Anbefalinger for molekylærbiologisk analyse for EGFR mutationer i lunge karcinomer.

Transkript

1 Anbefalinger for molekylærbiologisk analyse for EGFR mutationer i lunge karcinomer. Anbefalingerne er baseret på guidelines foreslået af European Society of Pathology (ESP) og er udarbejdet som samarbejde mellem Dansk Molekylær Patologi Gruppe (DMPG) og Udvalg for Molekylær Patologi (UMP) under Dansk Patologiselskab (DPAS). Baggrund/targeteret behandling Hos patienter med avanceret NSCLC, der har mutationer (exon 19 og 21) i EGF-receptoren er 1. linje pallierende behandling TKI, hvor der er beskrevet responsrater op til 60-70%. Hos ikke muterede er platinbaseret kemoterapi førstevalg. Det skønnes at ca. 10% af adenokarcinomerne og 1-2% af planocellulære karcinomer har mutationen. Alle patienter udredt via lungemedicinsk afdeling, OUH, med pulmonale adenokarcinomer, der tænkes henvist til onkologisk behandling (kurativ eller pallierende). EGFR mutationstesten skal efter gældende praksis som minimum indeholde de hyppigst forekommende mutationer (for eks.: pg719 (S, A eller C) i exon 18, deletioner i exon 19, ps768i, pt790m og insertioner i exon 20 samt pl858r og pl861q i exon 21). Tarceva er indiceret til førstelinje behandling af patienter med lokalt fremskreden eller metastatisk ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) med EGFR-aktiverende mutationer. Udvælgelse af analysemateriale. Optimalt anvendes materiale fra primær tumor eller senest tilkomne metastase. Der kan til EGFR mutationsanalysen anvendes formalinfikseret paraffinindstøbt materiale såvel som cytologisk materiale. Tumormaterialet vurderes mikroskopisk mht. andelen af tumorcellekerner i forhold til andre cellekerner i materialet (nekrotiske områder tælles ikke med). Der angives procent af tumorcellekerner i forhold til totalt antal cellekerner. Vurderingen foretages på et snit (HE eller IHC) udtaget i umiddelbar relation til snittene til den molekylærbiologiske analyse. Hvis procentdelen af tumorvæv er insufficient, selekteres et område til manuel makrodissektion (eller evt. mikrodissektion), hvor andelen af tumorcellekerner i det afskrabede område skal vurderes. Manuel makrodissektion foretages ved markering af det egnede område og afskrabning af dette område i ufarvede snit på glas eller direkte fra paraffinblokken. Ved cytologisk materiale vurderes procenten af tumorcellekerner inden cellerne skrabes af glasset.

2 Analysemetode Alle analysemetoderne indebærer oprensning af DNA der PCR amplificeres og efterfølgende analyseres. Den sufficiente tumorcellekerneprocent er vigtig for valg af optimal analysemetode. For at arbejde med god sikkerhedsmargin anbefales tumorcellekerneindholdet i det mikrodissekerede materiale ved PCR-analyserne at være over analysens detektionsgrænse. Detektionsgrænsen ved real-time PCR-analyse og Next Generation Sequencing er typisk 1-5% tumorcellekerneindhold, ved pyrosekventering 10% eller derover og ved Sangersekventering 30% eller derover. Den valgte analysemetode skal være valideret og der skal medtages de for analysen relevante positive og negative kontroller. Eksempel på analysemetoder, følsomhed, fordele og ulemper af dem: Sangersekventering (30-50% tumorcellekerner) (in-house metode) Fordel: Finder alle mutationer. Ulempe: Lav følsomhed og arbejdstungt. Kræver høj tumorcelle procent. Pyrosekventering (5-10 % tumorcellekerner) (in-house metode) Fordel: Kan finde alle mutationer. Ulempe: Relative arbejdstungt. Validering af metode. Pyrosekventering (5-10 % tumorcellekerner) (kommercielt kit se Appendiks A) Fordel: Enkel opsætning. Valideret kit. Ulempe: Finder kun udvalgte mutationer defineret af kittet. Real-time qpcr (ca. 1-5 % tumorcellekerner) (in-house metode) Fordel: Hurtig metode, høj følsomhed. Ulempe: Finder kun udvalgte mutationer defineret af primere og probe. Validering. Real-time qpcr (ca. 1-5 % tumorcellekerner) (kommercielt kit se Appendiks B) Fordel: Hurtig metode. Høj følsomhed. Valideret kit. Ulempe: Finder kun udvalgte mutationer defineret af kittet. Next Generation Sequencing (NGS) (ca. 1-5 % tumorcellekerner) Fordel: Høj følsomhed. Finder alle mutationer. Cancer paneler indeholder alle relevante gener. Ulempe: Dyrt. Tidskrævende og er endnu ikke så udbredt.

