Produktion af biodiesel fra rapsolie ved en enzymatisk reaktion produceres fra rapsolie som består af 95% triglycerider (TG), samt diglycerider (DG), monoglycerider (MG) og frie fedtsyrer (FA). Under reaktionen brydes esterbindingen mellem FA og glycerol, og den sidstnævnte erstattes med enten metanol (MeOH) eller ethanol (EtOH) se reaktionsskemaet nedenfor. Reaktionen kræver en katalysator og da priser på enzymer er stærkt faldende, er lipaser blevet et attraktivt grønt alternativ til kemiske stoffer. Under det planlagte eksperiment udføres omdannelse af rapsolie til biodiesel ved hjælp af enzymet Thermomyces Lanuginosus Lipase (TLL) bundet til et uopløseligt bæremateriale. Der opsamles prøver løbende under reaktionen og deres sammensætning analyseres ved hjælp af tyndtlagskromatografi (TLC). Reaktionsskema 1
Materialer Rapsolie (triglycerider 1 mol/l): 50mL = 46g EtOH (96% eller 16,5M): 11mL Enzym (Thermomyces Lanuginosus Lipase, TLL, bundet til Lewatit): 2,5g TLC separationsblanding: 85% hexan + 15% ethylacetat TLC farvningsblanding: 1% KMnO4 opløst i 1M NaOH TLC plader: Polygram Sil G 0,1M NaOH Titreringsblanding indeholdende indikatoren pyranine Apparatur Magnetisk omrøringsmaskine med magnet Flaske: 50mL med låg Pipette: Gilson, 1mL Mikrosprøjte: Hamilton, 2μL Eppendorf rør: 0,5mL, 10 stk Laboratoriestativer, handsker, termometer, filterpapir, blyant, lineal, saks, to baljer, hårtørrer Fremgangsmåde 1. Forberedelse af reaktionen Hæld 50mL (46g) rapsolie i en 50mL flaske med magnet i. Sæt låg på flasken og placer den på omrøringsmaskinen, tænd for varmen og omrøring. Vent indtil temperaturen af olien stiger til 35 40 C. Tilsæt 2mL EtOH (96%) til olien og bland det hele energisk. Udtag en prøve på 0,5mL fra blandingen og opbevar den i et 0,5mL Eppendorf rør. Tilsæt 2,5 g af enzymet (TLL på et bæremateriale) til blandingen af olie og EtOH, og start stopur med det samme. Reaktionen fortsættes i 2 3 timer, mens analyseprøver opsamles og friske mængder af EtOH tilsættes med regelmæssige mellemrum (se tidsskemaet nedenunder). Flasken holdes lukket hele tiden og åbnes kun under opsamling af prøver (se punkt 2), ellers fordamper EtOH fra reaktionsblandingen. 2
2. Opsamling af prøver Flasken tages fra omrøringsmaskinen ved noterede tidsintervaller og sættes på bordet. Vent cirka 30 sekunder mens enzympartiklerne falder til bunds. Flasken åbnes, og en prøve på 0,5mL udteges fra toppen af reaktionsblanding (olie uden enzym). Prøven overføres i et 0,5mL Eppendorf rør. Herpå tilsættes 1mL EtOH til reaktionsblanding, flasken lukkes og sættes tilbage på omrøringsmaskinen. Opsamling af prøver følger skemaet: Tid 0 min 15 min 30 min 45 min 1 h 1 h 15' 1 h 30' 1 h 45' 2h 3 h prøve 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL + EtOH 2mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 3. Separation af prøver med TLC Alt arbejde med plader til tyndtlagskromatografi (TLC) foregår med handsker på, for at undgå pletter fra fingre. Læg filterpapir på bordet og tag en TLC plade på 20 20 cm. Marker 10 cm på hver side, tegn en linje og skær pladen i to dele 10 20 cm. Der bruges en halvdel per gruppe. Sæt små blyantsmærker lige ved bunden af pladen på den korte led med afstand på 18mm fra hinanden (tegn en streg eller skriv et nummer). Tag det første Eppendorf rør med prøven opsamlet ved tiden 0 min og sæt 0,6μL på pladen ved hjælp af en mikrosprøjte. Prøven sættes ca. 1cm fra den nederste