral struktur. Spiralen indeholder en probesekvens, som er komplementær til en målsekvens, og trinnet dannes af adouceringen af komplementære armsekvenser, som er placeret på hver side af probesekvensen. En fluorofor, som fluorescerer, når den exciteres med lys med den passende bølgelængde, er kovalent bundet til enden af én arm og en slukker, som undertrykker fluorescensen af fluoroforen ved tæt fysisk nærhed, er kovalent bundet til enden af den anden arm. Molecular beacons fluorescerer ikke, når de befinder sig frit i opløsningen. Imidlertid, når de hybridiserer til en nukleinsyrestreng, der indeholder en målsekvens, undergår de en konformationsændring, som gør dem i stand til at fluorescere. Mængden af fluorescens ved en hvilken som helst given cyklus, eller efter gennemført cyklus, afhænger af mængden af tilstedeværende specifikke amplikoner på det pågældende tidspunkt. Stratagene Real-Time PCR systemet monitorerer samtidigt fluorescensen, der udsendes af hver beacon. 1 Morris A, Lundgren JD, Masur H, Walzer PD, Hanson DL, Frederick T, Huang L, Beard CB, Kaplan JE. (2004). Current epidemiology of Pneumocystis pneumonia. Clin Infect Dis: 10: 1713-20. 2 Miller RF, Allen E, Copas A, Singer M, Edwards SG. Improved survival for HIV infected patients with severe Pneumocystis jirovecii. pneumonia is independent of highly active antiretroviral therapy. Thorax 2006; 61:716-21. 3 Kovacs JA, Gill VJ, Meshnick S, Masur H. (2001). New insights into transmission, diagnosis, and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia. JAMA: 286: 2450-60. 4 Huang L, Morris A, Limper AH, Beck JM; ATS Pneumocystis Workshop Participants. An Official ATS Workshop Summary: Recent advances and future directions in pneumocystis pneumonia (PCP). Proc Am Thorac Soc 2006;3:655-64. 5 Tyagi S, Kramer FR. (1996). Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology: 14: 303-308. Dansk 1
Til in-vitro-diagnostisk brug Forholdsregler Denne test er udelukkende beregnet til in vitro diagnostisk anvendelse. Sættet er udelukkende beregnet til at blive anvendt af professionelle laboratoriemedarbejdere. Der kræves procedurer til non-aerosol manipulation af prøver. Standardforholdsregler og institutionsretningslinjer skal følges ved enhver håndtering af alle prøver. Et materialesikkerhedsdatablad kan fås hos Myconostica Ltd. Denne test er udelukkende beregnet til anvendelse med n med MxPro softwareversion 4.10. Under valideringsundersøgelser har vi bemærket følgende, der er specifikt for dette instrument: o Hvis instrumentet er blevet brugt umiddelbart inden, skal lampen have mulighed for at afkøle i mindst 1 time inden start af en MycAssay TM Aspergillus-kørsel for at undgå falske negativer. o Der er mindre præcision ved lave koncentrationer ved og rundt om den kliniske cut-off i forhold til andre instrumenter, som vi har testet Brug ikke reagenser eller kontroller, hvis de beskyttende poser er åbne eller gået i stykker ved modtagelsen. Reagenser og kontroller kan ikke ombyttes imellem sæt med forskellige partinumre. Hæld aldrig reagenser eller kontroller sammen fra forskellige glas, selvom de er fra samme parti. Anvend aldrig reagenser eller kontroller efter deres udløbsdato. Reagenser og kontroller må ikke genfryses eller genanvendes efter åbning. Anvend beskyttelsestøj og engangshandsker ved håndtering af kitreagenser. Undgå mikrobiel smitte og kontaminering med deoxyribonuclease (DNAse) af reagenser, når de afmålte mængder fjernes fra glassene. Det anbefales at bruge sterile, DNase-fri, lav-retentions engangs filter-tips eller positive displacement pipette tips. Brug en ny spids til hver prøve eller hvert reagens. Bortskaf ubrugte reagenser og affald i overensstemmelse med gældende nationale og lokale love og forskrifter. For at undgå kontaminering med Pneumocystis eller IAC-amplicons må reaktionsglassene ikke åbnes efter amplifikation. