therascreen EGFR RGQ PCR-kithåndbog

Juni 2013 therascreen EGFR RGQ PCR-kithåndbog Version 1 24 Til in vitro-diagnostisk brug Til brug med Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet 870111 QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, Storbritannien R4 1063321DA Sample & Assay Technologies

QIAGEN prøve- og analyseteknologier QIAGEN er den førende leverandør af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og påvisning af indholdet i enhver biologisk prøve. Vores avancerede højkvalitetsprodukter og -service garanterer succes fra prøve til resultat. QIAGEN sætter standarder inden for: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nukleinsyre- og proteinanalyser microrna-undersøgelser og RNAi Automatisering af prøve- og analyseteknologier Vores opgave er at gøre dig i stand til at opnå enestående succes og gennembrud. Se www.qiagen.com for at få yderligere oplysninger.

Indhold Tilsigtet anvendelse 5 Opsummering og forklaring 5 Procedureprincip 6 Medfølgende materialer 9 Kit-indhold 9 Nødvendige materialer, som ikke medfølger 10 Advarsler og sikkerhedsforanstaltninger 11 Sikkerhedsinformation 11 Generelle forholdsregler 11 Opbevaring og håndtering af reagenser 12 Håndtering og opbevaring af prøver 13 Procedure 13 Fastlæggelse af det tumorcelleniveau, der er nødvendigt for EGFR-analyse 13 DNA-isolation 14 Protokoller Prøvevurdering 14 Påvisning af EGFR-mutationer 17 Rotor-Gene Q EGFR-opsætning 20 Fortolkning af resultater 29 Dataanalyse af prøvevurdering 29 Dataanalyse af EGFR-mutation 33 Fejludbedringsvejledning 44 Kvalitetskontrol 45 Begrænsninger 45 Analysekarakteristika 46 Cut-off-værdier 46 Påvisningsgrænse (LOD) 46 Præcision 47 Reproducerbarhed 47 Effekt af input-dna-koncentration 47 Interfererende stoffer 48 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 3

Referencer 48 Symboler 49 Kontaktoplysninger 49 Appendiks: Oplysninger om mutationer 50 Bestillingsinformation 52 4 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Tilsigtet anvendelse therascreen EGFR RGQ PCR-kittet er en in vitro-diagnostisk test, som er beregnet til påvisning af 29 somatiske mutationer i det cancerrelaterede EGFRgen, og som kan give en kvalitativ vurdering af mutationens status. therascreen EGFR RGQ PCR-kittet skal anvendes af uddannet laboratoriepersonale i et professionelt laboratoriemiljø med DNA-prøver, der er ekstraheret fra formalinfikseret, paraffinindlejret NSCLC-væv (ikke-småcellet lungecancer). Resultaterne er beregnet til at hjælpe klinikeren med at identificere patienter med NSCLC, som kan have gavn af behandling med tyrosinkinasehæmmere. therascreen EGFR RGQ PCR-kittet er beregnet til in vitro-diagnostisk brug. Opsummering og forklaring therascreen EGFR RGQ PCR-kittet er et brugsklart kit til påvisning af 29 somatiske mutationer i det cancerrelaterede EGFR-gen ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) på Rotor-Gene Q-instrumentet. therascreen EGFR RGQ PCR-kittet muliggør påvisning af følgende mutationer mod en baggrund af vildtype-genomisk DNA ved hjælp af Scorpions - og ARMS -teknologier. 19 deletioner i exon 19 (påviser tilstedeværelsen af en af 19 deletioner, men skelner ikke mellem dem) T790M L858R L861Q G719X (påviser tilstedeværelse af G719S, G719A eller G719C, men skelner ikke mellem dem) S768I 3 indsætninger i exon 20 (påviser tilstedeværelsen af en af 3 indsætninger, men skelner ikke mellem dem) De anvendte metoder er meget selektive og, afhængigt af den samlede mængde af DNA, muliggør de påvisning af en lav procentdel af mutanter mod en baggrund af vildtype-genomisk DNA. Disse selektivitets- og påvisningsgrænser er overlegne i forhold til teknologier som farveterminatorsekventering. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 5

Procedureprincip therascreen EGFR RGQ PCR-kittet bruger to teknologier ARMS og Scorpions til at påvise mutationer i en real-time PCR-analyse. ARMS Allele- eller mutationsspecifik forstærkning opnås ved hjælp af ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Taq-DNA-polymerase (Taq) er effektiv til at skelne mellem en match og en fejlmatch i 3'-enden af en PCRprimer. Specifikke muterede sekvenser forstærkes selektivt, selv i prøver hvor størsteparten af sekvenserne ikke bærer mutationen. Når primeren er fuldstændigt matchet, fortsætter forstærkningen med fuld effektivitet. Når 3'- basen ikke er matchet, forekommer der kun baggrundsforstærkning på et lavt niveau. Scorpions Påvisning af forstærkning udføres med Scorpions. Scorpions er bifunktionelle molekyler, der indeholder en PCR-primer, som er kovalent kædet til en probe. Fluoroforen i proben reagerer med en quencher, der også er indeholdt i proben, hvilket reducerer fluorescensen. Når proben binder sig til amplikonen under PCR, bliver fluoroforen og quencheren adskilt. Det fører til en forøget fluorescens i reaktionsrøret. Kitformat Der leveres otte analyser med therascreen EGFR RGQ PCR-kittet: En kontrolanalyse (Ctrl) Syv mutationsanalyser Alle reaktionsblandinger indeholder reagenser til påvisning af mål, der er mærket med FAM, og en intern kontrolanalyse, der er mærket med HEX. Den interne kontrolanalyse kan påvise tilstedeværelsen af hæmmere, der kan medføre falsk-negative resultater. FAM-forstærkning kan udkonkurrere den interne kontrolforstærkning, og formålet med den interne kontrol er ganske enkelt at vise, at hvor der ikke er nogen FAM-forstærkning, er dette et sandt negativt resultat og ikke en mislykket PCR-reaktion. Procedure therascreen EGFR RGQ PCR-kittet indebærer en totrinsprocedure. I første trin udføres kontrolanalysen for at bedømme det samlede DNA i prøven. I andet trin udføres både mutations- og kontrolanalysen for at påvise eller afvise tilstedeværelsen af muteret DNA. 6 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Analyser: Kontrolanalyse Kontrolanalysen, der er mærket med FAM, anvendes til vurdering af det samlede DNA i prøven. Denne analyse forstærker exon 2-regionen i EGFRgenet. Primeren og proben er designet, så alle kendte EGFR-polymorfismer undgås. Vi anbefaler på det kraftigste at anvende den ekstra kontrolreaktionsblanding (Ctrl), der leveres i therascreen EGFR RGQ PCR-kittet, til vurdering af det samlede DNA i en prøve. Denne kontrolanalyse forstærker en region af exon 2 af EGFR-genet. Vi anbefaler kun at opsætte prøverne med kontrolanalysen med den positive kontrol (PC) for EGFR som positiv kontrol og nukleasefrit vand (H 2 O) som ikke-skabelon-kontrol. Bemærk: DNA-vurderingen skal baseres på PCR og kan afvige fra kvantificering baseret på absorbansmålinger. Der medfølger ekstra kontrolreaktionsblanding (Ctrl) for at muliggøre vurdering af kvaliteten og kvantiteten af DNA'et i prøverne inden analyse med therascreen EGFR RGQ PCR-kittet. Mutationsanalyser Hver mutationsanalyse indeholder en FAM-mærket Scorpion-probe og en ARMS-primer for at skelne mellem vildtype-dna og en bestemt mutant DNA. Kontroller Bemærk: Alle prøvekørsler skal indeholde følgende kontroller. Positiv kontrol Hver kørsel skal indeholde en positiv kontrol i rør 1 8. therascreen EGFR RGQ PCR-kittet indeholder positiv kontrol for EGFR (PC), der skal bruges som skabelon i den positive kontrolreaktion. De positive kontrolresultater vil blive vurderet for at sikre, at kittet fungerer korrekt inden for de erklærede acceptkriterier. Negativ kontrol Hver kørsel skal indeholde en negativ kontrol ("ikke-skabelon-kontrol", NTC) i rør 9 16. NTC'en består af nukleasefrit vand (H 2 O), som skal bruges som "skabelon" for ikke-skabelon-kontrollen. Ikke-skabelon-kontrollen bruges til at bedømme eventuel potentiel kontaminering under kørselsopsætningen og til at vurdere den interne kontrolreaktions ydelse. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 7

