BRUGSANVISNING PLADEMEDIER KLAR TIL BRUG PA-257481.03 Rev.: Sep 2011 BD CHROMagar Orientation Medium TILSIGTET BRUG BD CHROMagar Orientation Medium (orienteringsmedium) er et non-selektivt medium til isolering, direkte identifikation, differentiering og optælling af patogener i urinvejene. BD CHROMagar Orientation Medium giver mulighed for differentiering og identifikation af Escherichia coli og Enterococcus uden bekræftende testning. PROCEDURENS PRINCIPPER OG FORKLARING Mikrobiologisk metode. Grupperne Escherichia coli, enterokokker, Klebsiella-Enterobacter-Serratia og Proteus- Morganella-Providencia er de organismer, der hyppigst giver urinvejsinfektioner (urinary tract infections, UTI). 60 til 70 % af UTI er forårsaget af E. coli i ren dyrkning eller sammen med enterokokker. Staphylococcus saprophyticus og Streptococcus agalactiae observeres ved UTI hos kvinder, selvom det er mindre hyppigt. På grund af de involverede stoffers forskellige antimikrobielle følsomheder, er det nødvendigt at identificere deres art med grupper af biokemiske tests af hensyn til den effektive antimikrobielle behandling. Dette er en af de mest tidkrævende opgaver i et laboratorium, der behandler urinprøver. De arter eller organismegrupper, der hyppigst isoleres, producerer karakteristiske enzymer. Det er således muligt at identificere disse organismer til artsniveauet med et begrænset antal af substratfermenterings- eller omsætningstests. 1,2 Nogle af de involverede organismer producerer enzymer enten til metabolisme af laktose eller glukosider eller begge, mens andre organismer ikke producerer nogen af disse enzymer. For eksempel producerer E. coli enzymer af laktosemetabolismen, men er ß-glukosidase- negative. Andre medlemmer af Enterobacteriaceae familier er ß-glukosidase-positive, men indeholder ikke enzymer, der er nødvendige for laktosefermentering, og andre kan indeholde begge typer enzymer eller ingen af dem. Beta-glukosidaser findes også i grampositive kokker som fx Enterococcus arter og Streptococcus agalactiae. Tryptophandeaminase (TDA) er et enzym, som karakteristisk findes i den gruppe organismer, der hedder Proteus-Morganella-Providencia. Evalueringer af funktion har vist, at BD CHROMagar Orientation Medium er bedre end almindeligt anvendte differentialmedier til isolering, differentiering og tælling af UTI patogener, som fx CLED agar eller en kombination af blod- og MacConkey agarer. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium giver mulighed for identifikation af E. coli og enterokokker direkte på isoleringspladen; desuden er den formodede identifikation af de fleste Staphylococcus saprophyticus og S. agalactiae stammer, såvel som af grupperne Klebsiella-Enterobacter- Serratia (=KES) og Proteus-Morganella-Providencia (=PMP) muligt ved hjælp af farvning af koloni og medium. Da BD CHROMagar Orientation Medium er non-selektivt, vil andre UTI patogener vokse, men biokemiske tests er nødvendige til at identificere disse. CHROMagar Orientation Medium blev udviklet af A. Rambach og sælges af BD under licensaftale med CHROMagar, Paris, Frankrig. BD CHROMagar Orientation Medium leverer specielt udvalgte peptoner næringsstofferne. Chromogenblandingen består af kunstige substrater (chromogener), som frigiver forskelligt farvede stoffer efter nedbrydning fra specifikke mikrobielle enzymer, og sikrer således den direkte differentiering af visse arter eller påvisningen af visse organismegrupper med blot et minimum af bekræftende tests. PA-257481.03-1 -
REAGENSER BD CHROMagar Orientation Medium Formel* pr. liter renset vand Chromopepton 16,1 g Chromogen blanding 1,3 Agar 15,0 ph 6,9 ± 0,2 * Justeret og/eller suppleret som påkrævet for at leve op til funktionskriterier. FORHOLDSREGLER. Kun til professionel brug. Pladerne må ikke anvendes, hvis de viser tegn på mikrobiel kontaminering, misfarvning, udtørring, revnedannelse eller andre tegn på nedbrydning. Læs dokumentet GENEREL BRUGSANVISNING for procedurer om aseptisk håndtering, biofarer og bortskaffelse af det brugte produkt. OPBEVARING OG HOLDBARHED Pladerne opbevares efter modtagelse i mørke ved 2 8 C i deres