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i områder, hvor prøver eller sættets reagenser håndteres. Lave koncentrationer af DNA kan være ustabile ved ukorrekt opbevaring. Det anbefales, at udtrækninger af DNA opbevares ved -80 o C for at bevare deres integritet. Desuden skal gentagne optøninger og genfrysninger altid undgås, når det er muligt. Dette sæt blev godkendt med anvendelse af 0,2 ml, 8-strips PCR-glas med påsatte hætter (Agilent Technologies kat. nr. 401428 og 401425). Anvendelse af andre plastikkilder/-typer kan ugyldiggøre tærsklerne og derfor kravene i brugsanvisningen. Det anbefales at udføre lokal validering med positive og negative kontrolreaktioner, hvis der bruges en alternativ kilde. Sættets indhold Beskrivelse Sættet består af fem forseglede 3-rums folieposer, som hver kan anvendes separat. Hver pose indeholder tilstrækkeligt reagens til 8 reaktioner. Volumen Glas 1 (orange hætte) Glas 2 (blå hætte) Glas 3 (klar hætte) Glas 4 (sort hætte) dntps MgCl 2 Bufferet opløsning af DNA polymerase kompleks <0,01 % primere <0,01 % Molecular Beacons <0,0001 % Internal Amplification Control (IAC) IAC er et rekombinant DNA-plasmid, der indeholder en ikke-infektiøs sekvens uden relation til nogen af målsekvenserne (Pneumocystis) Tris-HCl buffer Negativ kontrol Vand Positiv kontrol <0,0001 % positiv kontrol DNA Det positive kontrolmolekyle er et rekombinant plasmid, der indeholder Pneumocystis-målsekvenserne Tris-HCl buffer 66 µl 66 µl 25 µl 25 µl Sættet indeholder desuden: MycAssay Pneumocystis Myconostica Protocol CD-ROM Brugsanvisning Analysecertifikat Dansk 2
Til in-vitro-diagnostisk brug Lagring Sættet skal opbevares i frossen tilstand (-15 til -25 C) indtil udløbsdatoen, der er angivet på etiketten på sættets boks. Derefter skal det kasseres og bortskaffes ifølge lokale forskrifter. Når en pose er blevet åbnet, skal dens indhold anvendes straks og må ikke genfryses eller genanvendes. Nødvendigt udstyr/materiale (medfølger ikke) Stratagene Mx3000 series Real-Time PCR System (inklusive brugervejledning, tilsluttet computer og MxPro softwareversion 4.10). Optiske PCR-stripglas (Agilent Technologies, kat. nr: 401428) Optiske PCR-striphætter (Agilent Technologies, kat. nr: 401425) Mikrocentrifuge med 0,2 ml PCR-glasadapter. Vortexmixer Stativ til PCR-glas. Mikropipetter (nødvendigt volumen 7,5 µl 20 µl) Sterile lav-retentions filterspidser Engangshandsker, uden pudder Mønsterbeskyttet DNA-dekontamineringsopløsning Permanent markeringspen DNA-isolationssæt (se nedenfor) Prøve Prøven til analysen er totalt DNA ekstraheret fra kliniske BAL-prøver. Det anbefales at anvende følgende DAN-isolationssæt og udstyr fra Myconostica Ltd., der også blev anvendt ved valideringen, til dette formål: - MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt (REF: 080-005, kan fås hos Myconostica) - Vortex-Genie 2 (Scientific Industries Inc., New York, USA) - Vortex Adapter Plate (REF: 080-015, kan fås hos Myconostica) Bemærkninger til proceduren Læs hele protokollen inden arbejdet påbegyndes Hele MycAssay Pneumocystis processen (eksklusive DNA-ekstraktion) tager ca. 2 timer, afhængigt af