3 Bemærkninger. Metoden til oprensning af DNA skal være valideret og kvaliteten af det oprensede skal være i en kvalitet og mængde passende til den anvendte analysemetode. Svarafgivelse bør indeholde. Svaret bør indeholde: 1. Titel på analysen. 2. Prøvedato (dd.mm.åå). 3. Prøvenummer. 4. Rekvirent. 5. Indikation for analysen. 6. Prøvemateriale. 7. Procent andel af tumorceller i materialet. 8. Anvendt metode og følsomhed af denne. 9. Oplysning om mutationer der kan detekteres ved den anvendte metode. 10. Genotype der er fundet ved analysen (anvendelse af korrekt nomenklatur). 11. Fortolkning af resultatet. 12. Svardato. 13. Signatur. 14. Unik ID på hver side. 15. Angivelse af totalt antal sider. 16. Kodning med SNOMED koder (Appendiks C). Kvalitetskontrol Laboratoriet bør indgå i et eksternt kvalitetssikringsprogram. Eksempel: Anbefalingerne er udarbejdet af: Karin de Stricker, Odense Universitetshospital (kontaktperson til UMP) Henrik Hager, Aarhus Universitetshospital (Sygehus Lillebælt, Vejle fra ) Referencer: 1. Gulley ML et al. ( 2007) Clinical Laboratory Reports in Molecular Pathology. Arch Pathol Lab Med, Vol 131; p Ogino S et al. (2007) Standard Mutation Nomenclature in Molecular Diagnostics. J. of Mol. Diagn. vol 9, no 1; p1-6.

4 3. van Krieken J.H. et al. (2008) KRAS mutation testing for predicting response to anti-egfr therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European quality assurance scheme. Virchows Arch. 453, p van Krieken JH et al. (2013) Guideline on the requirements of external quality assessment programs in molecular pathology. Virchows Arch. 462; p Lindeman N.I. et al. (2013) Molecular Testing Guideline for Selection of Lung Cancer Patients for EGFR and ALK Tyrosine Kinase Inhibitors: Guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology. Journal of Thoracic Oncology. Vol. 15, no. 4, p

5 Appendiks A (Eksempler på pyrosekventerings kits) Therascreen EGFR Pyro Kit (Exon 18: G719A, G719C, G719S, Exon 19: 20 deletioner and komplekse mutationer, Exon 20: S768I, T790M, Exon 21: L858R, L861Q, L861R) (Qiagen). Appendiks B (Eksempler på real-time PCR kits) Therascreen EGFR RGQ PCR Kit (Exon 18: G719S, G719A, G719C, Exon 19: 19 deletioner, Exon 20: 3 insertioner, S768I, T790M, Exon 21: L858R, L861Q) (Qiagen). cobas EGFR Mutation Test (Exon 18: G719S, G719A, G719C, Exon 19: 29 deletioner, Exon 20: 5 insertioner, S768I, T790M, Exon 21: 2 varianter af L858R) (Roche). Appendiks C (SNOMED kodning) T-kode (topografi kode) M-kode (morfologi kode) F-kode (funktion) se liste nedenfor P-kode (procedure) SNOMED koder: FE13CA EGFR genmutation L858R FE13CB EGFR genmutation L861Q FE13CC EGFR genmutation G179X FE13CD EGFR genmutation S768I FE13CK EGFR gendeletion exon 19 FE13CP EGFR geninsertion exon 20 FE13C3* EGFR gen muteret FE13C1 EGFR genstatus normal *: kan bruges med nærmere forklaring, hvor der ikke findes en specifik kode for den fundne mutation.