originale hylsterindpakning, lige indtil de skal bruges. Undgå nedfrysning og overophedning. Pladerne kan inokuleres op til udløbsdatoen (se etiketten på pakken) og inkuberes i de anbefalede inkubationstider. Plader fra åbnede stabler med 10 plader kan bruges i en uge, når de opbevares i et rent område ved 2 8 C. BRUGERKVALITETSKONTROL Inokulér repræsentative prøver med de følgende stammer (se dokumentet GENEREL BRUGSANVISNING for at få detaljer). Inkubér pladerne i omvendt position ved 35 ± 37 C i 20 til 24 timer. Stammer Vækstresultater Escherichia coli Vækst god til udmærket; kolonier af medium til stor størrelse, ATCC 25922 mørk rosa til pink, transparente Enterobacter cloacae Vækst god til udmærket; kolonier af medium størrelse, ATCC 13047 Proteus mirabilis ATCC 14153 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Streptococcus agalactiae ATCC 12386 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 (=NCTC 10516) Ikke-inokuleret mørkeblå med eller uden violette haloer Vækst god til udmærket; kolonier af medium størrelse, blege til beige, omgivet af en gul til brun halo; i områder med tæt vækst kan mediet være fuldstændig gult til brunt. Sværmen er delvist til fuldstændigt hæmmet. Vækst god til udmærket; kolonier små, blågrønne til blå Vækst rimelig til god; kolonier ubetydelige til små, lyseblågrønne til lyseblå, med eller uden haloer Vækst god til udmærket; kolonier af medium til lille størrelse, med deres naturlige farve (hvid til cremefarvet) Vækst rimelig til god; kolonier små, uigennemsigtige, lys pink til rosa Farveløse til meget lysegule, transparente PROCEDURE Vedlagte materialer BD CHROMagar Orientation Medium (90 mm Stacker plader). Mikrobiologisk kontrolleret. Materialer, der ikke er vedlagt Hjælpedyrkningsmedier, reagenser og laboratorieudstyr som påkrævet. Prøvetyper Dette medium bruges udelukkende til optælling og differentiering af bakterier i urin. Midtstråleeller kateterurin eller urin opsamlet ved suprapubisk blærepunktur kan anvendes (se også PA-257481.03-2 -
FUNKTIONSDATA OG PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER). Overhold aseptisk teknik ved opsamling af urinprøver. Urin skal stryges direkte på mediet (senest 2 timer efter opsamling) eller skal opbevares i køleskab (højst i 24 timer) for at undgå overvækst af de smitsomme stoffer eller kontaminanter inden inokulering af dette medium. Testprocedure Brug af kalibrerede løkker eller andre teknikker, der almindeligvis bruges til udstrygning af urinprøver på plader, er obligatorisk for at opnå isolerede kolonier med deres typiske farver og former. Opsaml en prøve af den ufortyndede, godt blandede urin ved hjælp af en kalibreret løkke (0,01 eller 0,001 ml). Sørg for, at løkken fyldes korrekt med prøven. Inokulér prøven ned i midten af pladen med et enkel stryg, hvorfra yderligere spredning af podestoffet udføres. 6,7 Inkubér de inokulerede plader i omvendt position ved 35 37 C aerobt i 20 til 24 timer. Undgå udsættelse for lys under inkubation, da dette kan ødelægge chromogenerne. Så snart koloniernes farver har vist sig, er udsættelse for lys tilladeligt. Resultater Efter inkubation bør pladerne vise isolerede kolonier i de områder, hvor podestoffet blev fortyndet korrekt. Anvend Tabel 1 og Plan 1 til identifikation eller differentiering og som en retningslinie til yderligere bekræftende tests. Gramfarvning og mikroskopi kan bruges til at bekræfte resultater. Tabel 1 Retningslinier til identifikation baseret på forskellige farver på kolonier Organisme Udseende på BD CHROMagar Orientation Medium E. coli a Kolonier af medium til stor størrelse, mørk rosa til pink, transparente med eller uden haloer i det omgivende medium Gruppe KES b Kolonier af medium størrelse, blå til mørkeblå med eller uden violette Gruppe PMP c haloer Blege til beige kolonier omgivet af haloer d Enterococcus Små blågrønne kolonier. S. agalactiae Lyseblå-grønne til blå, ubetydelige til små kolonier, med eller uden haloer S. saprophyticus (de fleste Lys pink til rosa små, stammer) uigennemsigtige kolonier med eller uden haloer Andre (inklusiv gærsvampe) Naturlig (cremefarvet) pigmentering