Bedømmelse af intern kontrolreaktion Hver reaktionsblanding indeholder en intern kontrol ud over målreaktionen. En fejl angiver enten, at der er hæmmere til stede, som kan medføre falsk-negative resultater, eller at der er opstået en operatøropsætningsfejl for det pågældende rør. Hvis den mislykkede interne kontrol skyldes PCR-hæmning, kan fortynding af prøven reducere hæmmernes effekt, men man skal være opmærksom på, at dette også vil fortynde DNA-målet. FAM-forstærkning kan udkonkurrere den interne kontrolforstærkning, så den IC C T (HEX)-værdi, der genereres, kan ligge uden for det specificerede område. FAM-resultaterne er alligevel gyldige for disse prøver. 8 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Medfølgende materialer Kit-indhold therascreen EGFR RGQ PCR-kit (24) Katalognr. 870111 Antal reaktioner 24 Rød Control Reaction Mix (Kontrolreaktionsblanding) Ctrl 2 x 600 µl Lilla Orange Lyserød Grøn Gul Grå Blå Brun Turkis T790M Reaction Mix (T790M-reaktionsblanding) Deletions Reaction Mix (Deletionsreaktionsblanding) L858R Reaction Mix (L858R-reaktionsblanding) L861Q Reaction Mix (L861Q-reaktionsblanding) G719X Reaction Mix (G719X-reaktionsblanding) S768I Reaction Mix (S768I-reaktionsblanding) Insertions Reaction Mix (Indsætningsreaktionsblanding) EGFR Positive Control (Positiv kontrol for EGFR) Taq DNA Polymerase (Taq-DNA-polymerase) T790M 600 µl Del 600 µl L858R 600 µl L861Q 600 µl G719X 600 µl S768I 600 µl Ins 600 µl PC 300 µl Taq 138 µl Hvid Nuclease-Free Water (Nukleasefrit vand) H 2 O 2 x 1,9 ml therascreen EGFR RGQ PCR Kit Handbook (engelsk) 1 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 9

Nødvendige materialer, som ikke medfølger Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade (safety data sheets, SDS'er), som kan fås hos produktets leverandør. DNA-isolationskit (se DNA-isolation, side 14) Xylen Ethanol (96-100 %)* 1,5 ml eller 2 ml mikrocentrifugeringsrør (til lysistrin) 1,5 ml mikrocentrifugeringsrør (til elueringstrin) (fås fra Brinkmann [Safe-Lock, katalognr. 022363204], Eppendorf [Safe-Lock, katalognr. 0030 120.086] eller Sarstedt [Sikkerhedshætte, katalognr. 72.690]) Dedikerede pipetter (justerbare) til prøveforberedelse Dedikerede pipetter (justerbare) til klargøring af PCR-masterblanding Dedikerede pipetter (justerbare) til dispensering af DNA-skabelon* DNAse-, RNAse- og DNA-fri pipettespidser med filtre (for at undgå krydskontaminering anbefaler vi pipettespidser med aerosolbarriere) Thermomixer, opvarmet orbital inkubator, varmeblok eller vandbad, der kan inkubere ved 90 C Bordcentrifuge med rotor til 2 ml reaktionsrør Vortex Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrument med fluorescenskanaler til Cycling Green og Cycling Yellow (påvisning af hhv. FAM og HEX) Rotor-Gene Q-software version 2.0.2 eller højere Båndrør med hætter, 0,1 ml, til brug med rotor med 72 brønde (katalognr. 981103 eller 981106) DNAse-, RNAse- og DNA-fri mikrocentrifugeringsrør til klargøring af masterblandinger * Der må ikke bruges denatureret alkohol, som indeholder andre stoffer som f.eks. metanol eller methylethylketon. Dette er ikke en fuldstændig liste over leverandører. Kontrollér, at instrumenterne er kontrolleret og kalibreret i henhold til producentens anbefalinger. Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrument, om nødvendigt. Også kendt som Rotor-Gene Q MDx i nogle lande. 10 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Isætningsblok 72 x 0,1 ml rør, aluminiumblok til manuel opsætning af reaktioner med enkeltkanalspipette (QIAGEN, katalognr. 9018901) Advarsler og sikkerhedsforanstaltninger Til in vitro-diagnostisk brug Sikkerhedsinformation Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade (safety data sheets, SDS'er). Disse er tilgængelige online i et praktisk og kompakt PDF-format på adressen www.qiagen.com/safety, hvor det er muligt at finde, få vist og udskrive SDS'et for hvert QIAGEN-kit og hver kitkomponent. 24-timers nødtelefon Det er hjælp tilgængelig 24 timer i døgnet ved kemiske nødstilfælde eller ulykker på: CHEMTREC USA og Canada Tlf.: 1-800-424-9300 Uden for USA og Canada Tlf.: +1-703-527-3887 (modtager betaler accepteres) Generelle forholdsregler Brugeren skal altid være opmærksom på følgende. Brug DNAse-, RNAse- og DNA-fri pipettespidser med filtre, og kontrollér, at pipetterne er kalibreret i henhold til producentens instruktioner. Positive materialer (prøver og positive kontroller) skal opbevares og ekstraheres separat fra alle andre reagenser og tilsættes reaktionsblandingen på et separat sted. Alle komponenter skal omhyggeligt optøs til stuetemperatur (15 25 C), inden analysen startes. Efter optøning skal komponenterne blandes ved at vende hvert rør 10 gange og centrifugeres kortvarigt. Bemærk: Udvis ekstrem forsigtighed for at forhindre forurening af PCR'er med syntetisk kontrolmateriale. Vi anbefaler at bruge separate, dedikerede pipetter til klargøring af reaktionsblandinger og tilføjelse af DNA-skabelon. Klargøring og dispensering af reaktionsblandinger skal udføres i et område, som er adskilt fra skabelontilføjelsen. Rotor-Gene Q-rørene må ikke åbnes, når PCR-kørslen therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 11

