Kemiske stoffer der kan føre til misdannelser i fisk

Kemiske stoffer der kan føre til misdannelser i fisk Indkredsning af stoffer ud fra deres biokemiske virkemekanisme Bent Halling-Sørensen Bent Halling-Sørensen Aps Gitte Petersen, Frank Stuer-Lauridsen & Tina Slothuus DHI Water & Environment Karin Kinnberg & Poul Bjerregaard Syddansk Universitet 2008

Indholdsfortegnelse FORORD 5 SAMMENFATNING OG KONKLUSIONER 7 SUMMARY AND CONCLUSIONS 9 1 BAGGRUND 11 2 VALG AF MILJØFARLIGE STOFFER 15 2.1 STOFFERNE 15 3 FYSIOLOGISKE FORSKELLE MELLEM LEVENDEFØDENDE OG ÆGLÆGGENDE BENFISK ISÆR MED HENBLIK PÅ ÅLEKVABBEN 17 3.1 LEVENDEFØDENDE FISK 17 3.2 ÅLEKVABBEN 18 3.3 KEMIKALIEEKSPONERING 20 3.3.1 Udvikling af ægceller 20 3.3.2 Overførsel af kemikalier fra moderfisk til ægcelle 21 3.3.3 Udvikling af embryoner 22 3.3.4 Overførsel af kemikalier fra moderfisk til embryoner hos levendefødende benfisk 22 3.3.5 Effekter på moderfisken 23 3.3.6 Overførsel af kemikalier til embryoner hos æglæggende fisk 23 3.4 FORSKEL MELLEM LEVENDEFØDENDE OG ÆGLÆGGENDE FISK MED HENSYN TIL KEMIKALIEEKSPONERING 24 3.5 DELKONKLUSIONER 24 4 MULIGE ÅRSAGER TIL DEFORMITETS-DANNELSER HOS FISK 27 4.1 FORMER FOR DEFORMITETSDANNELSER 27 4.2 NÆRINGSSTOFFERS INDFLYDELSE 30 4.2.1 Calcium og fosfor 31 4.2.2 Selen 31 4.2.3 Vitaminer 32 4.2.4 Lipider 33 4.2.5 Thyroidhormon 33 4.2.6 Påvirkning af steroidgenesen 34 4.3 MILJØFARLIGE STOFFER 35 4.4 M74 (MILJOEN 74) SYNDROM 35 4.5 DELKONKLUSIONER 35 5 OM MILJØFREMMEDE STOFFERS IBOENDE VIRKEMEKANISMER HOS FISK 37 5.1 INDLEDNING 37 5.2 BELASTNING I DET MARINE MILJØ I DANMARK FRA MILJØFREMMEDE STOFFER 38 5.3 MILJØFREMMEDE STOFFER 38 5.4 METALLER 45 3

5.5 LÆGEMIDLER 45 5.6 HORMONER 46 5.7 PROFIL AF MILJØFREMMEDE STOFFERS IBOENDE VIRKNINGSMEKANISME OG BIOKEMISK PÅVIRKNING 46 5.8 DE MILJØFARLIGE STOFFERS VIRKEMEKANISMER 55 5.8.1 Miljøfremmede stoffer 55 5.8.2 Metaller 57 5.8.3 Lægemidler 57 5.8.4 Hormoner 58 5.8.5 Sammenfatning 58 5.9 STOFFERNES IBOENDE TOKSIKOLOGISKE EGENSKABER 58 5.10 CYTOTOKSISK -, MUTAGEN -, OG GENOTOKSISK EFFEKT 63 5.11 TERATOGEN EFFEKT 63 5.11.1 Miljøfremmede stoffer 63 5.11.2 Metaller 66 5.11.3 Lægemidler 67 5.11.4 Hormoner 67 5.11.5 Blandinger af stoffer 67 5.11.6 Sammenfatning 67 5.12 SAMMENHÆNG MELLEM BIOAKKUMULERING OG TOKSICITET CRITICAL BODY RESIDUE (CBR)-KONCEPTET 68 5.13 STOFFERNES AKUTTE OG KRONISK EFFEKTNIVEAUER PÅ AKVATISKE ORGANISMER 68 5.14 DELKONKLUSIONER 77 6 DISKUSSION 79 6.1 ER FORØGEDE FØDSELSDEFORMITETER HOS ÅLEKVABBEN KNYTTET TIL DENS FYSIOLOGI OG LEVEVIS? 79 6.2 FØRER DE OBSERVEREDE DEFORMITETER TIL EN KONKRET MISTANKE? 80 6.3 KAN MILJØFARLIGE STOFFER NÅ FREM TIL ÅLEKVABBENS FOSTRE? 80 6.4 KAN MILJØFARLIGE STOFFER FORÅRSAGE DEFORMITETER I FISKESKELETTET? 81 6.5 PÅVIRKER MILJØFARLIGE STOFFER HORMONER DER ER INVOLVERET I SKELETDANNELSEN? 82 6.6 ER KONCENTRATIONERNE AF MILJØFREMMEDE STOFFER HØJE NOK TIL AT KUNNE FORKLARE EFFEKTER? 82 6.7 HAR ÅLEKVABBENS FØDE-OG MILJØFORHOLD UNDERGÅET EN ÆNDRING? 86 7 KONKLUSION OG ANBEFALINGER 87 8 REFERENCER 91 9 ORDLISTE 107 Bilag A Beskrivelse af M74 syndromet 109 Bilag B Sammenhæng mellem bioakkumulering ig toksicitet. Critical body residue konceptet. 111 4

