artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog

December 2014 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 24 (katalog nr. 4500263) 96 (katalog nr. 4500265) Version 1 Kvalitativ in vitro-diagnostik Til brug sammen med Rotor-Gene Q instrumenter 4500263, 4500265 1060171DA QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, TYSKLAND R2 1060171DA Sample & Assay Technologies

QIAGEN prøve- og analyse-teknologier QIAGEN er den førende leverandør af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og påvisning af indholdet i enhver biologisk prøve. Vore avancerede højkvalitetsprodukter og -service garanterer succes fra prøve til resultat. QIAGEN sætter standarder i: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nucleinsyre- og proteinanalyser microrna-undersøgelser og RNAi Automatisering af prøve- og analyse-teknologier Vor opgave er at bringe Dem i stand til at opnå enestående succes og gennembrud. For yderligere information, se www.qiagen.com.

Indhold Kit-indhold 4 Symbolforklaring 4 Opbevaring 5 Anvendelse 5 Begrænsninger ved produktanvendelsen 6 Teknisk service 6 Kvalitetskontrol 6 Advarsler og forholdsregler 7 Indledning 8 Princip 8 Patogeninformation 8 Ydelsesegenskaber 9 Analysefølsomhed 9 Specificitet 10 Præcision 13 Robusthed 16 Reproducérbarhed 16 Udstyr og reagenser, som leveres af bruger 17 Vigtige bemærkninger 18 Generelle forholdsregler 18 DNA-isolation 18 Intern kontrol 19 Protokol: PCR og dataanalyse 20 Vigtige anvisninger før start 20 Ting, der skal gøres før start 20 Procedure 20 Fejlfinding 31 Referencer 34 Bestillingsinformation 35 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 3

Kit-indhold artus HSV-1/2 RG PCR Kit (24) (96) Katalognr. 4500263 4500265 Antal reaktioner 24 96 Blå HSV-1/2 RG Master 2 x 300 µl 8 x 300 µl Gul HSV-1/2 RG Mg-Sol* 600 µl 600 µl Rød HSV-1 RG PC (100 cop/µl) 200 µl 200 µl Brun HSV-2 RG PC (100 cop/µl) 200 µl 200 µl Grøn HSV-1/2 RG IC 1000 µl 2 x 1000 µl Hvid Vand (PCR-grad) 1000 µl 1000 µl Håndbog 1 1 * Magnesiumopløsning. Positiv kontrol. Intern kontrol. Symbolforklaring <N> Indeholder reagenser til <N> tests Anvendes inden Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik Katalognummer Lotnummer Materialenummer Komponenter Indhold 4 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Nummerl Globalt varenummer Temperaturbegrænsninger Producent Se information i håndbogen Vigtig bemærkning Opbevaring Komponenterne i artus HSV-1/2 RG PCR Kit skal opbevares ved 15 til 30 C og er stabile indtil den udløbsdato, der er angivet på etiketten. Gentagne optøninger og nedfrysninger (>2 x) bør undgås, da dette kan reducere analysefølsomheden. Hvis reagenserne kun skal bruges med mellemrum, skal de nedfryses i alikvoter. Opbevaring ved 2 8 C bør ikke overstige en periode på 5 timer. Anvendelse artus HSV-1/2 RG PCR Kit er en realtids-baseret polymerasekædereaktionsanalyse (PCR) til detektion og udskillelse af humant herpes simplexvirus 1 og 2 DNA på Rotor-Gene Q-instrumenter efter fuldautomatisk oprensning af cerebrospinalvæskeprøver (CSF) fra HSV-inficerede personer ved hjælp af EZ1 DSP Virus Kit. artus HSV-1/2 RG PCR Kit må ikke bruges sammen med Rotor-Gene Q 2plex-instrumenter. artus HSV-1/2 RG PCR Kit er beregnet til brug i forbindelse med klinisk præsentation og andre laboratoriemarkører med henblik på sygdomsprognose. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 5

Begrænsninger ved produktanvendelsen Alle reagenser må udelukkende anvendes til in vitro-diagnostik. Produktet må kun anvendes af personale, som er specialuddannede og oplærte i in vitro-diagnostiske procedurer (EN375). Optimale PCR-resultater opnås kun ved at følge brugermanualen nøje. Man skal være opmærksom på udløbsdatoerne, der er trykt på alle komponenters æske og etiket. Brug aldrig for gamle komponenter. Teknisk service QIAGENs tekniske service leverer høj kvalitet og er altid til rådighed. De tekniske serviceafdelinger er bemandet med erfarne videnskabsmænd med omfattende praktisk og teoretisk erfaring inden for prøve- og analyseteknologier og i brugen af QIAGEN s produkter. Kontakt os gerne i tilfælde af spørgsmål eller vanskeligheder vedrørende artus HSV-1/2 RG PCR Kit eller QIAGENs produkter generelt. QIAGENs kunder er en vigtig kilde til information om avancerede eller specialiserede anvendelser af vore produkter. Denne information er en hjælp for andre videnskabsfolk, såvel som for forskerne ved QIAGEN. Vi vil derfor opfordre dig til at kontakte os, hvis du har forslag omkring produktydeevne eller nye anvendelser og teknikker. For teknisk bistand og yderligere information henvises til vort tekniske supportcenter på www.qiagen.com/support, eller De kan henvende Dem til en af QIAGENs tekniske serviceafdelinger eller lokale forhandlere (se bagsiden eller besøg www.qiagen.com). Kvalitetskontrol I overensstemmelse med QIAGENs ISO-certificerede kvalitetsstyringssystem testes hvert lot af artus HSV-1/2 RG PCR Kit efter fastlagte specifikationer for at sikre en ensartet produktkvalitet. 6 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Advarsler og forholdsregler Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, éngangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der henvises til de relevante sikkerhedsdatablade (SDS) for yderligere information. De findes online i bekvemt og kompakt PDF-format på www.qiagen.com/safety, hvor sikkerhedsdatabladene for hvert QIAGEN -kit og hver kit-komponent kan læses og udskrives. Prøve og analyseaffald skal bortskaffes i overensstemmelse med lokale sikkerhedsbestemmelser. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 7