er afsluttet. Dette er for at forhindre kontaminering af laboratoriet med produkter efter PCR. Bemærk: Reagenserne er godkendt til manuel opsætning. Hvis der bruges en automatiseret metode, kan det reducere antallet af mulige reaktioner, da reagenset skal udfylde "dødvolumener" på disse instrumenter. Bemærk: Alle reagenser i therascreen EGFR RGQ PCR-kittet er formuleret specifikt til brug sammen med de angivne test. Alle reagenser, der leveres med therascreen EGFR RGQ PCR-kittet, er udelukkende beregnet til brug sammen med de øvrige reagenser i det samme therascreen EGFR RGQ PCR-kit. Hvis der skal opnås optimal ydelse, må reagenserne i kittet ikke udskiftes. Bemærk: Brug kun den Taq-DNA-polymerase (Taq), der findes i kittet. Den må ikke udskiftes med Taq-DNA-polymerase fra andre kit af den samme eller en anden type eller med Taq-DNA-polymerase fra en anden leverandør. Bemærk: Reagenserne til therascreen EGFR RGQ PCR-kittet er fortyndet optimalt. Vi anbefaler ikke at fortynde reagenserne yderligere, da det kan resultere i tab af ydelse. Vi anbefaler ikke, at der bruges reaktionsvolumener på mindre end 25 µl, da det øger risikoen for falsk-negative resultater. Opbevaring og håndtering af reagenser therascreen EGFR RGQ PCR-kittet forsendes på tøris og skal stadig være frosset ved modtagelse. Hvis therascreen EGFR RGQ PCR-kittet ikke er frosset ved modtagelse, hvis den ydre emballage har været åbnet under transporten, eller hvis forsendelsen ikke indeholder en følgeseddel, denne håndbog eller reagenserne, skal der rettes henvendelse til en af QIAGENs tekniske serviceafdelinger eller lokale forhandlere (se bagsiden, eller besøg www.qiagen.com). therascreen EGFR RGQ PCR-kittet skal straks efter modtagelse opbevares ved 15 til 25 C i en fryser med konstant temperatur og beskyttes mod lys. Ved opbevaring i den oprindelige emballage under de anbefalede opbevaringsbetingelser er kittet stabilt indtil den udløbsdato, der er angivet på etiketten. Undgå gentagen indfrysning og optøning. Vi anbefaler et maksimum på 7 indfrysnings- og optøningscyklusser. Bemærk: For at sikre optimal aktivitet og ydelse bør Scorpions (som det er tilfældet med alle fluorescensmærkede molekyler) beskyttes mod lys for at undgå fotoblegning. Bemærk: Prøver bør være samlede i batch for at opnå den optimale anvendelse af reagenser i therascreen EGFR RGQ PCR-kittet. Hvis prøver testes individuelt, bruger det flere reagenser og reducerer antallet af prøver, som kan testes med therascreen EGFR RGQ PCR-kittet. 12 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Håndtering og opbevaring af prøver Bemærk: Alle prøver skal behandles som potentielt infektiøst materiale. Prøvematerialet skal være humant genomisk DNA ekstraheret fra formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) tumorprøver af ikke-småcellet lungecancer. Prøverne skal transporteres i henhold til standardmetoder inden for patologien for at sikre prøvernes kvalitet. Tumorprøver er uhomogene, og data fra én tumorprøve vil muligvis ikke være samstemmende med data fra andre præparater fra den samme tumor. Tumorprøver kan også indeholde ikke-tumorvæv. DNA fra ikke-tumorvæv forventes ikke at indeholde de EGFR-mutationer, der påvises af therascreen EGFR RGQ PCR-kittet. Procedure Fastlæggelse af det tumorcelleniveau, der er nødvendigt for EGFR-analyse Det væv, der bruges til EGFR-analyse, er formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) prøver af ikke-småcellet lungecancer (NSCLC). DNA, der er ekstraheret fra celler i dette tumorvæv, kan være vildtype mht. EGFR-mutationer eller kan bære en eller flere mutationer. Det FFPE NSCLC-væv, der bruges til ekstraheringen, kan også indeholde normalt, ikke-tumorvæv, som vil være vildtype mht. EGFR-mutationer. Vildtype- DNA'et fra dette væv kan fortynde mutant-dna'et til et niveau, hvor kittet ikke længere kan påvise det. Det anbefales imidlertid, at selv prøver med lave niveauer af tumor testes, da der er mulighed for at påvise højniveau-mutationer og foretage en beslutning om behandling for patienten. Fortsæt på følgende måde for at øge chancerne for at påvise mutationer. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farver mindst ét objektglas fra hver patientprøve. Sørg for, at en patolog vurderer det farvede objektglas for tilstedeværelsen af tumor. Hvis det er muligt, skal patologen vurdere flere objektglas fra hele FFPEblokken. Alle prøver med tumor til stede kan testes med therascreen EGFR RGQ PCR-kittet. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 13

DNA-isolation DNA-isolation skal udføres ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet. DNA-oprensningen skal udføres i henhold til instruktionerne i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook med følgende ændringer. Indsaml FFPE-præparater på objektglas. Skrab overskydende paraffin bort rundt om vævsprøverne med en ny, steril skalpel. Skrab vævspræparatet ind i mikrocentrifugeringsrørene med en ny skalpel for hver prøve, der ekstraheres. Udfør proteinase K-fordøjelse i 1 time. Det oprensede genomiske DNA skal elueres i 200 µl ATE-buffer (findes i QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet). Opbevar det oprensede genomiske DNA ved 15 til 30. Hvor der er oplysninger til rådighed, skal objektglas i nærheden af det H&E-farvede objektglas med mest tumorindhold bruges. Bemærk: Alle analyser i therascreen EGFR RGQ PCR-kittet genererer korte PCR-produkter. therascreen EGFR RGQ PCR-kittet fungerer imidlertid ikke med meget fragmenteret DNA. Protokol: Prøvevurdering Denne protokol bruges til vurdering af det samlede DNA, der kan forstærkes, i prøver. Vigtige anvisninger før start Gennemlæs "Generelle forholdsregler", side 11, før proceduren påbegyndes. Sørg for at være fortrolig med Rotor-Gene Q, før protokollen påbegyndes. Se brugerhåndbogen til instrumentet. Taq-DNA-polymerasen (Taq) eller blandinger, der indeholder Taq-DNApolymerase (Taq), må ikke vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. Pipettér Taq-DNA-polymerasen (Taq) ved at placere pipettens spids lige under væskens overflade, så spidsen ikke dækkes af overskydende enzym. 14 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Ting, der skal gøres før start Før hver brug skal alle reagenser optøs helt ved stuetemperatur (15 25 C), blandes ved at vende dem 10 gange og centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. Lad Taq-DNA-polymerasen (Taq) få stuetemperatur (15 25 C) inden hver brug. Centrifugér røret kortvarigt for at samle enzymet i bunden af røret. Procedure 1. Optø kontrolreaktionsblandingen (Ctrl), nukleasefrit vand til ikkeskabelon-kontrol (NTC) og positiv kontrol for EGFR (PC) ved stuetemperatur (15 25 C). Når reagenserne er optøet, skal de blandes ved at vende hvert rør 10 gange, så lokale saltkoncentrationer undgås, og derefter centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. 2. Forbered tilstrækkelige mængder masterblanding til DNA-prøverne, en positiv kontrolreaktion og en ikke-skabelon-kontrolreaktion i henhold til de volumener, der er anført i Tabel 1. Inkluder reagenser til 1 ekstra prøve for at sikre tilstrækkelig ældning til PCRopsætningen. Masterblandingen indeholder alle de komponenter, der er nødvendige ved PCR, undtagen prøven. Tabel 1. Forberedelse af kontrolmasterblanding* Komponent Kontrolreaktionsblanding (Ctrl) Volumen/reaktion (µl) 19,5 Taq-DNA-polymerase (Taq) 0,5 Volumen i alt 20,0 * Når masterblandingen forberedes, skal der forberedes nok til en ekstra prøve. 3. Bland masterblandingen grundigt ved at pipettere forsigtigt op og ned 10 gange. Tilsæt straks 20 µl masterblanding til PCR-båndrør (medfølger ikke). Bemærk: Med henblik på prøvebedømmelse skal der tilsættes kontrolmasterblanding til en positiv kontrolbrønd, en negativ kontrolbrønd og en brønd for hver prøve. 4. Tilsæt straks 5 µl prøve med nukleasefrit vand (H 2 O) til ikkeskabelon-kontrolrøret (PCR-rør nummer 9), og sæt hætte på røret. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 15