Forord I 2001-2002 blev de første fund af misdannet ålekvabbeyngel fundet i Danmark. Siden har det været debatteret, hvorvidt forurening med miljøfarlige stoffer i det marine vandmiljø bidrager til disse effekter. Miljøstyrelsen har derfor i juli 2007 udbudt litteraturudredningsopgaven Kemiske stoffer, der kan føre til misdannelser i fisk - Indkredsning af stoffer ud fra deres biokemiske virkemekanismer Den iværksatte litteraturudredning skal føre til en forståelse og indkredsning af de miljøfarlige stoffer, der anses at kunne forårsage effekter, der kan føre til de misdannelser, der iagttages hos fisk med speciel fokus på den levendefødende art, ålekvabben. Bent Halling-Sørensen Aps v/ professor Bent Halling-Sørensen har udført denne opgave sammen med følgende danske aktører på området: Dansk Hydraulisk Institut (DHI), og Syddansk Universitet (SDU). Bent Halling-Sørensen Aps har været overordnet leder af projektet og har haft ansvar for tilvejebringelse af toksicitets data for metaller og lægemidler (kapitel 5). Følgende ansvarlige forfattere (først nævnte) og deltagere har bidraget til litteraturudredningen, som her anført: Dansk Hydraulisk Institut (DHI): ansvarlig for rapportering af effektmekanismer, toksicitetsdata for de organiske miljøfremmede stoffer (kapitel 4 og 5) samt for diskussionsafsnittet (kapitel 6) (Gitte Pedersen, Tina Slothuus, og Frank Stuer-Lauridsen). Syddansk Universitet (SDU): Fysiologisk beskrivelse af fisk, herunder ålekvabben (kapitel 3) (Professor Poul Bjerregaard og Karin Kinnberg). Projektets følgegruppe har haft følgende medlemmer: By og Landskabsstyrelsen (BLST): Lis Morthorst Munk (formand), Karin Dahlgren, Linda Bagge, og Jens Brøgger Jensen. Miljøstyrelsen (MST): Henning Ian Clausen. Danmarks Miljøundersøgelser (DMU): Jakob Strand. Miljøcenter Århus: Christian A. Jensen. Kommunernes Landsforening (KL): Erling Rørdam. Danmarks Fiskeriundersøgelser (DFU): Inger Dalsgaard. Projektlederen og de ansvarlige forfattere. Projektet er gået i gang i september 2007 og er blevet afsluttet ved årsskiftet 2007/8. Projektgruppen har undervejs været i kontakt med en række interessenter på området. De takkes hermed alle for deres positive medvirken. 5

6

Sammenfatning og konklusioner I nærværende rapport er det søgt at indsnævre gruppen af miljøfarlige kemikalier, hormoner og lægemidler, der er under mistanke for at være årsagen til de misdannelser man observere hos ålekvabben (Zoareces viviparus) i det danske marine miljø. Stofferne blev udvalgt på grundlag af miljøstyrelsens udredning Misdannet ålekvabbeyngel og andre biologiske effekter i danske vandoråder. Rapporten bygger derfor på den vidensramme som denne rapport har fremlagt. De udvalgte stoffer er: nonylphenol, bisphenol A, DEHP, PCB (31 og 105), ó p-ddt, TBT, naphtalen, phenanthren, pyren, benzo(a)pyren, TCDD, arsen, bly, cadmium, krom, kobber, kviksølv, nikkel, flutamid (anti-androgen), fulvestrant (anti-androgen), tamoxifen (anti-østrogen), citalopram (serotonin genoptagelseshæmmer potentiel aromatasehæmmer), fluoxetin (serotonin genoptagelseshæmmer potentiel aromatasehæmmer), 17β-østradiol, østron 17α-ethinyl-østradiol og testosteron. Rapporten har derfor samlet viden fra litteraturen med henblik på kemikaliers virkemekanismer hos fisk. Videre er dosis-respons sammenhænge vurderet med specielt sigte på levendefødende arter, herunder rapportere fastsatte NOEC/NOEL niveauer fra litteraturen. Generelle hormonelle, teratogene, mutagene og genotoksiske effekter på fisk, der kan føre til de beskrevne deformiteter, er også præsenteret i rapporten. Udfra den indsamlede viden forsøger rapporten at belyse/forklare de observerede deformiteter hos levendefødende fiskearter, herunder ålekvabben, og samtidigt forsøge at indsnævre gruppen af stoffer, som er mistænkt for at være årsag til de observerede misdannelser. Rapporten konkluderer, at følgende stoffer (16 ud af 27) er rapporteret i litteraturen til under laboratorieforsøg, at kunne inducere en eller flere former for deformitetsdannelse i forskellige fiskarter: nonylphenol, bisphenol A, PCB31, PCB105, ó p-ddt, TBT, naphtalen, phenanthren, pyren, benzo(a)pyren, TCDD, bly, cadmium, kobber, kviksølv, og tamoxifen. De øvrige stoffer er ikke i den gennemgåede litteratur rapporteret til at kunne skabe deformiteter hos fisk eksponeret for disse i laboratorieforsøg. For hormoner og lægemidler findes der ikke data, der gør, at man kan gennemføre egentlige beregninger om hvorvidt disse stoffer når op på en koncentration, der gør dem potentielt deformitetskabende på fisk, mens tidligere rapporter har vist, at disse stoffer potentiel ud fra deres stofspecifikke egenskaber kan frembringe sådanne effekter. Dog er stofferne kun målt i ferskvandsmiljøet i Danmark. Rapporten konkluderer videre, at ålekvabben er en følsom organisme overfor miljøpåvirkninger, herunder eksponering med miljøfarlige stoffer. Der kan som for andre fiskearter være enkelte problemer i at adskille indflydelsen fra de miljøfarlige stoffer i forhold til andre miljøpåvirkninger såsom vitaminmangel, lipidmangel og ændringer i nærringsalte samt iltkoncentration. 7