antallet af testede prøver. Opsætning af testen skal udføres i en PCR-arbejdsstation eller et præ-pcr laboratorium. Hvis en PCR-arbejdsstation ikke er tilgængelig, skal testen opsættes i et dertil beregnet område af laboratoriet 6, som regelmæssigt rengøres med DNA-dekontamineringsreagenser. Det skal imidlertid undgås at anvende DNA-dekontamineringsreagenser ved opsætning af Real-Time PCR, da de kan hæmme analysen. Brug mikropipetter til overføring af væsker. Mikropipetter, der kun er beregnet til dette formål, skal bruges til opsætning af disse reaktioner og de skal regelmæssigt dekontamineres. Det anbefales at anvende lav-retentions filterspidser for at sikre, at der ikke mistes noget DNA under opsætningsproceduren. Udvis forsigtighed ved håndtering af Glas 4. Dette Glas indeholder skabelon DNA materiale og kontaminering kan medføre forkerte positive testresultater. Bær altid handsker. Alle reagensglas skal forsynes med hætte efter brug og inden bortskaffelse. Notér prøvernes nøjagtige position, når der behandles flere patientprøver ad gangen. Lampen skal have mulighed for at afkøle i mindst 1 time inden start af en MycAssay TM Aspergillus kørsel for at undgå falske negativer. Efter denne afkølingsperiode skal lampen gennemgå en 20 minutters opvarmningsperiode som angivet i 1.1 herunder. 6 Se f.eks. Mifflin, T. E. (2003). Setting up a PCR Laboratory. In PCR Primer, 2nd Ed. (eds. Dieffenbach og Dveksler). Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. USA. Dansk 3
Anvendelsesprocedure 1. Opsætning af Real-Time PCR Til in-vitro-diagnostisk brug 1.1 Tænd først for Real-Time PCR-systemet (instrument og tilhørende computer) og start MxPro 4.10 software. Indtast brugernavn og password, hvis det kræves. Lampen kræver 20 minutters opvarmning. Kørslen må ikke startes, før lampen er parat. 1.2 Kontrollér at arbejdsområdet er blevet rengjort med DNA-dekontamineringsreagenser og at det er helt tørt; undgå brug under analyse-opsætning, da resterende rengøringsopløsning kan hæmme PCR-reaktionerne. 1.3 En pose indeholder én af hver af Glas 1, Glas 2, Glas 3 og Glas 4. Der er tilstrækkelig mængde reagenser i én pose til gennemføre 8 reaktioner. Der skal udføres mindst én positiv kontrol og én negativ kontrol-reaktion pr. kørsel, hvor reagenserne er fra et enkelt sæt. Derfor kan én pose analysere 6 patientprøver. Hvis der skal testes mere end 6 prøver, kan der bruges mere end én pose, hvis de anvendte poser er fra samme sæt-parti. Der kan testes maksimalt 38 patientprøver med de 5 poser i sættet. 1.4 Beregn antallet af nødvendige reaktioner med reference til nedenstående tabel: Antal poser Maksimalt antal patientprøver 1 6 2 14 3 22 4 30 5 38 1.5 Tag det passende antal poser ud af fryseren. Brug aldrig en pose, der ikke længere er forseglet. Tag også patientprøverne ud af fryseren, hvis de blev frosset efter ekstraktionen. 1.6 Åbn det nødvendige antal poser og tag glassene ud. Hvis der anvendes mere end én pose, men der kun gennemføres ét sæt positive og negative kontroller, er det kun nødvendigt at tage Glas 3 og 4 ud af den ene pose. Udvis forsigtighed ved håndtering af Glas 4. Dette Glas indeholder DNA-materiale til positiv kontrol og kontaminering kan medføre falsk positive testresultater. 1.7 Lad glassenes indhold tø op ved at anbringe dem på laboratoriebænken i 5-10 minutter og sikre, at indholdet af hvert glas er helt optøet inden der fortsættes. Bland glassenes indhold og patientprøverne med Vortex-mixer. Centrifugér dem derefter kort i en mikrocentrifuge for at sikre samling af alt indholdet i glassenes bund inden anvendelse. 