Tilsæt 5 µl prøve-dna til prøverørene, og sæt hætte på rørene. Tilsæt 5 µl positiv kontrol for EGFR (PC) til røret med positiv kontrol (PCR-rør 1), og sæt hætte på røret. 5. Placér PCR-båndrørene på de korrekte positioner i rotoren, og kontrollér visuelt, at samtlige rør indeholder den samme volumen. Bemærk: Sørg for, at båndene på rørene ikke vendes om, når de overføres til rotoren. 6. Hvis rotoren ikke er fuld, skal du fylde de tilbageværende pladser med tomme rør med hætter på. 7. Placér straks rotoren med 72 brønde i Rotor-Gene Q 5plex HRMinstrumentet. Kontrollér, at låseringen (tilbehør til Rotor-Gene Q- instrumentet) er placeret oven på rotoren, for at sikre rørene under kørslen. 8. Der henvises til Rotor-Gene Q-instrumentopsætningen (se "Protokol: Rotor-Gene Q EGFR-opsætning", side 20) for at oprette temperaturprofilen, og start kørslen. Tabel 2. Cyklusparametre Cyklusser Temperatur Tid Datahentning 1 95 ºC 15 minutter Ingen 40 95 ºC 60 ºC 30 sekunder 60 sekunder Ingen Grøn og gul 9. Analysér dataene i henhold til "Dataanalyse af prøvevurdering", side 29, når kørslen er afsluttet. 16 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Protokol: Påvisning af EGFR-mutationer Denne protokol er til påvisning af EGFR-mutationer. Når en prøve har gennemført prøvevurderingen, kan den testes ved hjælp af EGFRmutationsanalyserne. Vigtige anvisninger før start Gennemlæs "Generelle forholdsregler", side 11, før proceduren påbegyndes. Sørg for at være fortrolig med Rotor-Gene Q, før protokollen påbegyndes. Se brugerhåndbogen til instrumentet. Taq-DNA-polymerasen (Taq) eller blandinger, der indeholder Taq-DNApolymerase, må ikke vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. For at udnytte therascreen EGFR RGQ PCR-kittet effektivt skal prøverne grupperes i batch af 7, så rotoren med 72 brønde fyldes. Mindre batchstørrelser betyder, at der kan testes færre prøver med therascreen EGFR RGQ PCR-kittet. Pipettér Taq ved at placere pipettens spids lige under væskens overflade, så spidsen ikke dækkes af overskydende enzym. For hver DNA-prøve skal kontrol- og mutationsanalyser analyseres i samme PCR-kørsel for at undgå variationer mellem kørslerne. Ting, der skal gøres før start Før hver brug skal alle reagenser optøs helt ved stuetemperatur (15 25 C), blandes ved at vende dem 10 gange og centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. Kontrollér, at Taq har stuetemperatur (15 25 C) inden hver brug. Centrifugér røret kortvarigt for at samle enzymet i bunden af røret. Procedure 1. Optø reaktionsblandingerne (Ctrl), nukleasefrit vand til ikkeskabelon-kontrol (NTC) og positiv kontrol for EGFR (PC) ved stuetemperatur (15 25 C). Når reagenserne er optøet, skal de blandes ved, at man vender hvert rør 10 gange, så lokale saltkoncentrationer undgås, og derefter centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 17

2. Forbered tilstrækkelige mængder masterblanding til DNA-prøverne, en positiv kontrolreaktion og en ikke-skabelon-kontrolreaktion i henhold til de volumener, der er anført i Tabel 3. Inkluder reagenser til 1 ekstra prøve for at sikre tilstrækkelig ældning til PCRopsætningen. Masterblandingen indeholder alle de komponenter, der er nødvendige ved PCR, undtagen prøven. Tabel 3. Forberedelse af masterblandinger* Komponent Volumen/reaktion (µl) Reaktionsblanding 19,5 Taq-DNA-polymerase (Taq) 0,5 Volumen i alt 20,0 * Når masterblandingen forberedes, skal der forberedes nok til en ekstra prøve. 3. Bland hver masterblanding grundigt ved at pipettere forsigtigt op og ned 10 gange. Tilsæt straks 20 µl masterblanding til hvert PCRbåndrør (medfølger ikke). 4. Tilsæt straks 5 µl nukleasefrit vand (H 2 O) til ikke-skabelon-kontrol (NTC) til ikke-skabelon-kontrol-pcr-båndrørene (PCR-rør 9 16), og sæt hætte på rørene. Tilsæt 5 µl af hver prøve til prøverørene (PCRrør 17 72), og sæt hætte på rørene. Tilsæt 5 µl positiv kontrol for EGFR (PC) til røret med positiv kontrol (PCR-rør 1 8). Hver DNAprøve skal testes med både kontrolanalysen og alle mutationsanalyser. Layoutet er vist i Tabel 4. 18 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Tabel 4. Layout af kontrol- og mutationsanalyser Kontroller Prøvenummer Analyse PC NTC 1 2 3 4 5 6 7 Ctrl 1 9 17 25 33 41 49 57 65 T790M 2 10 18 26 34 42 50 58 66 Deletioner 3 11 19 27 35 43 51 59 67 L858R 4 12 20 28 36 44 52 60 68 L861Q 5 13 21 29 37 45 53 61 69 G719X 6 14 22 30 38 46 54 62 70 S768I 7 15 23 31 39 47 55 63 71 Indsætninger 8 16 24 32 40 48 56 64 72 5. Placér PCR-båndrørene på de korrekte positioner i rotoren, og kontrollér visuelt, at samtlige rør indeholder den samme volumen. Bemærk: Sørg for, at båndene på rørene ikke vendes om, når de overføres til rotoren. 6. Hvis rotoren ikke er fuld, skal du fylde de tilbageværende pladser med tomme rør med hætter på. 7. Placér straks rotoren i Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrumentet. Kontrollér, at låseringen (tilbehør til Rotor-Gene Q-instrumentet) er placeret oven på rotoren, for at sikre rørene under kørslen. 8. Der henvises til Rotor-Gene Q-instrumentopsætningen (se "Protokol: Rotor-Gene Q EGFR-opsætning", side 20) for at oprette temperaturprofilen, og start kørslen. Tabel 5. Cyklusparametre Cyklus ser Temperatur Tid Datahentning 1 95 ºC 15 minutter Ingen 40 95 ºC 60 ºC 30 sekunder 60 sekunder Ingen Grøn og gul 9. Analysér dataene i henhold til "Dataanalyse af EGFR-mutation", side 33, når kørslen er afsluttet. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 19