Der er visse faktorer i levendefødende fisks fysiologi, der tyder på, at fiskearter, der føder levende unger, eksponerer deres yngel for 10 gange højere koncentration end tilsvarende hos æglæggende arter. Vetellogenin er rapporteret til at være en velegnet transportør af flere af de miljøfarlige stoffer. Ved at benytte en metode til at omregne effektkoncentrationer under laboratorieforsøg for deformitetsdannelse til en intern koncentration i fisk (Critical Body Residue, CBR) kan man sammenligne den målte koncentration i fisk. Herved er det blevet identificeret at, kobber og kviksølv er de mest potente, hvor den højst målte koncentration i voksne skrubber og torsk hver især overstiger den beregnede CBR LOEC værdi for stoffet. For TBT, bly, cadmium og dioxin findes den maksimale koncentration målt i skubber og torsk inden for en faktor 10 af den beregnede CBR LOEC værdi så det kan på grund af usikkerheden i de foretagne beregninger ikke udelukkes individuelt at have en deformitetsskabende effekt. 17β-østradiol og østron kan også hæmme oocytdannelsen, men da der ikke foreligger målte koncentrationer i fisk, kan en tilsvarende beregning ikke foretages for disse stoffer. PAHerne ikke kan undergå samme regnemåde som de andre stoffer, hvor der er rapporteret deformitetsdannelse på fiskeyngel, da de hurtigere metaboliseres i fisk. Herved kan man ikke kan måle dem nævneværdigt i fiskevæv. Derimod udviser de en CBR LOEC for deformntetsdannelse på niveau med andre stoffer der viser sig at være deformitetsskabende (kritisk intern effektdosis for deformitetsdannelse på 0,62-1,84 mmol/kg vådvægt for zebrafisk, torsk, sild og pighvarre) og kan derfor ikke kvalitativ udelukkes. Det er ikke med eksisterende toksiskologiske beregningsmetoder for blandinger muligt at vurdere blandinger af omtalte specifiktvirkende stoffer og dermed beregne ét, samlet udtryk for summen af de forskellige miljøfarlige stoffers potentiale mht. dannelse af deformiteter hos fisk. Imidlertid er det ikke mindre påkrævet at være særdeles opmærksom på muligheden for, at de forskellige miljøfarlige stoffer kan have en samlet effekter, der ikke ses, når stofferne betragtes enkeltvis. 8

Summary and conclusions A number of chemicals, hormones and pharmaceuticals that are anticipated to couse the development of deformities observed in the eelpout (Zoarces vivparus) in the Danish marine environment has been assessed. The compounds were selected as a result of the conclusions draw in the report Misdannet ålekvabbeyngel og andre biologiske effekter i danske vandoråder published by the Danish Environmental Protection Agency. The compounds were: nonylphenol, bisphenol A, DEHP, PCB (31 og 105), ó p-ddt, TBT, naphtalene, phenanthrene, pyrene, benzo(a)pyrene, TCDD, arsene, lead, cadmium, chromium, copper, mercury, nickel, flutamide (anti-androgen), fulvestrante (anti-androgen), tamoxifen (antiestrogen), citalopram (Selective serotonin reuptake inhibitors potentiel aromatase inhibitor), fluoxetin (Selective serotonin reuptake inhibitors potential aromatase inhibitor), 17β-oestradiol, oestron, 17α-ethinyl-oestradiol and testosteron. Data and informations on the mode-of-action (MOA) on fish species of the different compounds were collecting from the literature. Further more doseresponds relationships indicating also the NOEC/NOEL level obtained from literature are presented for the compounds. Informations on hormone effects, teratogenicity, mutagenicity and genotoxic effects of the compounds are also presented. Using these informations the report tries to explain and calculate if exposure of certain xenobiotics can be the explanation of the the observed deformities that we see in e.g. the eelpout (Zoarces viviparous). The report concludes that the following compounds (16 out of 27) are in the literature reported under laboratorie conditions to induce deformities in different fish species: nonylphenol, bisphenol A, PCB31, PCB105, ó p-ddt, TBT, naphtalene, phenanthrene, pyrene, benzo(a)pyrene, TCDD, lead, cadmium, copper, mercury, and tamoxifen (pharmaceutical). The remaining compounds has not in the literature used for this report been reported to induce deformities I fish species. For the steorid estrogens and pharmaceuticals the literature does not contain data and obeservations that allow calculating if they have the potential of inducing deformities in fish species. But as they are ealier reported to posses compound specific properties that potential make them interesting and because that also earlier has been measured in the Danish fresh water environment they can not be discluded. It is possible to conclude that eelpout (Zoarces viviparous) is a sensitive fish species to be use to assess an impact to the environment, including exposure of chemicals. As for other fish species it can be difficult to conclude wheter observations always may be directly linked to a chemical exposure. Other factors such as vitamin -, and lipid deficientcy, changes in nutrient level and oxygen level may also show impact on the fishes. 9