Indledning artus HSV-1/2 RG PCR Kit udgør et brugsklart system til detektion af HSV-1 og HSV-2 DNA ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) på Rotor-Gene Q- instrumenter. HSV-1/2 RG Master indeholder reagenser og enzymer til specifik amplifikation af en 154 bp region af HSV-1 og HSV-2 genomer og til direkte detektion af det specifikke amplicon i fluorescenskanal Cycling Green (kilde 470 nm, detektor 510 nm) og Cycling Orange (kilde 585 nm, detektor 610 nm) af Rotor-Gene Q-instrumenterne. Desuden indeholder artus HSV-1/2 RG PCR Kit et andet heterologt amplifikationssystem til identifikation af eventuel PCR-hæmning. Dette detekteres som en intern kontrol (IC) i fluorescenskanal Cycling Yellow (kilde 530 nm, detektor 555 nm) på Rotor-Gene Q-instrumenter. Detektionsgrænsen for det analytiske HSV-1/2 RG PCR (se Analysefølsomhed, side 9) reduceres ikke. Eksterne positive kontroller (HSV-1 RG PC og HSV-2 RG PC) leveres. Princip Patogendetektion via polymerasekædereaktion (PCR) er baseret på amplifikation af specifikke områder af patogengenomet. Det amplificerede produkt detekteres i realtid PCR via fluorescerende farvestoffer. Disse er i reglen linket til oligonucleotidprober, der bindes specifikt til det amplificerede produkt. Monitorering af fluorescensintensiteterne under PCR-kørslen (dvs. i realtid) muliggør detektion og kvantificering af det akkumulerende produkt uden at behøve genåbne reaktionsglassene efter PCR-kørslen.* Patogeninformation Herpes simplex virus (HSV) findes i sårvæsker, spyt, cerebrospinalvæske (CSF) og vaginale sekreter. Det overføres primært ved direkte kontakt med sår og ved samleje samt perinatalt. Læsioner i hud og slimhinder i munden og genitalierne er kendetegnende for de fleste HSV-positive tilfælde. HSV-infektion kan være enten primær (> 90 % af disse tilfælde er asymptomatiske) eller recidiverende (sekundær). Primær infektion med HSV-1 kan blandt andet medføre gingivostomatitis, eczema herpeticum, keratoconjunctivitis og encephalitis; primær HSV-2 infektion forekommer blandt andet som vulvovaginitis, meningitis og generel herpes hos nyfødte. De primære symptomer på en sekundær infektion er hudlæsioner i næse, mund og genitale områder. Endnu mere alvorlige er de recidiverende former for keratoconjunctivitis og meningitis. *Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. 8 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

proportioner Ydelsesegenskaber Analysefølsomhed Til bestemmelse af analysefølsomheden for artus HSV-1/2 RG PCR Kit blev der opstillet en standard fortyndingsserie fra 10 til 0,001 kopier/µl, som blev analyseret på Rotor-Gene Q/6000 i kombination med artus HSV-1/2 RG PCR Kit. Testningen blev udført på 3 forskellige dage på 8 replika. Resultaterne blev bestemt via en probit-analyse. Analysebestemmelsesgrænsen for artus HSV-1/2 RG PCR Kit i kombination med Rotor-Gene Q/6000 er konsekvent 0,12 kopier/µl (p = 0,05) for HSV-1 og 0,16 kopier/µl (p=0,05) for HSV-2. Det vil sige, at der er 95 % sandsynlighed for, at 0,12 kopier/µl HSV-1 DNA eller 0,16 kopier/µl HSV-2 DNA vil blive detekteret. En grafisk illustration af probit-analysen for HSV-1 er vist i Figur 1 nedenfor; diagrammet over probitanalysen for HSV-2 et vist i Figur 2 0,8-0,93988 ~ 0,12 kopier/µl (95%) (0,06 0,31 kopier/µl) 0,6 0,4 0,2 log (dosis) Figur 1. Probit-analyse: HSV-1 (Rotor-Gene Q/6000). Analysefølsomhed for HSV-1 med artus HSV-1/2 RG PCR Kit på Rotor-GeneQ/ 6000. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 9