Protokol: Rotor-Gene Q EGFR-opsætning Der henvises til denne protokol i "Protokol: Prøvevurdering", side 14 og "Protokol: Påvisning af EGFR-mutationer", side 17. Procedure 1. Opret en temperaturprofil i henhold til nedenstående trin. Indstilling af generelle analyseparametre Figur 1 3 Første aktivering af hot start-enzymet Figur 4 Forstærkning af DNA'et Figur 5 7 Justering af fluorescenskanaler Figur 8 12 Start af kørsel Figur 13 Cyklusparametrene er som følger. Tabel 6. Cyklusparametre Cyklusser Temperatur Tid Datahentning 1 95 ºC 15 minutter Ingen 40 95 ºC 60 ºC 30 sekunder 60 sekunder Ingen Grøn og gul Alle anvisninger henviser til Rotor-Gene Q-softwareversion 2.0.2. Yderligere information om programmering af Rotor-Gene-instrumenter findes i brugerhåndbogen til instrumentet. På illustrationerne er indstillingerne fremhævet med sorte kasser. 2. Dobbeltklik på ikonet for Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2 på skrivebordet på den pc, der er tilsluttet Rotor-Gene Q 5plex HRMinstrumentet. Vælg fanen "Advanced" (Avanceret) i dialogboksen "New Run" (Ny kørsel), der åbnes. 3. Opret en ny skabelon ved at vælge "Empty Run" (Tom kørsel), og klik derefter på "New" (Ny) for at starte "New Run Wizard" (guiden Ny kørsel). 20 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

4. Vælg 72-Well Rotor (Rotor med 72 brønde) som rotortype. Kontrollér, at låseringen er påsat, og markér afkrydsningsfeltet "Locking Ring Attached" (Låsering påsat). Klik på "Next" (Næste) (Figur 1). 1 2 3 Figur 1. Dialogboksen "New Run Wizard" (guiden Ny kørsel). 5. Skriv navnet på operatøren. Tilføj eventuelle bemærkninger, og angiv reaktionsvolumen som 25. Kontrollér, at der står "1, 2, 3 " i "Sample Layout" (Prøvelayout). Klik på "Next" (Næste) (Figur 2). 1 2 3 Figur 2. Indstilling af generelle analyseparametre. 4 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 21

6. Klik på knappen "Edit Profile" (Rediger profil) i den næste dialogboks i "New Run Wizard" (guiden Ny kørsel) (Figur 3), og programmér temperaturprofilen i henhold til informationen i de følgende trin. 1 Figur 3. Redigering af profilen. 7. Klik på knappen "Insert after" (Indsæt efter), og vælg New Hold at Temperature (Ny holdetemperatur) (Figur 4). 1 2 Figur 4. Første inkuberingstrin ved 95 C. 22 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

8. Skift "Hold Temperature" (Holdetemperatur) til 95 C og "Hold Time" (Holdetid) til 15 minutter. Klik på knappen "Insert after" (Indsæt efter), og vælg derefter New Cycling (Ny cyklus) (Figur 5). 1 2 3 Figur 5. Første inkuberingstrin ved 95 C. 9. Skift antallet af cyklusser til 40. Vælg det første trin, og indstil til 95 C for 30 secs (95 C i 30 sekunder) (Figur 6). 1 3 2 Figur 6. Cyklustrin ved 95 C. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 23

10. Markér det andet trin, og indstil til 60 C for 60 secs (60 C i 60 sekunder). Muliggør datahentning i dette trin ved at vælge knappen "Not Acquiring" (Henter ikke) (Figur 7). 2 1 Figur 7. Cyklustrin ved 60 C. 11. Angiv kanalerne Green (Grøn) og Yellow (Gul) som hentende kanaler ved at vælge knappen ">" for at overføre dem fra listen "Available Channels" (Tilgængelige kanaler). Klik på "OK" (Figur 8). 1 2 Figur 8. Hentning ved cyklustrin på 60 C. 24 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

12. Markér det tredje trin, og slet ved at klikke på knappen "-". Klik på "OK" (Figur 9). 2 1 Figur 9. Fjernelse af udvidelsestrin. 13. Klik på knappen "Gain Optimisation" (Optimering af forstærkning) i den næste dialogboks (Figur 10). 3 1 Figur 10. Optimering af forstærkning. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 25

14. Klik på knappen "Optimise Acquiring" (Optimer hentning). Kanalindstillingerne vises så for hver enkelt kanal. Acceptér standardværdierne ved at klikke på "OK" for begge kanaler (Figur 11). 1 2 Figur 11. Optimering af automatisk forstærkning for den grønne kanal. 26 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

15. Markér afkrydsningsfeltet "Perform Optimisation before 1st Acquisition" (Udfør optimering inden første hentning), og klik derefter på knappen "Close" (Luk) for at vende tilbage til guiden (Figur 12). 1 2 Figur 12. Valg af grønne og gule kanaler. 16. Klik på "Next" (Næste) for at gemme skabelonen på et passende sted ved at vælge "Save Template" (Gem skabelon). therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 27