Some factors in fish physiology indicate that fish species that are livebearing fish and give birth to free swimming fry were the offspring develops inside the female fish expose their offspring with 10 times higher levels of toxicants compared to egg-laying fish species. Further more vitelloginin seems to be an effective transporter of toxicants from mother-to-young. Using the Critical Body Residue (CBR) approach that calculates the body burden in the fish of a specific compound - in this case due to the lowest reported exposure concentration of the compound reported in the literature - it was possible to assess the chemical dose that potential is needed to induce a deformity in a fish species of a given compound. With the above methiond approach it was found that for both copper and mercury the measured concentrations level of both heavy metals was higher than the calculated CBR LOEC values for several fish species. This indicates for both compounds that they invidually may induce development of deformities. Further more it was estimated that TBT, lead, cadmium and dioxin was measured in fish species at a concentration level 10 times lower than the calculated CBR LOEC values and therefore can not be discluted for possible inducing deformities in fish species. PAH compounds are metabolised heavyly in fish species why it is impossible to use the above CBR approach. Eventhough it is important to emphasiz that it has been shown that PAHs are able to induce deformities in several fish species. Using the excisting knowledge and calculation methods it is not yet possible to assess mixtures of the above methiond compounds and calculate a total potential chemical load that could induce the observed deformities. This is primaryly because the compounds all acts by different specific mode of actions and therefore can not be treated using e.g. additivety models. But at the same time it is clearly important to emphasis that in the given situation where more compounds are present that possibly may have at least similar effects inducing deformities mixture toxicity may not be disregarded. 10

1 Baggrund Miljøstyrelsen har tilvejebragt udredningen Misdannet ålekvabbeyngel og andre biologiske effekter i danske vandområder. Rapporten konkluderede, at en gennemgang og analyse af de af eksisterende data for misdannelser hos ålekvabbeyngel viste, at årsagen til misdannelserne med stor sandsynlighed skyldtes de kystnære farvandes belastning fra menneskelig og industriel aktivitet. Med den nuværende viden kan der i dag imidlertid ikke peges entydigt på årsagen eller kilden til de fundne misdannelser i ålekvabbeyngel i de danske fjorde. Ålekvabben har i en årrække været anvendt som markør for miljøtilstand bl.a. i det nationale program for overvågning af vandmiljøet og naturen NOVANA. Evnen til at producere levedygtigt afkom kan anvendes som markør for fiskenes generelle sundhedstilstand, idet en belastning af havmiljøet med miljøfarlige stoffer kan resultere i nedsat levedygtigt afkom. Som miljøfarlige stoffer kan nævnes olierester, klorerede organiske forbindelser, tungmetaller samt hormonlignende stoffer. Men også andre påvirkninger, såsom iltsvind, kan give effekter som en tidlig død under fiskeynglens udvikling. Ålekvabben (Zoarces vivparus) er særligt egnet til denne type undersøgelse, da hunnerne føder levende unger. Samtidig anses ålekvabben for at være en stationær fisk, hvad der gør det muligt at sammenholde de biologiske effekter med påvirkningerne i lokalområdet. De enkelte kuld, der er på op til 300-400 unger, udvikles i en rugepose inde i hunnen, indtil de først på året gydes som små færdigudviklede fisk. Ved at fange de drægtige hunner sent på året er det derfor muligt at undersøge hele kuld for mulige effekter og skader. Karrebæk Fjord er det område i Danmark, hvor der er observeret det højeste antal af forskellige typer af misdannelser hos ålekvabben. Her finder man, at mere end 5 % af ungerne i hvert kuld har udviklet en eller anden form for misdannelse, hvilket tyder på, at området er påvirket af miljøfarlige stoffer. Dette understøttes yderligere af undersøgelser af blåmuslinger i fjorden, hvor niveauet for de mistænkte typer af tungmetaller og andre miljøfremmede stoffer er forhøjede i forhold til fastlagte grænseværdier. Tilsvarende svenske undersøgelser har vist, at kun 0-2 % hunner fra upåvirkede områder har yngel med højere end 5 % egentlige misdannelser. Dette niveau er kun fundet i Danmark ved Knudshoved Odde i 2003. Området betragtes som værende et af de mindst forurenede områder i landet. DMU udførte i perioden 2001-2002 tilsvarende undersøgelser på ålekvabber i hele Danmark. I denne undersøgelse blev der i de forurenede områder fundet op til 40 % hunner, hvor flere end 5 % af afkommet var døde og op til 53 % af hunnerne bar yngel, hvor flere end 5 % af afkommet havde udviklet egentlige misdannelser (Strand et al., 2004). I udredning om Misdannet ålekvabbeyngel og andre biologiske effekter i danske vandområder, blev der skabt overblik over eksisterende data for kemikaliebelastningen i 7 udvalgte områder. Dette projektets resultater konkluderede, at det kunne være nyttigt med en yderligere viden om de 11