1.8 Anbring det nødvendige antal PCR-glas i stativet. 1.9 Opsæt altid først den negative kontrol og derefter testprøverne. Den positive kontrol skal altid opsættes til sidst. 1.10 Reagens- og DNA-voluminer vises i nedenstående tabel: Reagens Reaktion Negativ kontrol Patientprøve Positiv kontrol Glas 1 (orange hætte) 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl Glas 2 (blå hætte) 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl Glas 3 (klar hætte) 10 µl - - Patientprøve - 10 µl - Glas 4 (sort hætte) - - 10 µl Totalt volumen 25 µl 25 µl 25 µl 1.11 Tilføj reagenser i den rækkefølge, der er vist i ovenstående tabel; Glas 1, derefter Glas 2, fulgt af skabelonen (negativ kontrol, patientprøve eller positiv kontrol). Vær forsigtig ved udtagning af alikvoter fra Glas 1. Væsken er en smule viskøs og kan klæbe til glassets indvendige rand. Hvis dette sker, skal det køre igen i centrifugen for at samle det endelige indhold i bunden af glasset, inden det forsøges at fjerne de endelige alikvoter. 1.12 Brug en ny pipettespids til hver væskeoverføring. Sæt hætten på hvert reagensglas igen efter brug og kassér det straks sammen med det resterende indhold i en lukket beholder til klinisk affald. Ubrugte reagenser kan ikke gemmes til senere brug. Dansk 4
Til in-vitro-diagnostisk brug 1.13 Vær især forsigtig ved udtagning af væsken med pipette fra Glas 4 (DNA til positiv kontrol) for at sikre, at den ikke kontaminerer andre reaktionsglas. Ved at lukke lågene på de andre reaktionsglas inden åbning af Glas 4 reduceres risikoen for krydskontaminering. 1.14 Kontrollér at alle reaktionsglas-låg er fast lukket. Notér positionen af hver prøve i stripglassene. Sæt mærkat på det første glas af hver strip, hvis der bruges mere end ét stripglas. Lad reaktionsglassene centrifugere ned i 10 sekunder i en minicentrifuge med 0,2 ml PCR-glasadapter. Kontrollér visuelt, at der ikke er bobler i reaktionsblandingerne. 1.15 Gå straks videre til Afsnit 2. reaktioner er stabile på bænken i op til 60 minutter. 1.16 Efter PCR-opsætningen skal det sikres, at arbejdsområdet rengøres omhyggeligt med DNAdekontamineringsreagenser. 2. Gennemførelse af kørslen 2.1 Åbn MxPro softwaren, version 4.10. 2.2 Indsæt MycAssay Pneumocystis Myconostica protokol-cd-rom'en 2.3 I menuen New Options vælges den første valgmulighed: Real Time: Quantitative PCR (Multiple Standards), og klik på OK, som vist: 2.4 Klik på knappen Import til højre i fanen Plate Setup. Vælg MycAssay PNE Myconostica Protocol CD-ROM fra rullelisten i Look-In: og importér dernæst filen MycAssay Aspergillus v3_1.mxp. Klik på Finish. Når dette er udført, bør Plate Setup ligne dette eksempel: 2.5 Det anbefales at indstille Well Type på <blank> (fra Well Type rullelisten) i de brønde, der er tomme, for at forhindre lysbrydning fra plastikken, der interferer med signalerne fra de brønde, som ikke indeholder reaktioner. 2.6 Gentag importprocessen i fanen Thermal Profile Setupfor at importere PCR-programmet for denne analyse. Indstil Thermal Profile Design på Custom og dernæst Import fra den samme fil som beskrevet i 2.4. Når dette er udført, bør Thermal Profile Setup ligne dette eksempel: Dansk 5