17. Gennemgå oversigten, og klik på "Start Run" (Start kørsel) for at gemme kørselsfilen og starte kørslen (Figur 13). 1 Figur 13. Start af kørsel. 18. Når kørslen er startet, åbnes der et nyt vindue, hvor du enten kan angive prøvenavne nu eller klikke på "Finish" (Udfør) og angive dem senere ved at vælge knappen "Sample" (Prøve) under kørslen, eller når kørslen er færdig. 19. Analysér dataene i henhold til den korrekte protokol, når kørslen er afsluttet. Se "Dataanalyse af prøvevurdering", side 29 for at få oplysninger om prøvevurdering. Se "Dataanalyse af EGFR-mutation", side 33 for at få oplysninger om mutationsanalyse. 28 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Fortolkning af resultater C T -analysemetode Real-time-analyser med Scorpions anvender det antal PCR-cyklusser, der er nødvendigt for at påvise et fluorescerende signal over et baggrundssignal som mål for, hvor mange målmolekyler der er til stede ved starten af reaktionen. Det punkt, hvor signalet påvises over baggrundsfluorescensen, kaldes cyklustærskelværdien (C T ). Prøvens C T -værdier beregnes som forskellen mellem mutationsanalysens C T og kontrolanalysens C T fra den samme prøve. C T = mutation C T kontrol C T Bemærk: Prøverne klassificeres som mutationspositive, hvis de giver en C T, som er lavere end cut-off-værdien for C T for den pågældende analyse. Over denne værdi indeholder prøven mindre end den mutationsprocentdel, kittet kan påvise (ud over analysens grænser), eller er mutationsnegativ. Bemærk: Mutations-C T -værdier på 40 eller derover klassificeres som negative eller ud over kittets grænser. Ved brug af ARMS-primere kan der forekomme en vis ineffektiv priming, hvilket giver en meget sen baggrunds-c T fra DNA, der ikke indeholder en mutation. Alle C T -værdier, der kalkuleres fra baggrundsforstærkning, vil være højere end cut-off-værdierne for C T, og prøven vil blive klassificeret som mutationsnegativ. Dataanalyse af prøvevurdering Analysér dataene i henhold til følgende procedure, når kørslen er afsluttet. Softwareanalyseindstillinger 1. Åbn den relevante fil med Rotor-Gene Q-softwareversionen (2.0.2) og derover. 2. Kontrollér, at prøverne er mærket. 3. Klik på "Options" (Indstillinger), og gå til Crop start cycles (Beskær startcyklusser) på siden med ubehandlede data for hver enkelt detektor/kanal. Skriv 15 på siden med "Remove data before cycle" (Fjern data inden cyklus), og klik på "OK". 4. Klik på "Analyse" (Analysér). Klik på "Cycling A (from 15), Yellow" (Cyklus med A (fra 15), gul) på analysesiden for at kontrollere HEXkanalen. 5. Kontrollér, at "dynamic tube" (dynamisk rør) er fremhævet. Klik på "Slope correct" (Hældningskorrigering) og "Linear scale" (Lineær skala). therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 29

6. Indstil tærskelværdien til 0,02, og kontrollér HEX C T -værdierne. 7. Klik på "Cycling A (from 15), Green" (Cyklus med A (fra 15), grøn) på analysesiden for at kontrollere FAM-kanalen. 8. Det dynamiske rør fremhæves. Klik på "Slope correct" (Hældningskorrigering) og "Linear scale" (Lineær skala). 9. Indstil tærskelværdien til 0,075, og kontrollér FAM C T -værdierne. Analysér dataene som følger, når kørslen er afsluttet. Negativ kontrol: For at sikre, at der ikke er nogen skabelonkontaminering, må NTC'en ikke generere en C T -værdi i den grønne (FAM) kanal, som er under 40. Se "Bemærkninger til datafortolkning" på side 39 for at få vigtige oplysninger om analyse af ikke-skabelon-kontrol-plot (NTC). For at sikre at kørslen er opsat korrekt, skal NTC'en vise forstærkning af 31 37 i den gule (HEX) kanal. Hvis der er positiv forstærkning i den grønne kanal og/eller forstærkning uden for området 31 37 i det gule signal, skal prøveresultatet kasseres. Positiv kontrol: Den positive kontrol (PC) for EGFR skal give en C T -værdi for kontrolanalysen (FAM-kanal) på 26,26 30,95. En kørsel med en C T - værdi uden for dette område tyder på, at der er et problem med analyseopsætningen, og kørslen skal betegnes som mislykket. Hvis den positive kontrolanalyses C T er 26,26 30,95 (exon 2, FAM), men den interne kontrols C T (HEX) er uden for området 31 37, skal du fortsætte med analysen. Bemærk: Prøvedata må ikke anvendes, hvis en af disse to kørselskontroller er mislykket. Forudsat at begge kørselskontroller er gyldige, skal hver prøves C T -værdi ligge inden for området 23 30,69 i den grønne (FAM) kanal. Hvis prøven ligger uden for området, gives følgende vejledning. Prøvekontrolanalyse med C T på <23: Prøver med en kontrol-c T på <23 overbelaster mutationsanalyserne og skal fortyndes. For at påvise hver enkelt mutation på lavt niveau skal de overkoncentrerede prøver fortyndes, så de er i ovenstående interval med udgangspunkt i, at C T stiger med 1, når der fortyndes 1:1. Prøvekontrolanalyse med C T på 30,69 37: Fortolkes med forsigtighed, da meget lave mutationsniveauer måske ikke påvises. Prøvekontrolanalyse med C T på 37 40: Fortolkes med forsigtighed, da kun meget høje mutationsniveauer vil blive påvist. Prøvekontrolanalyse med C T på >40: Prøven indeholder ikke tilstrækkeligt DNA til at muliggøre analyse. 30 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Bemærk: Hvis en prøve ikke genererer en C T (dvs. C T >40), kan det skyldes tilstedeværelsen af en hæmmer, en fejl i analyseopsætningen, eller at der ikke er noget EGFR DNA, der kan forstærkes. Intern kontrol-c T -værdi på 31 37: Der er ikke noget EGFR DNA, der kan forstærkes. Intern kontrol-c T -værdi ligger ikke inden for området 31 37: Dette kan tyde på, at der er en fejl i analyseopsætningen, eller det kan tyde på tilstedeværelsen af en hæmmer. Det er muligt at reducere hæmmerens effekt ved at fortynde prøven, selvom dette også fortynder DNA'et. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 31