virkemekanismer, som de identificerede kemikalier har, og som er særligt interessante i relation til den videre problemløsning om kemikalier, som forårsager misdannelser i fisk. Det er kendt fra litteraturen, at miljøfarlige stoffer som klorerede organiske forbindelser, PAH, pesticider, tungmetaller og stoffer med hormonforstyrrende effekter, alle kan medføre forskellige former for misdannelser hos fiskeembryoner og fiskeyngel. Hos gravide ålekvabbehunner er det vist under både laboratorie- og feltundersøgelser, at hormonforstyrrende stoffer såsom octylphenol, ethinyløstradiol og phytosteroler forekommer i ovarievæsken og formodentlig påvirker fostre. En gennemgang af lægemidler anvendt i Danmark peger på, at der er aktivstoffer med virkninger på hormon- og enzymsystemer, som gør dem relevante at undersøge i relation til misdannelser i ynglen. Det drejer sig om de antiepileptiske lægemidler valproinsyre, carbamazepin, oxcarbazepin og ethosuximid, som hæmmer aromatasen (enzymsystemet, der regulerer hormondannelsen i vertebrater) og de såkaldte selektive serotonin genoptagelseshæmmere (SSRIs), som hæmmer serotonin genoptagelsen. En række anti-cancermidler, antibiotika og antivirale lægemidler har teratogene og gentoksiske effekter på mennesker. På hospitaler kan koncentrationen af anticancermidler i spildevand formodentligt være betydelig. De faglige rapporter fra DMU, nr. 585 og nr. 639 (2006; 2007), rapporterer måleniveauet af miljøfarlige stoffer i marint sediment, i fisk, fiskegalde og ovarievæske fra fisk fanget i det marine vandmiljø (Ærtebjerg (Ed), 2007). Desuden bidrager data fra Århus havn til at skabe overblik over miljøtilstanden af miljøfarlige stoffer i fisk. Nærværende projekt har derfor haft til formål, med udgangspunkt i MSTs tidligere gennemførte literaturudredning om ålekvabben, at gennemgå de stoffer der er under mistanke for deres mulige iboende virkemekanismer, og som kan medføre misdannelser i fisk. Specielt er der blevet sat fokus på viden om fisk, der føder levende unger, herunder ålekvabben. På denne baggrund søger nærværende rapport at indsnævre gruppen af de stoffer, der er under mistanke for at være årsagen til misdannelser. Der er sat speciel fokus på de organiske miljøfremmede stoffer, tungmetaller, hormoner og udvalgte lægemidler, som er blevet identificeret i MSTs tidligere udredning om ålekvabben, samt den nærværende rapports indsamlede viden fra litteraturen, alt med henblik på: - kemikaliers virkemekanisme hos fisk, - dosis-respons sammenhænge hos fisk med specielt sigte på levendefødende arter, herunder rapportere fastsatte NOEC/NOEL niveauer indsamlet fra litteraturen for de stoffer, der blev identificeret i ålekvabbeprojektet, - at perspektivere effektniveauer hos fisk i relation til effektniveauer hos de mest følsomme andre akvatiske organismer, - via litteraturen at undersøge om generelle hormonelle, teratogene, mutagene eller genotoksiske effekter på fisk kan føre til de beskrevne deformiteter, 12

- at anvende den allerede indsamlede viden fra MST s ålekvabbeprojekt i nærværende rapports vidensramme. og endeligt - at forsøge ud fra ovenstående oplysninger at belyse/forklare de observerede deformiteter hos levendefødende fiskearter, herunder ålekvabben, og samtidig forsøge at indsnævre gruppen af stoffer, som er mistænkt for at være årsag til de observerede misdannelser. Rapporten er inddelt i følgende kapitler: Kapitel 2 giver rationalet bag valget af de undersøgte miljøfarlige stofgrupper. Kapitel 3 beskriver de fysiologiske forskelle mellem levendefødende og æglæggende benfisk, med særlig henblik på ålekvabben. I kapitel 4 beskrives mulige årsager til deformitetsdannelser hos fisk. Endeligt giver kapitel 5 en beskrivelse om miljøfremmede stoffers (valgt i kapitel 2) iboende virkemekanismer hos fisk. De enkelte kapitlers delkonklusioner diskuteres i kapitel 6 og hovedkonklusioner trækkes op i kapitel 7. 13

