Validering af molekylærbiologiske analyser. Marianne Antonius Jakobsen Afsnitsleder for molekylærbiologisk lab. Klinisk Immunologisk afdeling, OUH.

Transkript

1 Validering af molekylærbiologiske analyser Marianne Antonius Jakobsen Afsnitsleder for molekylærbiologisk lab. Klinisk Immunologisk afdeling, OUH.

2 Hvordan laver man en god validering? Standarden: Mere uddybende guideline under DSKB.

3 Typer af molekylærbiologiske analyser Bestemmelse af HLA-vævstyper (SSO-PCR og SSP-PCR) Bestemmelse af specifikke HLA-vævstyper (f.eks. HLA-DQ2/8 m. microarrays) Genotype bestemmelse (SNP assays) Genomisk blodtypebestemmelse Frit føtal DNA analyser (RHD bestemmelse) Sanger sekventering Next Generation sequencing (NGS) Kvalitative analyser

4 Hvordan laver man så en god validering af en kvalitativ analyse?

5 Klinisk Immunologi, OUH Produktionsenhed Diverse laboratorieafsnit: o Erytocytlaboratoriet o HIV/HEP o Autoimmunlaboratoriet o Leukocytlaboratoriet o Molekylærbiologisk

6 Hvad har vi gjort?

7 Vores valideringsprotokol Formål Anvendelsesområde Metodebeskrivelse (i drift): Målemetode Måleenhed Udstyr Prøvemateriale Reagenser/utensilier Sporbarhed mht. prøveid Svarafgivelse

8 Prøvemateriale eller

9 Sporbarhed mht. prøveid.

10 Svarafgivelse Beskrivelse af hvordan svaret generes og konkluderes F.eks. analysesoftware og version Procedure omkring analysering, hvem gør hvad? Svarafgivelse: Simpelt svar Mere kompliceret svar og hvilke krav

11 Vores valideringsprotokol fortsat Kriterier for accept: Måleområde Detektionsgrænse Linearitet Korrekthed Analytisk specificitet Præcision/reproducerbarhed Afsmitning Robusthed/ydre påvirkninger Eventuelt

12 Korrekthed Overensstemmelse mellem metode og anden (reference-) metode: SNP genotype versus Sanger MicroArray versus high resolution HLA NGS versus Sanger

13 Valideringsprotokol Valideringsprocedure: Anvendt prøvemateriale Referencemateriale Valideringsbetingelser Procedure (punkt for punkt)

14 Prøvemateriale Referencemateriale (kan være rigtig svært at få fat i) EQA prøver med kendt svar Tidligere kørte patientprøver med kendt diagnose F.eks. til HLA-DQ2/8 Sammenligning med anden standard metode Molekylærbiologisk med serologisk Prøver fra andre laboratorier OBS: hvor sikker er du på den metode, du sammenligner med?

15 Valideringsprotokol Valideringsprocedure: Anvendt prøvemateriale Referencemateriale Valideringsbetingelser Procedure (punkt for punkt) Indsamling af data: Hvilke type data Databehandling

16 Valideringsrapport Ændringer i forhold til protokollen Resultater (punkt for punkt) Kvalitetssikring af metode i drift Måleusikkerhed Konklusion Arbejdsmiljø Husk: at skrive rapporten så detaljeret, at du også forstår den om 5 år (og din TA forstår den).

17 Kvalitetssikring Kitkontroller Interne kontroller Eksterne kontroller

18 Interne kontroller Negativ kontrol (kontaminering) Krav til nogle kits Rigtig god ide til alle PCR opsæt. Positiv kontrol Afhænger meget af opsæt: Genotypebestemmelse med SNP Positiv kontrol til føtal RHD bestemmelse Ved 96 brøndsopsæt (marker plades placering) Hjemmegjorte kontroller (spikede prøver eller gamle patientprøver)

19 Eksterne kontroller (EQA) Metode- eller sygdomsspecifik DEKS EMQN NEQAS INSTAND RfB (referenzinstitut für bioanalytik, DAkkS) Qualigene Udveksling med andre laboratorier

20 Eksterne kontroller (EQA) DEKS EMQN Sanger sekventering NGS HRF NEQAS Diverse HLA (low resolution, B27, B5701, DQ2/8) Kimæriseundersøgelse INSTAND Genomiske blodtyper inkl. HPA RfB (referenzinstitut für bioanalytik, DAkkS) IL28B Qualigene MLPA Udveksling med andre laboratorier Føtal RHD bestemmelse

21 Eksempel på validering 1 Mannan-bindende lektin (MBL) +4 P/Q 7 mulige haplotyper (HYPA, LYPA, LYQA, LYPB, LXPA, LYQC og HYPD)

22 Valideringsopsæt Metode: Sanger sekventering Materiale: Prøver fra Rigshospitalet (SNP assay) Fuld overensstemmelse på mulige SNP s

23 Hele valideringen er kørt om 88 prøver fra SSI (alle SNP s dækket): 80 enslydende 3 kunne ikke opformeres 5 diskrepans Hvilken analyse er så korrekt? Tredje metode i brug Konklusion har betydet procedureændring

24 Eksempel på validering 2 Targeted sekventering af 17 gener med NGS. Validering koncentreret om 4 gener, som vi hidtil har Sanger sekventeret. Ion Torrent:

25 Opbygning af validering Grundig metodebeskrivelse fra prøvehåndtering til dataanalyse Anvendt materiale (DNA fra patientprøver og EMQN) Korrekthed: test for kendte varianter i de 4 gener Homo/heterozygote (Insertioner/deletioner og homopolymer varianter) Reproducerbarhed (inter-run) 2 biblioteker fra samme prøve i 2 forskellige kørsler Repeterbarhed (intra-run) Et bibliotek delt i 2 i samme kørsel Robusthed: Dækning for de enkelte amplikons Krydskontaminering

26 Kriterier for accept Kvalitetskrav for selve kørsel Total aligned bases Alignement kvalitet Kvalitetskrav for prøve Assigned amplicon reads Krav til resultat: Genfinde kendte mutationer Dækning af kodende regioner eller mulighed for at hurtig identificere ikke-dækkede områder Vurdering på krydskontaminering

27 Hvad valideringen ellers viste Heterozygot variant allelfrekvens - 0, Homozygot variant allelfrekvens - 0,99-1 Forward/reverse readfrekvensen - stor variation

28 Vores erfaring NGS har krævet flere tillægsvalideringerne: Producent ændrede kittet af flere omgange Skiftet apparatur Skiftet analysesoftware 2 gange

29 Vores erfaring Fordel med fleksibel akkreditering på både Sanger og NGS Validerer metode Tilføje gener eller paneler efter behov Estimat på usikkerhed Ikke udregnet en værdi Angiver forbehold i brugerhåndbog og svar: Angiver hvis ikke fuld dækning Ikke-kodende region ej undersøgt Heterozygot deletion af helt exon ej undersøgt

30 Spørgsmål?