Til in-vitro-diagnostisk brug 2.7 I fanen Plate Setup nanvgives brøndene på passende vis. Højreklik på en fremhævet brønd (eller brøndgruppe, hvis formeringer) og vælg Well Information fra listen med valgmuligheder. Indtast navnet på den prøve, der bruges i denne brønd i afsnittet Name:. 2.8 Når alle brønde er navngivet korrekt, gemmes kørslen idet den gives et passende filnavn, der inkluderer datoen og operatørens initialer, og start dernæst kørslen ved at vælge knappen Run øverst til højre på skærmen i fanen Instrument. Klik til slut på knappen Start i nederste, højre hjørne. 2.9 Husk at lade instrumentet afkøle i mindst 1 time, inden der startes med trin 1.1 igen. 3. Dataanalyse og fortolkning 3.1 Når kørslen er færdig, kan resultaterne ses ved at vælge knappen Analysis øverst til højre på skærmen, efterfulgt af fanen Results. 3.2 Vælg Amplification Plots analysis area, indstil tærsklerne for hver kanal som følger, og lås ved at klikke på hængelåsikonet; PNE = 500 IAC = 100 3.3 Adaptive Baseline skal også vælges. Det er sædvanligvis standardindstillingen for denne software. 3.4 Gem ændringerne. Hver kanal kan ses separat ved at klikke på felterne i sektionen Assays Shown nederst til venstre på skærmen ved hhv. at aktivere og deaktivere dem. 3.5 Data kan eksporteres mhp. yderligere behandling i Excel på følgende måde:file>export Text Report>Export Text Report to Excel. Kun de brønde/farvestoffer, som er blevet fremhævet, bliver eksporteret, så det skal sikres, at alle relevante/påkrævede brønde/farvestoffer er valgt. 3.6 Åbn den gemte.csv file med Excel eller et lignende regnearksprogram. 3.7 Analysér hver prøve ved at starte med kontrollerne, som vist i nedenstående flowskema (detaljer findes også i tabellen under flowskemaet): Dansk 6
Til in-vitro-diagnostisk brug NEJ Kontrollér den negative kontrol Er PNE Ct 39.0 or registreret som No Ct? JA Kørslen er kontamineret HANDLING: Gentag kørslen NEJ Kontrollér den negative kontrol Er IAC Cp 29,9-33,3? Kørselsfejl HANDLING: Gentag kørslen JA Kørselsfejl HANDLING: Gentag kørslen NEJ Kontrollér den positive kontrol Er PNE Cp 20,0-25,0? JA Positiv for Pneumocystis DNA JA Kontrollér patientprøven Er PNE Ct < 39.0? NEJ Negativ for Pneumocystis DNA JA Kontrollér patientprøven Er IAC Ct 29.3-33.3? NEJ IAC fejl HANDLING: Gentag prøven. Hvis det samme resultat opnås igen, mistænkes inhibitoren i prøven Prøve PNE MycAssay Ct IAC MycAssay Ct Fortolkning Yderligere handling Negativ kontrol 39,0 eller upåvist Inden for 29,3-33,3 Negativ kontrol acceptabel Patientresultater er gyldige Negativ kontrol 39,0 eller upåvist <29,3 eller >33,3 Fejl i negativ kontrol Gentag hele kørslen Negativ kontrol <39.0 Inden for 29,3-33,3 Kontaminering Gentag hele kørslen Positiv kontrol Inden for 20,0-25,0 Ikke relevant Positiv kontrol acceptabel Patientresultater er gyldige Positiv kontrol <20,0 eller >25,0 Ikke relevant Fejl i positiv kontrol Gentag hele kørslen Patient 39,0 eller upåvist Inden for 29,3-33,3. Negativ for Pneumocystis Patient <39,0 Ikke relevant Positiv for Pneumocystis Rapportér resultat: Resultat 1 Rapportér resultat: Resultat 2 Patient 39,0 eller upåvist <29,3 eller >33,3 IAC fejl i prøve Gentag prøve: Resultat 3 Se klinisk rapport (Resultat 1, 2 eller 3) Dansk 7