For fodnote a-h, se Plan 1 PA-257481.03-3 - Bekræftende tests (Nødvendigt til yderligere differentiering) BBL CRYSTAL E/NF til differentiering inden for slægterne Indol, H 2 S e, ODC f, BBL CRYSTAL E/NF til differentiering inden for slægterne PYR g 5 µg novobiocin disc h (novobiocin plade) Relevante biokemiske eller serologiske identifikationstests Bekræftende tests Udfør de bekræftende tests som påkrævet (Tabel 1, Plan 1). Der må ikke påføres noget påvisningsreagens direkte på kolonierne på BD CHROMagar Orientation Medium. Tests bør i stedet udføres på filterpapir med vækst fra de respektive kolonier. Ved E. coli kolonier, som er mørk rosa til pink, men ubetydelige til små i størrelse, må der ikke anvendes Kovacs indolreagens, da deres farve på kolonien kan interferere med den røde farve i en positiv indoltest; brug i stedet dimethylaminocinnamaldehyd (DMACA) indolreagens (grøn = positiv). Hvis der anvendes andre bekræftende tests eller biokemiske identifikationssystemer, skal instruktionerne, der er vedlagt disse tests eller systemer, følges. Udfør kun bekræftende testning for Enterococcus, hvis artsdannelse ud over slægtsniveau er påkrævet.
Plan 1: Retningslinier til udførelse af identifikationstests på udvalgte organismer Koloniens udseende Lille, rosa, gennemsigtig Farveløse til beige kolonier, orangebrunt medium 5 µg novobiocin disc Gruppe PMP følsom resistent DMACA i Indoltest PA-257481.03-4 - S. intermedius, S. simulans BBL CRYSTAL GP til S. sapro- differentiering inden for phyticus, S. xylosus slægterne grøn (positiv) H 2 S positiv e H 2 S negativ e farveløs til rosa (negativ ODC positiv f ODC negativ f P. vulgaris Providencia arter, Morganella arter. P. mirabilis P. penneri a Se Procedurens begrænsninger b KES = gruppen Klebsiella-Enterobacter-Serratia c PMP = gruppen Proteus-Morganella-Providencia d Den gule til brune farve skyldes positiv tryptophandeaminase (TDA) almindeligt hos alle grupper af PMP organismer. Ca.50% af P. vulgaris stammer producerer blå kolonier på et gult til brunt medium. e Konventionel hydrogensulfidetest. f Konventionel ornithindecarboxylasetest. g Pyroglutamattest for pyrrolidonylarylamidase. h Inokulér ved at sprede en Mueller Hinton II agarplade med isolatet. Anbring en novobiocin (5 µg disc) på den inokulerede plade. Inkubér i 18 til 24 timer ved 35 37 C og bestem størrelsen på hæmningszonen. (resistent: 16 mm, følsom: > 16 mm). i DMACA= Dimethylaminocinnamaldehydreagens til indolproduktion. Påfør reagens på filterpapir og gnid en koloni ind i området indeholdende reagens på filterpapiret. Vent 10-20 sekunder. En grøn farve antyder indolproduktion (rød eller farveløs = negativ). Beregning og Tolkning af resultater 6,7 Tæl antallet af kolonier (cfu) på pladen. Hvis en 0,01 ml løkke blev anvendt, repræsenterer hver resulterende koloni 100 CFU/mL; hvis en 0,001 ml løkke blev anvendt, svarer hver koloni til 1000 CFU/mL urin. 7 Midtstråle- og kateterurin: Aktuelle retningslinier angiver, at for et enkelt isolat angiver en tæthed på 10 5 cfu/ml infektion, <10 5 cfu/ml angiver urethral- eller vaginal kontaminering, og mellem 10 4 til 10 5 CFU/mL skal reevalueres baseret på kliniske oplysninger. 7 Kontaminerende bakterier forekommer normalt i lave antal, som varierer i koloniens morfologi. Urin opsamlet ved suprapubisk blærepunktur: Da blæren er steril hos ikke-inficerede individer, angiver enhver påvist cfu en infektion. Patogener i urinvejene vil normalt give høje tællinger med ensartet morfologi og farve på kolonien på dette medium. FUNKTIONSDATA OG PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER BD CHROMagar Orientation Medium er et chromogent medium til direkte identifikation, differentiering og optælling af almindelige patogener i urinvejene. Mediet er egnet til isolering af mange aerobt voksende mikroorganismer, som fx Enterobacteriaceae, Pseudomonas og andre ikke-fermenterende gramnegative stave, enterokokker, staphylokokker og mange andre fra urinprøver. Evalueringer af funktion har vist, at BD CHROMagar Orientation Medium har fordele frem for andre differentialmedier, der anvendes ved isolering, differentiering og optælling af UTI patogener, som fx CLED agar eller en kombination af blod- og MacConkey agarer. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium giver mulighed for differentiering og identifikation af E. coli og enterokokker uden bekræftende testning, baseret på kriterier for identifikation, som er fastlagt af CLSI-standard M35-A, Abbreviated Identification of Bacteria and Yeast; Approved Guideline (Forkortet identifikation af bakterier og gærsvampe: Godkendt retningslinie). 8 Formodet identifikation af grupperne S. saprophyticus, S. agalactiae, Klebsiella-Enterobacter-