proportioner 0,8-0,79496 ~ 0,16 kopier/µl (95%) (0,095 0,37 kopier/µl) 0,6 0,4 0,2 log (dosis) Figur 2. Probit-analyse: HSV-2 (Rotor-Gene Q/6000). Analysefølsomhed for HSV-2 med artus HSV-1/2 RG PCR Kit på Rotor-Gene Q/ 6000. Specificitet Specificiteten for artus HSV-1/2 PCR Kit sikres først og fremmeste ved valget af primere og prober samt valget af stringente reaktionsbetingelser. Primerne og proberne blev kontrolleret for mulige homologier med alle publicerede sekvenser i genbanker via sekvenssammenligningsanalyse. Detektérbarheden for alle relevante genotyper er dermed blevet sikret via en databaseafstemning og via en PCR-kørsel på Rotor-Gene instrumenter med de stammer, der er angivet i Tabel 1. Desuden blev specificiteten valideret med 30 forskellige HSV-1 og HSV-2 negative CSF-prøver. Disse genererede ikke nogen signaler med HSV-1- og HSV-2-specifikke primere og prober, som medfølger i HSV-½ RG Master. En potentiel krydsreaktivitet for artus HSV-1/2 RG PCR Kit blev testet ved hjælp af den kontrolgruppe, der er angivet i Tabel 2. Ingen af de testede patogener viste sig reaktive. 10 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Tabel 1. Testning af specificiteten for relevante genotyper Virus Stamme Kilde HSV-1 (Cycling Green) HSV-2 (Cycling Orange) Intern kontrol (Cycling Yellow) HSV-1 HF ATCC* + + HSV-1 KOS INSTAND + + HSV-1 MacIntyre QCMD + + HSV-2 HG-52 NCPV + + HSV-2 G ATCC* + + HSV-2 MS QCMD + + * ATCC American Type Culture Collection. INSTAND Society for Promotion of Quality Assurance in the Medical Laboratories (Forening til fremme af kvalitetssikring i medicinske laboratorier). QCMD Quality Control for Molecular Diagnostics (Kvalitetskontrol for molekylær diagnostik). NCPV National Collection of Pathogenic Viruses (National samling af patogene virus). artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 11

Tabel 2. Testning af kittets specificitet med potentielt krydsreaktive patogener Kontrolgruppe Human herpesvirus 3 (varicella-zoster virus) Human herpesvirus 4 (Epstein-Barr virus) Human herpesvirus 5 (cytomegalovirus) HSV-1 (Cycling Green) HSV-2 (Cycling Orange) Intern kontrol (Cycling Yellow) + + + Human herpesvirus 6A + Human herpesvirus 6B + Human herpesvirus 7 + Human herpesvirus 8 (Kaposi s sarkom-associeret herpesvirus) + Hepatitis A virus + Hepatitis B virus + Hepatitis C virus + Human immundefektvirus (HIV) + Human T-celleleukæmi virus 1 + Human T-celleleukæmi virus 2 + Enterovirus + Parvovirus B19 + West Nile virus + 12 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Præcision Præcisionsdata for artus HSV-1/2 RG PCR Kit er blevet indsamlet ved hjælp af Rotor-Gene instrumenter og muliggør bestemmelse af analysens samlede varians. Den samlede varians består af variabilitet inden for analysen (variabilitet mellem multiple resultater for prøver med samme koncentration inden for ét eksperiment), variabilitet mellem analyserne (variabilitet mellem multiple resultater for den analyse, der genereres på forskellige instrumenter af samme type af forskellige operatører inden for et laboratorium) og variabilitet mellem batches (variabiliteten mellem multiple resultater af analysen ved brug af forskellige batches). De indhentede data blev brugt til at bestemme standardafvigelse, varians og variationskoefficienten for den patogenspecifikke og den interne kontrol PCR. Præcisionsdata for artus HSV-1/2 RG PCR er blevet indsamlet ved hjælp af HSV-1 og HSV-2 DNA men en koncentration på 10 kopier/µl. Testning blev gennemført med 8 replika. Præcisionsdata blev beregnet baseret på C T værdierne af amplifikationskurverne (C T : Tærskelcyklus, se Tabel 3 og Tabel 4). Baseret på disse resultater er den samlede statistiske spredning af enhver given prøve med den nævnte koncentration 1,82 % (C T ) for HSV-1, 0,67 % (C T ) for HSV-2 og henholdsvis 1,24 % (C T ) og 1,58 % (C T ) for detektion af den interne kontrol. Disse værdier er baseret på totaliteten af alle enkeltværdier af den bestemte variabilitet. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 13