FAM C T -værdi for negativ kontrol FAM C T- prøvekontrolværdi Er FAM C T <40? JA Kontrollér datafortolkningerne på side 29 for eventuelle dæmpende kørselsforhold. Er kontrolanalysens FAM C T i intervallet 23,00 til 30,69? JA Prøven er optimal til mutationsanalyse NEJ Dæmpende kørselsforhold Ingen dæmpninger NEJ Er HEX C T i intervallet 31 til 37? NEJ MISLYKKET KØRSEL Er FAM C T <23,00 JA Prøven skal fortyndes JA NEJ Negativ kontrol gennemført Er FAM C T i intervallet 30,69-37,00 JA Der skal udvises forsigtighed ved fortolkning af resultaterne NEJ FAM C T -værdi for positiv kontrol Er FAM C T i intervallet 37,00-40,00 JA Der skal udvises forsigtighed ved fortolkning af resultaterne NEJ Er FAM C Ti intervallet 26,26-30,95? NEJ MISLYKKET KØRSEL Prøven indeholder muligvis ikke DNA, der kan forstærkes, eller den kan indeholde en hæmmer. JA Positiv kontrol gennemført Fortsæt til prøveanalyse Figur 14. Procedure for prøvevurderingsanalyse. 32 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Dataanalyse af EGFR-mutation Analysér dataene i henhold til følgende procedure, når kørslen er afsluttet. Softwareanalyseindstillinger 1. Åbn den relevante fil med Rotor-Gene Q-softwareversionen (2.0.2) og derover. 2. Kontrollér, at prøverne er mærket. 3. Klik på "Options" (Indstillinger), og gå til Crop start cycles (Beskær startcyklusser) på siden med ubehandlede data for hver enkelt detektor/kanal. Skriv 15 på siden med "Remove data before cycle" (Fjern data inden cyklus), og klik på "OK". 4. Klik på "Analyse" (Analysér). Klik på "Cycling A (from 15), Yellow" (Cyklus med A (fra 15), gul) på analysesiden for at se HEX-kanalen. 5. Kontrollér, at "dynamic tube" (dynamisk rør) er fremhævet. Klik på "Slope correct" (Hældningskorrigering) og "Linear scale" (Lineær skala). 6. Indstil tærskelværdien til 0,02, og kontrollér HEX C T -værdierne. 7. Klik på "Cycling A (from 15), Green" (Cyklus med A (fra 15), grøn) på analysesiden for at kontrollere FAM-kanalen. 8. Kontrollér, at "dynamic tube" (dynamisk rør) er fremhævet. Klik på "Slope correct" (Hældningskorrigering) og "Linear scale" (Lineær skala). 9. Indstil tærskelværdien til 0,075, og kontrollér FAM C T -værdierne. Kørselskontrolanalyse: Se organisationsdiagrammet "Kørselskontrolanalyse" i figur Figur 15. Negativ kontrol: For at sikre, at der ikke er nogen skabelonkontaminering, må NTC'en ikke generere en C T -værdi i den grønne (FAM) kanal, som er under 40. Se "Bemærkninger til datafortolkning" på side 39 for at få vigtige oplysninger om analyse af ikke-skabelon-kontrol-plot (NTC). For at sikre at kørslen er opsat korrekt, skal NTC'en vise forstærkning af C T 31 37 i den gule (HEX) kanal. Hvis der er positiv forstærkning i den grønne kanal og/eller forstærkning uden for området 31 37 i det gule signal, skal prøveresultatet kasseres. Positiv kontrol: Den positive kontrol (PC) for EGFR skal give en C T -værdi for kontrolanalysen på 26,26 30,95 i den grønne kanal. En kørsel med en C T -værdi uden for dette område tyder på, at der er et problem med analyseopsætningen, og kørslen skal betegnes som mislykket. Hvis den positive kontrolanalyses C T er 26,26 30,95 (exon 2, FAM), men den therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 33

interne kontrols C T (HEX) er uden for området 31 37, skal du fortsætte med analysen. C T -værdien beregnes som følger for alle mutationsanalyser, idet det skal sikres, at C T -værdierne for mutation og kontrol er fra den positive kontrol. C T = mutation C T kontrol C T C T -værdierne for den positive kontrol (PC) for EGFR bør ligge inden for værdierne i Tabel 7. Tabel 7. Forventede C T -værdier for positiv kontrol* Analyse T790M 2,88 til 3,01 Deletioner 6,71 til 4,16 L858R 2,41 til 0,90 L861Q 4,61 til 1,48 G719X 2,89 til 1,03 S768I 3,37 til 2,31 Indsætninger 2,93 til 1,28 * Rotor-Gene Q-software (2.0.2) C T -værdi for positiv kontrol Bemærk: Prøvedata må ikke anvendes, hvis den negative eller den positive kørselskontrol er mislykket. 34 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

FAM C T -værdi for negativ kontrol Er FAM C T <40? JA Kontrollér datafortolkningerne på side 33 for eventuelle dæmpende kørselsforhold. JA Dæmpende kørselsforhold Ingen dæmpninger Negativ kontrol gennemført JA Er HEX C T i intervallet 31,00 til 37,00? NEJ MISLYKKET KØRSEL FAM CT-værdi/ΔC T - værdi for positiv kontrol Er FAM C T- kontrolrøret i intervallet 26,26-30,95? JA Er T790M FAM ΔC T-kontrolrøret i intervallet -2,88 til 3,01? JA Er deletions-fam ΔC T-kontrolrøret i intervallet -6,71 til 4,16? NEJ NEJ NEJ MISLYKKET KØRSEL MISLYKKET KØRSEL MISLYKKET KØRSEL JA NEJ NEJ NEJ NEJ Er L858R FAM ΔC T-kontrolrøret i intervallet -2,41 til 0,90? JA Er L861Q FAM ΔC T-kontrolrøret i intervallet -4,61 til 1,48? JA Er G719X FAM ΔC T-kontrolrøret i intervallet -2,89 til 1,03? JA Er S768I FAM ΔC T-kontrolrøret i intervallet -3,37 til 2,31? MISLYKKET KØRSEL JA NEJ Er indsætnings-fam ΔC T-kontrolrøret i intervallet -2,93 til 1,28? JA Positiv kontrol gennemført Fortsæt til prøveanalyse Figur 15. Procedure for kørselskontrolanalyse. Prøveanalyse: FAM C T -prøvekontrolværdi Forudsat at begge kørselskontroller er gyldige, skal hver C T -prøvekontrolværdi ligge inden for området 23 30,69 i den grønne kanal. Se organisationsdiagrammet "Sample Analysis" (Prøveanalyse) i Figur 16. Prøvekontrolanalyse med C T på <23: Prøver med en kontrol-c T på <23 overbelaster mutationen og skal fortyndes. For at påvise hver enkelt mutation på lavt niveau skal de overkoncentrerede prøver fortyndes, så de er i ovenstående interval med den basis, at C T stiger med 1, når der fortyndes 1:1. Prøvekontrolanalyse med C T inden for området 30,69 37: Fortolkes med forsigtighed, da meget lave mutationsniveauer måske ikke påvises. Prøvekontrolanalyse med C T inden for området 37 40: Fortolkes med forsigtighed, da kun meget høje mutationsniveauer vil blive påvist. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 35

Prøvekontrolanalyse med C T på >40: Prøven indeholder ikke tilstrækkeligt DNA til at muliggøre analyse. Bemærk: Hvis FAM C T -prøveværdien er mellem 23 og <37, er der ingen grund til at evaluere den interne kontrol. Bemærk: Hvis en prøve ikke genererer en C T (dvs. C T >40), kan det skyldes tilstedeværelsen af en hæmmer, en fejl i analyseopsætningen, eller at der ikke er noget EGFR DNA, der kan forstærkes. Intern kontrol-c T -værdi på 31 37: Analysen fungerer korrekt, men der er ikke noget EGFR DNA, der kan forstærkes. Intern kontrol-c T -værdi ligger ikke inden for området 31 37: Dette kan tyde på, at der er en fejl i analyseopsætningen, eller det kan tyde på tilstedeværelsen af en hæmmer. Det er muligt at reducere hæmmerens effekt ved at fortynde prøven, selvom dette også fortynder DNA'et. Bemærk: Hvis mutationsanalysens FAM-reaktion ikke genererer en C T -værdi, og de interne kontrolreaktioner genererer en C T -værdi uden for området 31 37, skal dataene kasseres, da der kan være hæmmere til stede, som kan medføre falsk-negative resultater. Fortynding af prøven kan mindske hæmmernes effekt, men det bør bemærkes, at dette også vil fortynde DNA'et. 36 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Fortynd prøven Prøven skal fortyndes JA FAM C T- prøvekontrolværdi Er kontrolanalysens FAM C T i intervallet 23,00 til 30,69? NEJ Er FAM C T <23,00 JA Mutationsanalyser i prøvens interne kontrol HEX C T-værdier Der skal udvises forsigtighed ved fortolkning af resultaterne NEJ JA FAM C T-værdi for prøvemutationsanalyser Er hver FAM C T- mutation i intervallet 00,00-40,00? NEJ Er HEX C T for den interne mutationskontrol mellem 31-37 Er FAM C T i intervallet 30,69-37,00 NEJ JA Rørets FAM-forstærkning er positiv Prøven er ugyldig NEJ Mutationen blev ikke registreret JA JA Er FAM C T i intervallet 37,00-40,00 NEJ ΔC T -værdierne for hver mutations- C T beregnes = mutation C T kontrol C T Prøven indeholder muligvis ikke DNA, der kan forstærkes, eller den kan indeholde en hæmmer. Sammenlign ΔC T -værdier med cut-offværdier for mutation Se tabel 8 på side 38 i håndbogen Er der nogen ΔC T-værdier inden for det angivne ΔC T-interval for analysen NEJ Mutationen blev ikke registreret JA EGFR-mutation registreret for mutationsanalyse Figur 16. Organisationsdiagram over mutationsanalyse. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 37