14

2 Valg af miljøfarlige stoffer 2.1 Stofferne På baggrund af resultaterne opnået i projektet Litteraturudredning om misdannet ålekvabbeyngel og andre biologiske effekter i danske vandområder blev en række miljøfarlige stoffer udvalgt til den videre undersøgelse. Udvælgelsen bygger på den udførte kildeanalyse for 7 forskellige lokaliteter i Danmark, hvor deformerede ålekvabber tidligere er observeret. Alle de udvalgte miljøfarlige stoffer er valgt, fordi der foreligger en formodning om, at de muligvis kunne bidrage til de observerede deformiteter, der ses på ålekvabben og som ikke kunne udelukkes at forekomme i det marine miljø i Danmark. Stofferne, som både er organiske industrikemikalier, metaller, udvalgte lægemidler og hormoner, er vist i tabel 2.1 Tabel 2.1 Stoflisten over de miljøfarlige stoffer, der vurderes i denne rapport. ORGANISKE MILJØFREMMEDE STOFFER Nonylphenol Bisphenol A Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) Polyklorerede bifenyler (PCB) Dichlordiphenyltrichlorethan (ó p-ddt) Tributyltin (TBT) Naphtalen Phenanthren Pyren Benzo(a)pyren Dioxinlignende stoffer (fx TCDD) Metaller Arsen Bly Cadmium Krom Kobber Kviksølv Nikkel Lægemidler (virkemekanisme) Flutamid (anti-androgen) Fulvestrant (anti-androgen) Tamoxifen (anti-østrogen) Citalopram (serotonin genoptagelseshæmmer potentiel aromatasehæmmer) Fluoxetin (serotonin genoptagelseshæmmer potentiel aromatasehæmmer) Steroid hormoner 17β-østradiol Østron Ethinyløstradiol Testosteron 15

De organiske miljøfremmede stoffer: En række miljøfremmede stoffer med BTP egenskaber såsom, nonylphenol, bisphenol A, DEHP, PCB, ó p-ddt, TBT, naphtalen, phenanthren, pyren, benzo(a)pyren og TCDD er udvalgt. TCDD er en ofte anvendt repræsentant for de dioxinlignende stoffer. Stofferne er valgt ud fra litteraturoplysninger om, at de i laboratorieforsøg har vist at kunne inducere deformiteter hos fisk. Flere af stofferne har hormonforstyrrende egenskaber (se kapitel 5). Endvidere er de fleste af disse stoffer målt i det danske marinemiljø. Flere af stofferne måles i det nationale program for overvågning af vandmiljøet og naturen NOVANA. Metallerne: De traditionelle (tung)metaller bly, cadmium, kviksølv, samt arsen, krom, kobber og nikkel er udvalgt primært, fordi litteraturen også rapporterede, at flere af stoffer kunne inducere deformiteter på fisk. Endvidere forefindes der danske målinger af koncentrationsniveauet for flere af stofferne i fiskearter. Lægemidler: Der er udvalgt 5 lægemiddelstoffer, der alle har en hormonforstyrrende effekt og de findes alle i behandlet spildevand i en koncentration på mellem 0,1 1 µg/l. Stofferne (virkemekanisme) er flutamid (antiandrogen), fulvestrant (anti-androgen), tamoxifen (anti-østrogen), citalopram (serotonin genoptagelseshæmmer potentiel aromatasehæmmer i fisk), og fluoxetin (serotonin genoptagelseshæmmer potentiel aromatasehæmmer). Tamoxifen er i litteraturen rapporteret for at have hormonforstyrrende egenskaber på fisk under laboratoriekonditioner. Både citalopram og fluoxetin er i flere studier vist sig at have reproduktionsforstyrrende egenskaber hos fisk. Lægemiddelstoffer er dog aldrig forsøgt målt i det marine miljø. Hormoner: 17β-østradiol, østron og testosteron er valgt som modelstoffer i denne klasse, da det vides, at stofferne regulerer steroidgenesen hos fisk og er potentielle stoffer, der kan deltage i en deformitetsdannelse hos fisk. I Danmark er der aldrig moniteret for disse stoffer, men det vides, at de findes i sedimentet i ferskvand i Danmark i et koncentrationsniveau på 30-1160 ng E2 equv / kg Ts (MST rapport nr. 977, 2005). Desuden mistænktes en ubalance i steroidgenesen at kunne medvirke til, formentligt i kombination med andre faktorer såsom miljøfarlige stoffer og en øget vitalogenin koncentration, at inducere deformitetsdannelser hos fisk. 16