Tabel 3. Præcisionsdata for HSV-1 baseret på C T værdier Variabilitet inden for analysen: HSV-1 10 kopier/µl Variabilitet mellem analyser: Intern kontrol Variabilitet mellem analyser: HSV-1 10 kopier/µl Variabilitet mellem analyser: Intern kontrol Variabilitet mellem batches: HSV-1 10 kopier/µl Variabilitet mellem batches: Intern kontrol Samlet varians: HSV-1 10 kopier/µl Samlet varians: Intern kontrol C T værdi Standardafvigelse Variationskoefficient (%) 30,46 0,25 0,81 25,29 0,08 0,3 29,69 0,69 2,05 24,97 0,31 1,25 29,95 0,40 1,35 24,90 0,30 1,20 29,91 0,55 1,82 24,99 0,31 1,24 14 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Tabel 4. Præcisionsdata for HSV-2 baseret på C T værdier Variabilitet inden for analysen: HSV-2 10 kopier/µl Variabilitet mellem analyser: Intern kontrol Variabilitet mellem analyser: HSV-2 10 kopier/µl Variabilitet mellem analyser: Intern kontrol Variabilitet mellem batches: HSV-2 10 kopier/µl Variabilitet mellem batches: Intern kontrol Samlet varians: HSV-2 10 kopier/µl Samlet varians: Intern kontrol C T værdi Standardafvigelse Variationskoefficient (%) 29,85 0,15 0,50 25,17 0,39 1,55 29,92 0,15 0,49 25,11 0,41 1,63 29,80 0,23 0,79 24,89 0,33 1,32 29,88 0,20 0,67 25,07 0,40 1,58 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 15

Robusthed Verifikation af robustheden muliggør bestemmelse af den samlede svigtrate for artus HSV-1/2 RG PCR Kit. For at opnå meget lave virustitre for HSV 1 og HSV- 2 fik 30 negative CSF-prøver tilsat 0,36 kopier/µl elueringsvolumen HSV-1 eller 0,48 kopier/µl elueringsvolumen HSV-2 DNA (tre gange koncentrationen af analysefølsomhedsgrænsen). Efter ekstraktion med EZ1 DSP Virus Kit blev disse prøver analyseret med artus HSV-1/2 RG PCR Kit. Alle 30 prøver blev vurderet korrekt som svagt positive for hver af HSV-typerne, hvilket medførte en fejlrate på 0 %. Desuden blev den robusthed vurderet ved oprensning og analyse af 30 HSV-1 og HSV-2 negative CSF-prøver. Der detekteredes ingen hæmning af PCR, hvilket medførte en samlet fejlrate på 0 %. Dermed er robustheden for artus HSV-1/2 RG PCR Kit 99 %. Reproducérbarhed Reproducérbarhedsdata muliggør en jævnlig ydelsesvurdering af artus HSV-1/2 RG PCR Kit samt en effektivitetssammenligning med andre produkter. Disse data indhentes ved deltagelse i etablerede færdighedsprogrammer. 16 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Udstyr og reagenser, som leveres af bruger Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, éngangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes mere information i de tilhørende sikkerhedsdatablade (material safety data sheets, SDSs), som kan fås hos den pågældende leverandør. DNA-isolationskit (se DNA-isolation, side 18) Pipetter (justérbare)* Sterile pipettespidser med filtre Vortex-mixer* Bordcentrifuge* med rotor til 2 ml reaktionsglas Rotor-Gene Q eller Rotor-Gene instrument* med fluorescenskanaler til Cycling Green, Cycling Orange og Cycling Yellow Rotor-Gene Q software version 1.7.94 og derover (Rotor-Gene 6000 software version 1.7.65 og derover) Strip glas og hætter, 0,1 ml, til brug sammen med 72-brøndes rotor (kat. nr. 981103 eller 981106) Alternativt: PCR-rør, 0,2 ml, til brug sammen med 36-brøndes rotor (kat. nr. 981005 eller 981008) Køleblok (Indsætningsblok 72 x 0,1 ml glas, kat. nr. 9018901 eller Indsætningsblok 96 x 0,2 ml glas, kat. nr. 9018905) * Sørg for at instrumenterne kontrolleres og kalibreres efter producentens angivelser. artus HSV-1/2 RG PCR Kit må ikke bruges sammen med Rotor-Gene Q 2plex-instrumenter. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 17