kant af pladen over den tidsvarende blyantsmærke. Nålen på mikrosprøjten er skåret skråt, og for at sætte dråben rigtigt skal den vide streg på sprøjten vende opad. Gentag proceduren for alle 10 prøver. Hver gang en prøve udtages, skal sprøjten pumpes nogle gange op og ned i den nye prøve for at sikre at sprøjtens tidligere indhold er helt udskiftet med den aktuelle prøve. Når alle prøver er sat på pladen, vaskes sprøjten med EtOH ved at pumpe væsken op og ned. Udvikling/fremkaldelse: Tag pladen med prøverne og placer den i et kromatografisk kammer med separationsblanding (15% ethylacetat i hexan). Kromatografi forgår i stinkskabet i et lukket kammer i 15 20 minutter indtil hele pladen er våd. 3
Tørring: Tag handsker på, åben kammeret, tag pladen ud og tør den i stinkskabet (man kan bruge en hårtørrer). Nedsænkning: Læg den tørre plade skråt og meget langsomt ned i baljen med vandet (det tager cirka 2 minutter). Prøv at undgå hurtige ryk af vandet op af pladen. Lad pladen ligge i vandet i cirka 1 min. Farvning: Overfør den våde plade i farvningsblanding. Farvning tager cirka 20 sekunder under konstant bevægelse af væsken. Man skal ikke fortsætte farvning i længere tid, fordi det giver en øget baggrund. Vask: Efter 20 sekunder overføres pladen tilbage til baljen med vand og overskud af farve skyldes væk ved at bevæge enten pladen eller vandet lidt. Efter cirka 1 min hældes farvet vandet ud og frisk vand tilsættes (man skal ikke hælde vandet direkte på pladen fordi overfladen er skrøbelig!). Vandet skiftes 3 4 gange indtil alt overskydende farve er vasket ud. Bagefter lægges pladen på filterpapir og tørres (man kan bruge hårtørrer). Pladen indeholder nu brune pletter, hvor størrelsen af pletterne er proportional med mængden af stof. For at udregne mængden af stof i hver plet, kan man bruge måling af enten optisk densitet eller arealer af pletter ifølge den supplerende artikel. 4
4. Titrering af fedtsyrer Tag 0,5mL af titreringsblanding som indeholder indikatoren pyranine. Indikatoren er grøn, fordi opløsning er basisk. Tilsæt 50µL biodiesel fra prøven 3 timer til blandingen, som straks bliver farveløs på grund af fedtsyrerne i biodieselen. Fedtsyrerne kommer fra hydrolysen af biodiesel og glycerider, fordi der blev tilsat vand sammen med ethanol. Tilsæt 20µL 0,1 M NaOH til prøven og bland den energisk. Bagefter tilsættes 0,1 M NaOH med trin på 1µL (bland prøven hver gang). Noter volumen af NaOH undervejs. Man fortsætter titrering indtil blanding bliver grøn igen. En svag grønlig farve kan ses allerede ved 80% titrering. En stærk grøn farve kommer lidt senere og svarer til total titrering af fri fedtsyrer (FFA). Måling gentages 2 3 gange. Udregn den totale volumen af tilsat NaOH og bagefter den molære koncentration af FFA i prøven ved brug af ligningen: [FFA] Volumen_(prøven) = [NaOH] Volumen_(NaOH) Udregn koncentrationen af FFA (%, masse/masse) ved antagelse at alt FFA svarer til oleic syre (M w = 282 g/mol) og densitet af prøven svarer til 0,88g/mL for biodiesel eller 0,92 g/ml for olie (hvis olien blev titreret i stedet for biodiesel). 5
Kemiske og fysiske karakteristikker af reaktionsstoffer Molekylære masser af TG, DG, MG og FA (g/mol) svarer til de mest udbredte kombinationer af fedtsyrer bundet til glycerol. Densiteter af væsker (g/ml) ved ca. 35 C (MG er et fast stof ved stuetemperatur). Molære koncentrationer (M) svarer til 100% rene opløsninger af de tidsvarende stoffer. 6