Til in-vitro-diagnostisk brug 4. Fejlfinding 4.1 Den negative kontrol har genereret et positivt signal i FAM-kanalen: Der opstod kontaminering under opsætningen. Resultater fra hele kørslen er ikke pålidelige og kan ikke betragtes som nøjagtige. Gentag hele kørslen og vær meget omhyggelig ved tilføjelse af skabelonerne, især den positive kontrol (Glas 4), for at sikre, at der ikke sker krydskontaminering. Kontrollér at arbejdsområdet og instrumenterne bliver korrekt dekontamineret før og efter brug. Den negative kontrol var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg omhyggeligt for, at alle reaktionerne forsynes korrekt med noter i programmet og at glas-stripsene anbringes i maskinen i den korrekte retning. Der blev anvendt ikke-anbefalede glas eller plader. Tærskler er kun gyldige, hvis der anvendes de anbefalede Agilent Technologies PCR-stripglas og -hætter (kat. nr. 401428 og 401425). 4.2 Den negative kontrol IAC Ct-værdi ligger ikke inden for det acceptable område: PCR er blevet hæmmet. Kontrollér, at arbejdsområdet og instrumenterne er helt tørre efter brug af dekontamineringsmidler inden PCRopsætning. Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Reagens fra enten Glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til PCR-reaktionen, eller der blev tilsat den dobbelte mængde fra Glas 2. Gentag kørslen idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan påvises, hvis det observeres, at væskeniveauet er højere eller lavere i ét reaktionsglas i forhold til andre. Der blev anvendt ikke-anbefalede glas eller plader. Tærskler er kun gyldige, hvis der anvendes de anbefalede Agilent Technologies PCR-stripglas og -hætter (kat. nr. 401428 og 401425). 4.3 Den positive kontrol er negativ/uden for området: Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Der opstod en fejl under opsætningen og den positive kontrolskabelon (Glas 4) blev anbragt i det forkerte reaktionsglas. Gentag kørslen idet der udvises stor forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan påvises, hvis der observeres et højere væskeniveau i et reaktionsglas og et lavere niveau i et andet, i forhold til normalt niveau. Reagenset fra enten Glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til reaktionen. Gentag kørslen idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan påvises, hvis der observeres et lavere væskeniveau i denne reaktion sammenlignet med andre. Den positive kontrol var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg omhyggeligt for, at alle reaktionerne forsynes korrekt med noter i programmet og at glas-stripsene anbringes i maskinen i den korrekte retning. Der blev anvendt ikke-anbefalede glas eller plader. Tærskler er kun gyldige, hvis der anvendes de anbefalede Agilent Technologies PCR-stripglas og -hætter (kat. nr. 401428 og 401425). Dansk 8
Til in-vitro-diagnostisk brug 4.4 Patientprøve(r) giver IAC failure : Det er sandsynligt, at den/de ekstraherede kliniske prøve(r) indeholder PCR-hæmmere. Vi anbefaler, at DNA ekstraheres ved hjælp af MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt. 4.5 Der findes ingen resultater for nogen kanal med nogen prøver eller kontroller: Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Det anvendte udstyr fungerer ikke optimalt. Kontrollér, at dit Real-Time PCR-instrument er blevet serviceret korrekt og er up-to-date, samt at det er blevet fuldt kalibreret som beskrevet i denne installations- og vedligeholdelsesvejledning. Der blev brugt en ukorrekt protokolfil under opsætning af softwaren. Referér venligst til Afsnit 2 og vælg den korrekte protokolfil, som specificeret for hver softwaretype/-version, fra Myconostica Protocol CD-ROM'en. Det er kun muligt at finde den fil, der passer til softwaren. Gentag kørslen ved hjælp af den korrekte protokolfil. Hvis du har yderligere spørgsmål, eller hvis du erfarer problemer, bedes du kontakte Technical Support (productsupport@lab21.com) Præstationskarakteristika og -begrænsninger Mx3000-seriens analysepræstationsdata Sættet blev