Vigtige bemærkninger Generelle forholdsregler Brugeren skal altid være opmærksom på følgende: Brug sterile pipettespidser med filtre. Opbevar og ekstraher positive materialer (prøver, positive kontroller og amplicons) adskilt fra andre reagenser og tilsæt dem til reaktionsblandingen på et rumligt adskilt sted. Optø alle komponenter omhyggeligt ved stuetemperatur (15 25 C), før en analyse påbegyndes. Når komponenterne er optøet, blandes de (ved gentagen pipettering op og ned eller ved impulsvortex) og centrifugeres kort. Arbejd hurtigt og opbevar komponenterne på is eller i køleblokken (72/96- brøndes indsætningsblok). DNA-isolation EZ1 DSP Virus Kit (QIAGEN, kat. nr. 62724*) er valideret til viral DNAoprensning ud fra human CSF til brug sammen med artus HSV-1/2 RG PCR Kit. artus HSV-1/2 RG PCR Kit må ikke bruges ved phenol-baserede isolationsmetoder. Brug af bærer-rna er kritisk for ekstraktionseffektivitet og dermed for DNA-ydelse. Tilsæt den passende mængde bærer-rna til hvert ekstrakt i henhold til vejledningen i EZ1 DSP Virus Kit Håndbogen. Den interne kontrol af artus HSV-1/2 RG PCR Kit kan benyttes direkte i isolationsproceduren (se Intern kontrol, nedenfor). * EZ1 DSP Virus Kit fås også som CE-IVD-mærket EASYartus HSV-1/2 RG PCR Kits, kombineret med artus HSV-1/2 RG PCR Kit (se side 35 for bestillingsinformation). 18 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Intern kontrol En intern kontrol (HSV-1/2 RG IC) medfølger. Dette gør det muligt for brugeren både at kontrollere DNA-isolationsproceduren og at kontrollere for mulig PCRhæmning. Til dette formål tilsættes den interne kontrol til isolation i et forhold på 0,1 µl per 1 µl elueringsvolumen. For eksempel elueres DNA'et ved hjælp af EZ1 DSP Virus Kit i 60 µl Elution Buffer (AVE). Der skal altså 6 µl af den interne kontrol tilsættes i begyndelsen. Tilsæt ikke den interne kontrol og bærer-rna direkte til prøvematerialet. Den interne kontrol kan eventuelt bruges til at kontrollere for mulig PCRhæmning. Til denne anvendelse tilsættes den interne kontrol direkte til blandingen af HSV-1/2 RG Master og HSV-1/2 RG Mg-Sol som beskrevet i trin 2b af protokollen (side 21). artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 19

Protokol: PCR og dataanalyse Vigtige anvisninger før start Inden proceduren påbegyndes, læses Vigtige bemærkninger, side 18. Brug tid til at blive fortrolig med Rotor-Gene Q instrumentet,før protokollen påbegyndes. Se brugermanualen til instrumentet. Kontrollér, at de positive kontroller og en negativ kontrol (Water, PCRgrad) er inkluderet i hver PCR-kørsel. Ting, der skal gøres før start Kontrollér, at køleblokken (tilbehør til Rotor-Gene Q instrumentet) er forkølet til 2 8 C. Før hver anvendelse skal alle reagenser optøs helt, blandes (ved gentagen op- og nedpipettering eller ved hurtig vortex-blanding) og centrifugeres kort. Procedure 1. Anbring det ønskede antal PCR-rør i køleblokkens adaptere. 2. Hvis den interne kontrol bruges til at monitorere DNAisolationsproceduren og til at kontrollere for eventuel PCR-hæmning, følges trin 2a. Hvis den interne kontrol udelukkende bruges til at kontrollere for PCR-hæmning, følges trin 2b. Brug den interne kontrol i henhold til trin 2b til alle positive og negative kontroller. 2a.Den interne kontrol er allerede tilsat til isolationen (se Intern kontrol, side 19). I så fald klargøres en master-blanding i henhold til Tabel 5. Reaktionsblandingen indeholder typisk alle de komponenter, der kræves til PCR med undtagelse af prøven. 20 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Tabel 5. Klargøring af master-blanding (intern kontrol, der bruges til at monitorere DNA-isolation og kontrollere for PCR-hæmning) Antal prøver 1 12 HSV-1/2 RG Master 25 µl 300 µl HSV-1/2 RG Mg-Sol 5 µl 60 µl HSV-1/2 RG IC 0 µl 0 µl Mængde i alt 30 µl 360 µl 2b. Den interne kontrol skal tilsættes direkte til blandingen af HSV-1/2 RG Master og HSV-1/2 RG Mg-Sol. I så fald klargøres en masterblanding i henhold til Tabel 6. Reaktionsblandingen indeholder typisk alle de komponenter, der kræves til PCR med undtagelse af prøven. Tabel 6. Klargøring af master-blanding (intern kontrol, der bruges til at kontrollere for PCR-hæmning) Antal prøver 1 12 HSV-1/2 RG Master 25 µl 300 µl HSV-1/2 RG Mg-Sol 5 µl 60 µl HSV-1/2 RG IC 2 µl 24 µl Mængde i alt 32 µl* 384 µl* * Den mængdeforøgelse, der forårsages ved tilsætning af den interne kontrol, negligeres ved klargøring af PCR-analysen. Detektionssystemets følsomhed hæmmes ikke. 3. Pipettér 30 µl af masterblandingen i hvert PCR-rør. Tilsæt derefter 20 µl af det eluerede prøve-dna (se Tabel 7) og bland omhyggeligt ved at pipettere op og ned gentagne gange. Følgelig skal der bruges 20 µl af HSV-1 RG PC og HSV-2 RG PC som positive kontroller og 20 µl vand (vand af PCR-grad) som negativ kontrol. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 21