3 Fysiologiske forskelle mellem levendefødende og æglæggende benfisk især med henblik på ålekvabben 3.1 Levendefødende fisk Langt de fleste benfisk er æglæggende (ovipare). De frigiver æg og sæd i det omgivende vand, hvorefter befrugtningen og den videre udvikling sker uden for moderfisken. Andre benfisk føder levende unger (er vivipare), hvor befrugtningen og den efterfølgende udvikling af embryoner foregår i moderfiskens ovarium. Kun omtrent 510 af de anslåede 20.000 arter af benfisk (2-3 %) er levendefødende (Wourms, 1981). Disse arter forekommer i 14 ud af 425 familier af benfisk (Wourms, 1981). Ålekvabben er den eneste benfisk i danske farvande, som er levendefødende. Da den levendefødendes reproduktionsform sjældent ses blandt primitive arter, betragtes den som en specialisering og videreudvikling af reproduktionen ved æglægning (Wourms et al., 1988). Udvikling af embryoner hos levendefødende benfisk finder altid sted i ovariet. Næsten alle levendefødende benfisk har kun ét hult ovarium (Nagahama, 1983; Wourms et al., 1988) i modsætning til de æglæggende benfisks todelte rogn. Ovariet er indesluttet i en sæk dannet af folder i bughinden, og omgivet af et eller flere lag af vaskulariseret bindevæv og glatte muskler. Ovariets hulrum er dækket af germinalt epitelvæv med follikler indeholdende æg (oocyter) i forskellige udviklingsstadier (Wourms et al., 1988). Udviklingsprocessen fra modent æg til levende unge kan hos benfisk inddeles i fire trin. Disse er: 1) ægløsning (ovulation), hvor det modne æg (eller embryo) forlader folliklen; 2) befrugtning, hvor æg og sædcelle fusionerer og udviklingen af embryonet begynder; 3) klækning, hvor embryonet forlader ægget; og 4) fødsel (hos æglæggende fisk: gydning), hvor embryonet (hos æglæggende fisk: ægget) forlader moderfisken (Fig. 3-1) (Wourms, 1981). Hos en typisk æglæggende benfisk er rækkefølgen tilsvarende: ægløsning, gydning, befrugtning og til sidst klækning. Hos levendefødende fisk er rækkefølgen den samme bortset fra at det sidste trin er fødslen. Hos ålekvabben er rækkefølgen således: ægløsning, befrugtning, klækning og fødsel. Her befrugtes æggene altså efter ægløsningen og embryonerne udvikles videre i ovariehulrummet (lumen). Intralumenal drægtighed er den fremherskende type udvikling hos levendefødende benfisk (Wourms & Lombardi, 1992). Alternativt kan befrugtningen gå forud for ægløsningen, så æggene allerede bliver befrugtet, mens de stadig er i folliklerne. Sekvensen er således enten: befrugtning, klækning, ægløsning og fødsel eller: befrugtning, ægløsning, klækning og fødsel, hvor embryonerne udvikles i folliklerne. Intrafollikulær drægtighed er også karakteristisk for levendefødende tandkarper såsom guppyer, platyer, sværddragere og mollyer. 17

Ørred: Ålekvabbe: Guppy: Æ-G-B...K Æ-B.K...F B...Æ-K-F Fig. 3.1. Rækkefølgen af processer i udviklingen fra modent æg til levende unge for den æglæggende ørred, den levendefødende ålekvabbe med intralumenal drægtighed og den levendefødende guppy med intrafollikulær drægtighed. Æ: ægløsning, G: gydning, B: befrugtning, K: klækning, F: fødsel. Levendefødende fisk kan også kategoriseres på baggrund af ernæringsmæssige forhold (Wourms, 1981). De kan inddeles i lecithotrofiske arter, hvor embryonerne får deres næring udelukkende fra blommereserver (ligesom embryoner af æglæggende arter) og matrotrofiske arter, hvor embryonerne supplerer deres blommereserver ved at optage yderligere næringsstoffer fra moderen under drægtigheden. I begge tilfælde tilfredsstiller moderen embryonernes respiratoriske (gasudveksling), osmoregulatoriske (saltregulering) og ekskretoriske (udskillelsen af affaldsstoffer) behov. Hos levendefødende benfisk etableres en moder-foster relation under drægtigheden, hvor kemikalier kan overføres fra moder til afkom. Der er dog ingen egentlig moderkage som hos pattedyr (Schindler & Hamlett, 1993). Graden af specialisering af ovarievævet afhænger især af, om der er tale om intralumenal eller intrafollikulær drægtighed, samt af mængden af æggeblommemateriale og længden af drægtighedsperioden (Turner, 1942). Hos ålekvabben findes på indersiden af ovariet ca. 1 cm lange tapper med rig blodforsyning. Disse tapper øger overfladearealet og letter udvekslingen af stoffer med ovarievæsken (Kristoffersson et al., 1973). Den metaboliske udveksling i embryoner finder sted over kroppens og tarmens epiteloverflader (Wourms et al., 1988; Wourms & Lombardi, 1992). Hos ålekvabbens embryoner anses en betydeligt forstørret endetarm med et hypertrofieret (overudviklet/forstørret) tarmepitel for at være det primære sted for absorption af næringsstoffer (Kristoffersson et al., 1973). 3.2 Ålekvabben Ålekvabben (Teleostei, Perciformes, Zoarcidae) forekommer hyppigt i de kystnære farvande (salt- og brakvand) i det nordlige Europa inklusiv i Danmark. Det er en stationær og bundlevende art, som lever blandt ålegræs, tang og alger. Den opholder sig typisk på lavt vand, men kan af og til om vinteren trække ud på dybere vand (ned til 40 m). Den lever af forskellige bunddyr som krebsdyr, orme, bløddyr, og af fiskeæg og -yngel. Når ungerne er født, bliver de ligesom forældrene på bunden af havet, hvor de lever af den samme føde som de voksne fisk. 18