indledningsvist valideret med Cepheid SmartCycler. Visse af disse analysepræstationskrav blev genvalideret på Mx3005P platformen med Optical PCR-glas og hætter (Agilent Technologies kat. nr. 401428 og 401425), og rapporteres herunder. Analytisk sensitivitet Ved hjælp af den oven for beskrevne protokol og et rekombinant Pneumocystis DNA molekyle genereret hos Myconostica blev Limit of Detection (LoD) for Pneumocystis bestemt til at være < 50 kopier. Denne værdi blev bestemt ved hjælp af et rekombinant DNA-plasmid, der indeholdt målsekvensen. Pneumocystis-målsekvensen er mitokondrial, derfor vil der være talrige kopier pr. celle, men det vides ikke hvor mange. Følgende præstationskrav blev fastlagt ved brug af Cepheid SmartCycler Analytisk selektivitet Analytisk selektivitet blev testet ved hjælp af DNA ekstraheret fra flere forskellige fungale og ikke-fungale arter. Der blev ikke rapporteret positivt resultat med følgende arter: Alternaria alternata, Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, A. terreus, Blastomyces capitatus, Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cladosporium spp., Cryptococcus neoformans, Doratomyces microsporus, Fusarium solani, Rhizomucor pusillus, Rhodotonila rubra, Saccharomyces cerevisiae, Scedosporium apiospermum, S. prolificans, Sporothrix schenkii, Trichosporon capitatum Der blev ikke rapporteret et positivt resultat med følgende bakteriearter: Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lactobacillus plantarum, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. salivarius. Humant genomisk DNA giver ikke et positivt resultat med denne analyse. Påvirkende substanser (kontraindikationer for brug) Følgende forbindelser blev testet i klinisk relevante koncentrationer og det blev konstateret, at de ikke hæmmede analysen: acteylcysteine, amphotericin, beclometasondipropionat, budesonid, colistimethatnatrium, fluticasonpropionat, Dansk 9
Til in-vitro-diagnostisk brug formoterolfumaratdehydrat, ipratropiumbromid, lidocain, mannitol, salbutamolsulfat, salmerterol, Septrin (trimethoprimsulphamethoxazol), natriumklorid, natriumcromoglicat, terbutalin og tobramycin. Præstationsevaluering Den kliniske cut-off-værdi ved en Ct-værdi på 39,0 blev fastslået efter en analyse af et set kliniske prøver hentet fra forskellige patientpopulationer. Kliniske prøver indsamlet ved bronkoalveolær lavage (BAL), der var blevet indsamlet fra 2 hospitaler, ekstraheret ved hjælp af MycXtra sættet og opbevaret, blev brugt til at evaluere præstationen af -sættet. Resultaterne fra PCR-metoden blev sammenlignet med immunofluorescent mikroskopi. PCR v mikroskopi-diagnose Mikroskopi positiv Mikroskopi negativ PCR positiv 45 8 0,85 PPV (positiv prædiktiv værdi) PCR negativ 2 33 0,94 NPV (negativ prædiktiv værdi) 0,96 0,80 Sensitivitet Specificitet Tabel 1: Diagnostisk følsomhed og specificitet af -sættet sammenlignet med immunofluorescent mikroskopi. Tabel 1 repræsenterer data indhentet fra patienter med diagnosticeret HIV, patienter der ikke er inficeret med HIV og patienter med ubestemt HIV-status. Patienter med Pneumocystis-lungebetændelse har meget varierende mængder af påviselige organismer; jo lavere Ct-værdi desto højere sandsynlighed for sygdom. Patienter med HIV og Pneumocystislungebetændelse har tendens til at have større antal af påviselige organismer end patienter, der ikke er inficeret med virussen, men der er en betydelig overlapning. Spredningsdiagrammet i figur 1 viser denne overlapning. For fuldkommenhedens skyld, da datasættet i tabel 1 omfattede patienter, hvis HIV-status var ukendt, er spredningsdiagrammet for denne gruppe inkluderet i figur 1 (søjle 3): Kategori 1 = HIV+ / Mikroskopi+ ; 2 = HIV- / Mikroskopi+ ; 3 = HIV ukendt / Mikroskopi+ ; 4 = Alle mikroskopi- Figur 1: Spredningsdiagram med Ct-værdier fra DNA ekstraheret fra patientrespirationsprøver. Der er beskrevet fire grupper. Dansk 10