Tabel 7. Klargøring af PCR-analyse Antal prøver 1 12 Master-blanding 30 µl 30 µl hver Prøve 20 µl 20 µl hver Mængde i alt 50 µl 50 µl hver 4. Luk PCR-rørene. Kontrollér, at låseringen (tilbehør på Rotor-Gene instrumentet) placeres oven på rotoren for at forhindre utilsigtet åbning af glas og rør under kørslen. 5. Til detektion af HSV-1 DNA eller HSV-2 DNA oprettes en temperaturprofil i henhold til følgende trin. Indstilling af de generelle analyseparametre Figur 3, 4, 5 Indledende aktivering på hot-start enzymet Figur 6 Amplifikation af DNA'et Figur 7 Justering af fluorescenskanalens følsomhed Figur 8 Start af kørslen Figur 9 Alle specifikationer henviser til Rotor-Gene Q software version 1.7.94 og derover, Rotor-Gene 6000 software version 1.7.65 og derover. Yderligere information om programmering af Rotor-Gene instrumenterne kan ses i instrumenternes brugermanual. I illustrationerne er disse indstillinger indrammet med en fed, sort streg. Illustrationerne er inkluderet for Rotor- Gene Q instrumenter. 22 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

6. Åbn først dialogboksen New Run Wizard (guiden ny kørsel) med Advanced (avanceret) versionen (Figur 3). Kontrollér boksen Locking Ring Attached (låsering påsat) og klik på Next (næste). Figur 3. Dialogboksen New Run Wizard. 7. Vælg 50 for PCR-reaktionsvolumen og klik på Next (Figur 4). Figur 4. Indstilling af de generelle analyseparametre. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 23

8. Klik på knappen Edit Profile (rediger profil)i den næste New Run Wizard dialogboks (Figur 5) og programmér temperaturprofilen som vist i Figur 6 7. Figur 5. Redigering af profilen. Figur 6. Indledende aktivering af hot-start enzymet. 24 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Figur 7. Amplifikation af DNA'et. Sørg for at aktivere touchdown-funktionen for 10 cyklusser i hærdningstrinnet. 9. Fluorescenskanalernes detektionsområde skal bestemmes i henhold til fluorescensintensiteterne i PCR-rørene. Klik på Gain Optimisation i dialogboksen New Run Wizard (se, Trin 2) for at åbne dialogboksen Auto-Gain Optimisation Setup (Figur 8). Indstil kalibreringstemperaturen til 65 for at matche hærdningstemperaturen i amplifikationsprogrammet (Figur 7, Trin 4b). Sørg for, at alle tre kanaler (Green, Orange og Yellow) vælges ved Auto-Gain Optimisation. (Find kanalerne i drop down-menuen under Channel Settings (kanalindstillinger) og klik på Add (tilføj).) Klik på Start for at påbegynde gain-optimeringen. Klik på Close i dialogboksen Auto-Gain Optimisation Setup, når gainkalibreringen er færdig. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 25

Figur 8. Justering af fluorescenskanalens følsomhed. 26 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

10. Gain-værdier, der er bestemt ved kanalkalibrering, gemmes automatisk og er angivet i det sidste menuvindue af programmeringsproceduren (Figur 9). Klik på Start Run (start kørsel). Figur 9. Start af kørslen. 11. Når kørslen er færdig, analyseres data. Følgende resultater (11a, 11b, 11c, 11d, 11e, and 11f) er mulige. Eksempler på positive og negative PCR-reaktioner er angivet i Figur 10, Figur 11 og Figur 12. 11a.Et signal detekteres i fluorescenskanal Cycling Green. Resultatet af analysen er positiv: Prøven indeholder HSV-1 DNA. I så fald kan detektion af et signal i Cycling Yellow-kanalen undværes, idet høje indledende koncentrationer af HSV-1 DNA (positivt signal i Cycling Green-kanalen) kan medføre et reduceret eller helt manglende fluorescenssignal i den interne kontrol i Cycling Yellow-kanalen (konkurrence). 11b.I fluorescenskanalen Cycling Green detekteres intet signal. Samtidig vises der et signal fra den interne kontrol i Cycling Yellow-kanalen. Der kan ikke detekteres noget HSV-1 DNA i prøven. Den kan betragtes som negativ. I tilfælde af negativt HSV-1 PCR udelukker detektion af et signal i den interne kontrol muligheden for PCR-hæmning. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 27

11c.Et signal detekteres i fluorescenskanal Cycling Orange. Resultatet af analysen er positiv: Prøven indeholder HSV-2 DNA. I så fald kan detektion af et signal i Cycling Yellow-kanalen undværes, idet høje indledende koncentrationer af HSV-2 DNA (positivt signal i Cycling Orange-kanalen) kan medføre et reduceret eller helt manglende fluorescenssignal i den interne kontrol i Cycling Yellow-kanalen (konkurrence). 11d.I fluorescenskanalen Cycling Orange detekteres intet signal. Samtidig vises der et signal fra den interne kontrol i Cycling Yellowkanalen. Der kan ikke detekteres noget HSV-2 DNA i prøven. Den kan betragtes som HSV-2 negativ. I tilfælde af negativt HSV-2 PCR udelukker detektion af et signal i den interne kontrol muligheden for PCR-hæmning. 11e.Et signal detekteres i fluorescenskanalerne Cycling Green og Cycling Orange. Resultatet af analysen er positiv: Prøven indeholder både HSV-1 DNA og HSV-2 DNA. I så fald kan detektion af et signal i Cycling Yellow-kanalen undværes, idet høje indledende koncentrationer af både HSV-1 og HSV-2 DNA (positivt signal i Cycling Green- og Cycling Orange-kanalen) kan medføre et reduceret eller helt manglende fluorescenssignal i den interne kontrol i Cycling Yellow-kanalen (konkurrence). 11f.Intet signal detekteret i Cycling Green, Cycling Orange eller Cycling Yellow-kanalerne. Intet resultat kan konkluderes. Information vedrørende fejlkilder og afhjælpning af fejlene kan ses i Fejlfinding, side 31. 28 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Figur 10. Detektion af HSV-1 positiv kontrol (HSV-1 RG PC) i fluorescenskanalen Cycling Green. NTC: No template control (Ingen skabelonkontrol) (negativ kontrol). Figur 11. Detektion af HSV-2 positiv kontrol (HSV-2 RG PC) i fluorescenskanalen Cycling Orange. NTC: No template control (Ingen skabelonkontrol) (negativ kontrol). artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 29