FAM C T -værdier for prøvemutationsanalyser FAM-værdierne for alle syv mutationsreaktionsblandinger skal kontrolleres i forhold til værdierne i Tabel 8. Tabel 8. Acceptable værdier for prøvemutationsreaktion (FAM)* Analyse Acceptabelt C T - område Cut-off-værdi for C T T790M 15,00 40,00 6,38 Deletioner 15,00 40,00 9,06 L858R 15,00 40,00 8,58 L861Q 15,00 40,00 9,26 G719X 15,00 40,00 9,31 S768I 15,00 40,00 9,26 Indsætninger 15,00 40,00 7,91 * De acceptable værdier ligger inden for og inkluderer de viste værdier. Hvis FAM C T ligger inden for det specificerede område på 15,00 40,00, har den positiv FAM-forstærkning. Hvis FAM C T ligger over det specificerede område, har den negativ FAMforstærkning. C T -værdien beregnes som følger for alle mutationsprøver, der viser positiv forstærkning, idet det skal sikres, at C T -værdierne for mutation og kontrol er fra den samme prøve. C T = mutation C T kontrol C T Sammenlign C T -værdien for prøven med cut-off-punktet for den pågældende analyse (Tabel 8), idet det skal sikres, at det korrekte cut-off-punkt anvendes for hver enkelt analyse. 38 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Cut-off-punktet er det punkt, over hvilket et positivt signal potentielt kunne skyldes et baggrundssignal i ARMS-primeren på vildtype-dna. Hvis prøvens C T -værdi er højere end cut-off-punktet, klassificeres den som "mutation not detected" (mutation ikke påvist) eller uden for kittets påvisningsgrænser. Hvis prøveværdien er lig med eller lavere end cut-off-punktet, anses prøven for at være positiv for en mutation, der er påvist af den pågældende analyse. Bemærk: For prøver, der ikke viser nogen FAM mutations-c T, er det nødvendigt at bedømme den interne kontrol (HEX) C T for at afgøre, om mutationen ikke er påvist, eller om analysen er ugyldig. Hvis HEX C T -værdien er mellem 31 og 37, er mutationen ikke påvist. Hvis HEX C T -værdien ligger uden for området 31 37, er prøven ugyldig. Kort fortalt vil hver mutationsreaktion for hver prøve få en status som påvist mutation, mutation ikke påvist eller ugyldig efter følgende kriterier. Mutation påvist: FAM-forstærkning er positiv, og C T er på eller under cut-off-værdien. Hvis der påvises flere mutationer, kan de alle rapporteres. Mutationen ikke påvist: FAM-forstærkning er positiv, og C T er over cut-off-værdien. FAM-forstærkning er negativ, og HEX-forstærkning (intern kontrol) er positiv. Ugyldig: FAM-forstærkning er negativ, og HEX-forstærkning er uden for specifikationerne. Bemærkninger til datafortolkning Lineær forstærkning Rotor-Gene Q-plot fra samtlige reaktioner skal kontrolleres. Fra tid til anden ses en stigning i fluorescenssignalet i NTC'en og negative prøver. Hvis dette er tilfældet, og der opnås en C T -værdi, skal brugeren skelne mellem en sand forstærkningshændelse, der indikerer kontaminering i NTC, og en lineær stigning i fluorescens, som kan være opstået på grund af en fluorescensartefakt. Analyse af NTC Figur 17 18 viser to eksempler på NTC-prøvers forløb. Figur 17 viser ikkelineær (sand forstærkning) på grund af prøvekontaminering. Denne kørsel skal kasseres, og prøverne skal testes igen. Figur 18 viser lineær forstærkning i en NTC. Under sådanne omstændigheder skal de ubehandlede fluorescensdata undersøges. Det tilsvarende plot af den ubehandlede fluorescens vises på Figur 19 og indikerer en lineær stigning i fluorescens og ikke en sand forstærkningshændelse. Dataene fra denne kørsel kan bruges, hvis både den positive og interne kontrol er gennemført. Til sammenligning med Figur 19 viser therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 39

Figur 20 ubehandlede fluorescensdata, hvor der er sket sand forstærkning. Under sådanne omstændigheder skal dataene kasseres, og prøverne testes igen, da det indikerer, at der er kontaminering. Forstærkning, der viser kontaminering i et NTC-rør Figur 17. Kontaminering i NTC for en analyse i en analyseret kørsel. Lineær stigning af fluorescens i en NTC-brønd Figur 18. Eksempel på en lineær stigning af fluorescens i en NTC-brønd. 40 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013

Lineær forstærkning i en NTC-brønd i ubehandlet fluorescens Figur 19. Ubehandlet fluorescens fra Figur 18. Kontaminering i NTCbrønd i ubehandlet fluorescens Der er ingen kontaminering i de øvrige brønde. Figur 20. Ubehandlede fluorescensdata, der viser en NTC-brønd med en sand forstærkning. therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013 41

Analyse af prøver Figur 21 22 viser to eksempler på forstærkning i prøvereaktioner. Figur 21 viser sand forstærkning i en prøvebrønd i en analyseret kørsel. Hvis en kørsel udviser denne type sigmoid forstærkningskurve, er der tale om sand forstærkning, og dataene fra denne kørsel kan bruges, hvis både den positive og interne kontrol er gennemført. Plot, der viser sand forstærkning Figur 21. Sand forstærkning i en prøvebrønd i en analyseret kørsel. Der vises et eksempel på lineær forstærkning i en prøvereaktion i Figur 22. Under sådanne omstændigheder skal de ubehandlede fluorescensdata undersøges. Det tilsvarende plot af den ubehandlede fluorescens (Figur 23) indikerer, at den lineære stigning i Figur 22 svarer til en lineær stigning i den ubehandlede fluorescens og ikke er en sand forstærkning. Hvis både den positive og interne kontrol er gennemført, kan prøveresultater for disse kørsler bruges med forsigtighed, så lineær forstærkning kaldes "no C T " (Ingen CT). 42 therascreen EGFR RGQ PCR-kit-håndbog 06/2013