Til in-vitro-diagnostisk brug Klinisk rapportering MycAssay Pneumocystis-sættet er beregnet til at fungere som en hjælp for diagnosticering af Pneumocystislungebetændelse. Resultaterne skal vurderes i sammenhæng med patientens kliniske tilstand og andre diagnostiske testresultater. I det følgende er angivet anbefalede rapporter, hver afhængig af fortolkningen af analyseresultatet. Resultat nr. 1 Pneumocystis jirovecii ikke påvist Resultat nr. 2 Pneumocystis jirovecii påvist. Positivt resultat Angiv Ct-værdi Resultat nr. 3 Test mislykket; hæmmere eller andre ukendte substanser tilstede Jo lavere Ct-værdi desto højere sandsynlighed for sygdom. Ved Ct-værdier tæt på cut-off-værdien på 39,0 er der større sandsynlighed for, at de repræsenter kolonisering end infektion, men nogle patienter kan have sygdom med meget lidt tilstedeværende P. jirovecii, repræsenterende en ringe prøve, tidligere behandling eller typen af fungal belastning i den specifikke patient. Procedurens begrænsninger Den grundlæggende begrænsning af denne procedure relaterer til kvaliteten af den primære prøve: - Hvis prøven er meget lille eller ikke er hentet fra det påvirkede område af lungen, vil testen være mindre følsom og kan være fejlagtigt negativ. - BAL-prøver skal centrifugeres inden DNA-ekstraktion fra tabletten. - Data har også vist, at en reduktion af voluminet af supernatant, der buges i ekstraktionsprocessen, opnået ved centrifugeringen, reducerer andelen af hæmmere, der trænger ind i systemet. Klinisk præstationsevaluering er ikke blevet bekræftet med brug af MX3005P instrumentet. Selvom MycXtra Fungal DNA ekstraktionsproceduren er beregnet til at fjerne PCR-hæmmere, er der ikke foretaget evaluering af alle lægemidler eller patientpopulationer. Proceduren er ikke blevet fuldt vurderet med spyt og er heller ikke blevet vurderet med inducerede saltvandsprøver eller på prøver fra børn. Falske positive resultater kan være forårsaget af ekstern kontaminering af den originale prøve eller test. En sådan kontaminering kan forårsages af P. jirovecii-kontamineret luft, ringe eksperimentalteknik med hensyn til positiv kontrol eller ekstern (især via pipette) kontaminering med P. jirovecii DNA. Da et sandt positivt resultat kan opnås fra patienter, som forbigående eller vedvarende er koloniseret af P. jirovecii, kræves der klinisk vurdering ved fortolkning af testresultaterne. LICENSER TopTaq TM Hot Start leveres af QIAGEN. QIAGEN er et registreret varemærke tilhørende Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland. SmartCycler er et registreret varemærke tilhørende Cepheid, 904 Caribbean Drive, Sunnyvale, CA, 94089, USA. Dette produkt sælges under licens fra Public Health Research Institute, Newark, New Jersey, USA og må kun bruges under PHRI-patentrettigheder til human in vitro-diagnose. Mx3000P og Mx3005P er registrerede varemærker tilhørende Stratagene. MxPro TM er et varemærke tilhørende Stratagene. Lab21,184 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 0GA, United Kingdom. Telephone: +44 (0) 1638 552 882 Facsimile: +44 (0) 1638 552 375 Email: productsupport@lab21.com Dansk 11