Figur 12. Detektion af den interne kontrol (IC) i fluorescenskanalen Cycling Yellow med samtidig amplifikation af de positive kontroller (HSV 1 RG PC and HSV-2 RG PC). NTC: No template control (Ingen skabelonkontrol) (negativ kontrol). 30 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Fejlfinding Denne fejlfindingsguide kan være nyttig til at afhjælpe eventuelle problemer. For yderligere information henvises også til siden Frequently Asked Questions [Ofte stillede spørgsmål] hos vort Technical Support Center: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. Derudover svarer personalet fra QIAGENs tekniske service gerne på spørgsmål vedrørende enten informationen og protokollerne i denne håndbog eller prøve- og analyseteknologier (kontaktinformation: se bagsiden eller besøg www.qiagen.com). Kommentarer og forslag Intet signal ved positive kontroller (HSV-1 RG PC og HSV-2 RG PC) i fluorescenskanal Cycling Green eller Cycling Orange a) Den valgte fluorescenskanal for PCR dataanalyse stemmer ikke overens med protokollen For dataanalyse vælges fluorescenskanal Cycling Green og Cycling Orange for det analytiske HSV-1/2 PCR samt fluorescenskanal Cycling Yellow for den interne kontrol PCR. b) Ukorrekt programmering af temperaturprofilen for Rotor c) Ukorrekt konfiguration af PCR d) Opbevaringsbetingelserne for en eller flere kitkomponenter stemte ikke overens med de instrukser, der gives i Opbevaring (side 5) e) artus HSV-1/2 RG PCR Kit er udløbet Sammenlign temperaturprofilen med protokollen. Se Protokol: PCR og dataanalyse, side 20. Kontrollér arbejdstrinnene ved hjælp af pipetteringsplanen og gentag om nødvendigt PCR. Se Protokol: PCR og dataanalyse, side 20. Kontrollér opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen (se kittets etiket) for reagenserne og brug om nødvendigt et nyt kit. Kontrollér opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen (se kittets etiket) for reagenserne og brug om nødvendigt et nyt kit. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 31

Kommentarer og forslag Svagt eller intet signal fra den interne kontrol for en negativ CSFprøve, der underkastes oprensning ved hjælp af EZ1 DSP Virus Kit i fluorescenskanal Cycling Yellow og samtidigt manglende signal i kanal Cycling Green eller Cycling Orange a) PCR-betingelserne stemmer ikke overens med protokollen Kontrollér PCR-betingelserne (se ovenfor) og gentag om nødvendigt PCR med korrigerede indstillinger. b) PCR blev hæmmet c) DNA gik tabt under ekstraktion d) Opbevaringsbetingelserne for en eller flere kitkomponenter stemte ikke overens med de instrukser, der gives i Opbevaring (side 5) e) artus HSV-1/2 RG PCR Kit er udløbet Sørg for at benytte den anbefalede isolationsmetode og følg nøje producentens vejledning. Hvis den interne kontrol blev tilsat til ekstraktionen, kan et manglende signal fra den interne kontrol være tegn på tab af DNA under ekstraktionen. Sørg for at benytte den anbefalede isolationsmetode (se DNAisolation, side 18) og følg nøje producentens vejledning. Kontrollér opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen (se kittets etiket) for reagenserne og brug om nødvendigt et nyt kit. Kontrollér opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen (se kittets etiket) for reagenserne og brug om nødvendigt et nyt kit. 32 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Kommentarer og forslag Signaler med de negative kontroller i fluorescenskanal Cycling Green eller Cycling Orange for det analytiske PCR a) Der forekom kontamination under klargøring af PCR Gentag PCR med de nye reagenser i replika. Luk om muligt PCR-rørene direkte efter tilsætning af den prøve, der skal testes. sidst. Sørg for at pipettere de positive kontroller Sørg for, at arbejdsområde og instrumenter dekontamineres med jævne mellemrum. b) Der forekom kontamination under ekstraktion Gentag ekstraktionen og PCR af den prøve, der skal testes, med nye reagenser. Sørg for, at arbejdsområde og instrumenter dekontamineres med jævne mellemrum. artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 33