Fig. 3.2. Voksen ålekvabbe (Foto: Jakob Strand). Ålekvabben (Zoarces viviparus) er, som artsnavnet indikerer, levendefødende (vivipar). Hunnen bliver kønsmoden som 2-årig (Vetemaa, 1999) og er derefter drægtig en enkelt gang årligt (Rasmussen et al., 2006). Drægtigheden varer ca. 5 mdr. (Vetemaa et al., 1997; Rasmussen et al., 2002; Gercken et al. 2006). Udvikling af æg (oogenesen) foregår i forårs- og sommermånederne, hvor blommeprotein (vitellogenin) inkorporeres i ægcellerne under vitellogenesen (æggeblommeproteindannelsen) (Mattsson et al., 2001; Korsgaard, 2006). Ægløsningen og befrugtningen finder sted umiddelbart efter hinanden sent i august til tidligt i september (Korsgaard, 1986; Vetemaa, 1999; Rasmussen et al., 2006). Omtrent en måned efter befrugtningen klækkes embryonerne og ligger, som tidligere nævnt, frit i ovariehulrummet omgivet af ovarievæske, men uden nogen direkte fysisk forbindelse til moderfisken (Kristoffersson et al., 1973; Korsgaard, 1983). Ungernes blommesækfase varer ca. en måned, hvor deres vækst hovedsageligt er afhængig af deres næringsrige blommesæk, men også til dels af næringsstoffer fra moderfisken (Korsgaard, 1986; 1992). Herefter og indtil fødslen følger en periode med intensiv vækst, hvor ungernes vækst og udvikling udelukkende afhænger af optagelse af næringsstoffer fra moderfisken via ovarievæsken. Næringsstoffer (aminosyrer, kulhydrater, lipider), kalcium og ilt transporteres fra moderfiskens blodbane til ovarievæsken, hvorfra ungerne så optager stofferne (Korsgaard, 1983; 1986; 1992; 1994). I januar-februar føder hunnen til op over 400 4-6 cm lange fuldt udviklede og kønsdifferentierede unger (Kosior & Kuczynski, 1997; Larsson et al., 2000: Rasmussen et al., 2006). De er mere glasklare, men ligner ellers de voksne fisk. Den naturlige kønsratio er 50 % hanner og 50 % hunner (Larsson et al., 2000). Ubefrugtede æg nyligt befrugtet æg uklækket embryon nyklækket embryon udviklet embryon voksen fisk med blommesæk 25. august 1. september 15. september 20. september 28. december kønsmoden som 2-årig Fig. 3.3. Udviklingstrin hos ålekvabben. Billeder af æg og embryoner samt datoer er fra Rasmussen et al., (2006); billedet af den voksen fisk er taget af Jakob Strand. Hos ålekvabben kan dødeligheden i et kuld unger bestemmes med stor nøjagtighed, idet selv døde unger vil være forholdsvis velkonserverede i ovariet (Jacobsson & Neuman, 1991). Samtidigt kan forekomsten af misdannelser, 19

vækstforandringer og kønsratio bestemmes for hvert kuld. Ved at sammenholde forekomsten af deformitetsdannelse hos ungerne med målinger for moderens indhold af giftstoffer samt hendes generelle sundhedstilstand kan man forudsige om det marine område er forurenet (Jacobsson et al., 1986; Vetemaa et al., 1997; Napierska & Podolska, 2006). 3.3 Kemikalieeksponering De tidlige stadier i benfisks livscyklus er typisk de mest følsomme over for kemikalieeksponering (McKim, 1977; Weis & Weis, 1987; von Westerhagen, 1988). Først og fremmest på grund af de mange kritiske begivenheder (f.eks. organdannelsen), der finder sted på meget kort tid under embryonernes udvikling. Organsystemer under udvikling har specifikke perioder, der især falder i de tidlige stadier af organdannelsen, hvor organer er mest følsomme for eksponering for teratogene stoffer. Sådanne stoffer vil i disse perioder resultere i en udvikling af et spektrum af de karakteristiske misdannelser (se kapitel 4). Når et organsystem først er færdigudviklet, er det ikke lige så følsomt for en kemikalieeksponering. Endvidere kan forskelle i følsomhed mellem de tidlige og senere stadier delvis skyldes forskelle i akkumulering af kemikalierne for eksempel på grund af ændringerne i vævssammensætning (vand, lipid, protein mv.). Fiskeæg har et højt lipidindhold i forhold til resten af fiskehunnens krop, hvorfor det kan forventes, at æggene vil indeholde højere koncentrationer af lipofile (fedtopløselige) kemikalier. I de tidlige livsstadier er aktiviteten af de enzymer, der er involveret i omdannelse og udskillelse af kemikalierne, samtidigt begrænset (Van Der Kraak et al., 2001). Fig. 3.4. Skematisk oversigt over de vigtigste begivenheder i ålekvabbens udvikling. dph: dage efter klækning. Modificeret efter Rasmussen et al., 2006. 3.3.1 Udvikling af ægceller Udviklingen af en ægcelle følger samme mønster, hvad enten der er tale om levendefødende eller æglæggende benfisk. Der skelnes mellem tre faser i ægcelleudviklingen: prævitellogenese (en reorganisering af cellekerne og 20