Serratia (KES) og Proteus-Morganella-Providencia (PMP) er muligt ved hjælp af koloniens morfologi, pigmentering og misfarvning af medium. Da de fleste almindelige urinvejsinfektioner forårsages af E. coli og/eller enterokokker, nedsætter brug af dette medium signifikant arbejdsbyrden og tiden ved inokulering og aflæsning af identifikationssystemer, som er nødvendige, når der anvendes konventionelle medier. Funktionsresultater 4,9,10 Den mikrobiologiske ydelse hos et BD CHROMagar Orientation Medium og et chromogent medium fra en konkurrent blev sammenlignet med den mikrobiologiske funktion hos Columbia agar med 5% fåreblod og MacConkey agar uden krystalviolet til optælling og formodet identifikation af bakterier, som er ansvarlige for urinvejsinfektioner. 4 Af i alt 658 kliniske urinprøver gav 118 prøver ingen vækst, 402 prøver gav vækst med celletællinger på 10 5 CFU/mL, og 138 prøver gav vækst med celletællinger på <10 5 CFU/mL. Ud af prøverne med celletællinger på 10 5 CFU/mL var 163 rene dyrkninger, og 239 var blandede dyrkninger. Der blev opnået i alt 266 Escherichia coli isolater på begge chromogene medier, 260 blev isoleret på blodagar, og 248 blev isoleret på MacConkey agar. En stamme (0,4 %) udviklede ikke den forventede pink farve på BD CHROMagar Orientation Medium, og 23 stammer (8,7 %) udviklede ikke den forventede pink farve på mediet fra en konkurrent. Enterokokker (BD CHROMagar Orientation Medium, n = 266; medium fra konkurrent, n = 265) producerede små blågrønne kolonier på begge chromogene medier. Halvtreds af de blandede dyrkninger indeholdt enterokokker, som kun blev påvist på de chromogene medier. Grupperne Klebsiella- Enterobacter-Serratia (KES) og Proteus-Morganella-Providencia (PMP) kunne identificeres på begge chromogene medier. Ud af 66 isolater i gruppen KES voksede 63 med den forventede farve på BD CHROMagar Orientation Medium, og 58 ud af 64 isolater voksede med den forventede farve på mediet fra en konkurrent. Andre mikroorganismer krævede yderligere identifikationstests. I en anden evaluering af funktion med i alt 421 kliniske urinprøver, hvor 286 gav vækst af bakterier eller gærsvampe, blev BD CHROMagar Orientation Medium sammenlignet med BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood (BD Columbia agar med 5 % fåreblod). 9 På det chromogene medium opnåedes 483 isolater og 447 stammer blev isoleret på blodagarmediet. Stammerne blev identificeret biokemisk. Ud af E. coli stammerne blev 95 % identificeret korrekt ved deres rosa til pink farve på kolonien, mens de resterende E. coli stammer var ikkepigmenterede. Alle isolater af Enterococcus arter viste den typiske blå til blågrønne farve på kolonien. Streptococcus agalactiae isolater producerede bittesmå lyseblå til blågrønne kolonier og blev differentieret fra enterokokker ved en negativ PYR test. Alle Staphylococcus saprophyticus og S. simulans isolater producerede små rosa, gennemsigtige kolonier og blev differentieret med en novobiocin-test og identificeret til artsniveauet med biokemiske tests. I et internt blindforsøg, som indbefattede testning af over 900 bakteriestammer udsået i urin, var følsomheden og specificiteten af BD CHROMagar Orientation Medium s identifikation af E. coli, baseret på koloniens farve og morfologi alene, henholdsvis 97 % og 99 % ; for Enterococcus var følsomheden og specificiteten af identifikation henholdsvis 99 % og 97 % (se tabel). 10 Organisme Følsomhed % (95% konfidensinterval) E. coli 277/286 96,9 % (94,1-98,6 %) Enterococcus 319/324 98,5 % (96,4-99,5 %) Specificitet % (95% konfidensinterval) 638/645 98,9 % (97,8-99,6 %) 603/622 97 % (95,3-98,2 %) Procedurens begrænsninger Da dette medium er non-selektivt, vil andre UTI patogener vokse. Kolonier, som viser deres naturlige farve og ikke reagerer med de chromogene substrater på BD CHROMagar PA-257481.03-5 -
Orientation Medium skal differentieres yderligere med relevante biokemiske eller serologiske tests. Se Litteratur. 1,2 E. coli kolonier, som er mørk rosa til pink, men ubetydelige til små i størrelse, kræver yderligere bekræftende tests, som fx plet spot-indol (DMACA indolreagens). Gramnegative stave ud over dem, der hører til gruppen KES, kan producere store, blå kolonier på BD CHROMagar Orientation Medium og således kræve yderligere biokemiske tests, så de kan identificeres. 11 I meget sjældne tilfælde kan Listeria monocytogenes eller andre Listeria arter være til stede i urin (fx efter abort på grund af disse stoffer). Listeria vil producere små blå til blågrønne kolonier, som er PYR-negative, der efterligner Streptococcus agalactiae. Derfor kan det være nyttigt at forberede en gramstamme af alle stammer, som producerer bittesmå til små, blå til blågrønne kolonier på dette medium, som er PYR negative. Tilstedeværelsen af grampositive Stave kan antyde Listeria arter, men yderligere biokemiske tests er nødvendigt for at bekræfte deres identifikation. Isolater af Aeromonas hydrophila kan meget sjældent producere rosa til pink kolonier. De kan differentieres fra E. coli med en oxidasetest (Aeromonas = positiv; E. coli = negativ). En gang imellem producerer koagulasenegative staphylokokker ud over S. saprophyticus, fx S. simulans, S. xylosus og S. intermediu, små rosa, gennemsigtige kolonier. Det er derfor nødvendigt at udføre yderligere tests (se Plan 1) på disse isolater. BD CHROMagar Orientation Medium vil ikke understøtte vækst af kræsne organismer som fx Neisseria, Haemophilus eller Mycoplasma arter. Anvendelse af dette medium til ikke-kliniske eller kliniske prøver ud over urin er ikke dokumenteret. Inden BD CHROMagar Orientation Medium bruges for første gang, anbefaler vi at indøve den typiske kolonis udseende med definerede stammer, fx de stammer, der er nævnt under BRUGERKVALITETSKONTROL. LITTERATUR 1. Isenberg, H.D. (ed.). 1992. Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol. 1. American Society for Microbiology. Washington, DC. 2. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 1998. Bailey & Scott s diagnostic microbiology, 10 th ed. Mosby, Inc., St. Louis. 3. Merlino, J., S. Siarakas, G. J. Robertson, G. R. Funnell, T. Gottlieb, and R. Bradbury. 1996. Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiation and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J. Clin. Microbiol. 34: 1788-1793. 4. Hengstler, K.A., R. Hammann, and A.-M. Fahr. 1997. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 35: 2773-2777. 5. Samra, Z., M. Heifetz, J. Talmor, E. Bain, and J. Bahar. 1998. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 36: 990-994. 6. Clarridge, J.E., M.T. Pezzlo, and K.L. Vosti. 1987. Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of urinary tract infections. Coordinating ed., A.S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Forbes, B.A., and P.A. Granato. Processing specimens for bacteria. 1995. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2002. Approved Guideline M35-A. Abbreviated identification of bacteria and yeast, CLSI, Wayne, PA. 9. Data on file. BD Diagnostic Systems Europe, Heidelberg, Germany. 10. Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 11. Abbott, S.L. 2003. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. PA-257481.03-6 -
EMBALLERING/BESTILLING BD CHROMagar Orientation Medium Kat. nr. 257481 Plademedier klar til brug, 20 plader Kat. nr. 254107 Plademedier klar til brug, 120 plader YTTERLIGARE INFORMATION Kontakta närmaste BD-representant för ytterligare information. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ CHROMagar is a trademark of Dr. A. Rambach. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company. 2011 BD PA-257481.03-7 -