Referencer QIAGEN opretholder en stor, opdateret online-database over videnskabelige publikationer, der benytter QIAGENs produkter. Omfattende søgemuligheder gør det nemt at finde de artikler, der er brug for, enten ved en enkel søgning på nøgleord eller ved at specificere anvendelse, forskningsområde, titel, etc. En fuldstændig referenceliste kan fås ved at besøge QIAGENs referencedatabase online på www.qiagen.com/refdb/search.asp eller kontakte QIAGENs tekniske service eller den lokale forhandler. 34 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Bestillingsinformation Produkt Indhold Kat. nr. artus HSV-1/2 RG PCR Kit (24) For 24 reaktioner: Master, Mgopløsning, 2 Positive kontroller, Intern kontrol, Vand (PCR-grad) 4500263 artus HSV-1/2 RG PCR Kit (96) For 96 reaktioner: Master, Mgopløsning, 2 Positive kontroller, Intern kontrol, Vand (PCR-grad) 4500265 EZ1 DSP Virus Kit til oprensning af virale nucleinsyrer fra human CSF til in vitro diagnostiske formål EZ1 DSP Virus Kit Til 48 virale nucleinsyrepræparater: Forfyldte reagensbeholdere, éngangs filterspidsholdere, éngangs filterspidser, prøverør, elutionsrør, buffere, bærer-rna EASYartus HSV-1/2 RG PCR Kits til fuldt CE-IVDoverensstemmende integreret automatisk oprensning og patogendetektion EASYartus HSV-1/2 RG PCR Kit 1 Til 48 virale nucleinsyrepræparater og 24 analyser: 1 x EZ1 DSP Virus Kit, 1 x artus HSV-1/2 RG PCR Kit (24) 62724 EA10023 EASYartus HSV-1/2 RG PCR Kit 2 Til 48 virale nucleinsyrepræparater og 48 analyser: 1 x EZ1 DSP Virus Kit, 2 x artus HSV-1/2 RG PCR Kit (24) EA10024 Rotor-Gene Q og tilbehør Rotor-Gene Q 5plex HRM Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Realtids PCR-cykler og High Resolution Melt-analyseinstrument med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, karmoisinrød) plus HRM-kanal, laptop-computer, software, tilbehør, 1 års garanti på komponenter og arbejde Aluminiumblok til manuel reaktionsopsætning med en enkeltkanals pipette i 72 x 0,1 ml glas Aluminiumblok til manuel reaktionsopsætning i en standard 8 x 12-opstilling med 96 x 0,2 ml glas 250 strips med 4 glas og hætter til 1000 reagenser Forespørg 9018901 9018905 981103 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 35

Produkt Indhold Kat. nr. Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) PCR Tubes, 0,2 ml (1000) PCR Tubes, 0,2 ml (10000) 10 x 250 strips med 4 glas og hætter til 10.000 reagenser 1000 tyndvæggede rør til 1000 reagenser 10 x 1000 tyndvæggede rør til 10000 reagenser 981106 981005 981008 For opdateret licensinsinformation og produkt-specifikke ansvarsfraskrivelser henvises til den aktuelle QIAGEN kit håndbog eller brugermanual. QIAGEN kithåndbøger og brugermanualer er tilgængelige på www.qiagen.com eller kan rekvireres fra QIAGEN Teknisk Service eller din lokale forhandler. 36 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Denne side er med vilje tom artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 37

Denne side er med vilje tom 38 artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014

Denne side er med vilje tom artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog 12/2014 39

Med købet af dette produkt tillades det køberen at anvende det til at foretage diagnostiske services i forbindelse med human in vitro-diagnostik. Intet andet patent eller anden licens af nogen art ud over denne specifikke anvendelsesret fra købstidspunktet gives dermed. Varemærker: QIAGEN, artus, EZ1, EASYartus, Rotor-Gene (QIAGEN Group). artus HSV-1/2 RG PCR Kit og EZ1 DSP Virus Kit er CE-mærkede diagnostik-kits i overensstemmelse med det europæiske In Vitro Diagnostik-direktiv 98/79/EC. ikke tilgængelig i alle lande. Aftale om begrænset licens Brug af dette produkt betyder, at enhver køber eller bruger af artus HSV-1/2 RG PCR Kit accepterer følgende vilkår: 1. artus HSV-1/2 RG PCR Kit må kun anvendes i overensstemmelse med artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog og kun til brug sammen med komponenter indeholdt i Kittet. QIAGEN giver ingen licens, under nogen intellektuel ejendomsret, til at bruge eller inkorporere komponenterne i dette kit med komponenter, der ikke er inkluderet i dette kit, undtagen som beskrevet i artus HSV-1/2 RG PCR Kit Håndbog og yderligere protokoller, som er tilgængelige på www.qiagen.com. 2. Udover de udtrykkeligt givne licenser giver QIAGEN ingen garanti for, at dette kit, og/eller brugen af det, ikke overtræder tredjeparts rettigheder. 3. Dette kit og dets komponenter er under licens til engangsbrug og må ikke genbruges, genoprettes eller videresælges. 4. QIAGEN afviser specifikt alle andre licenser, udtrykte eller underforståede, end dem, der udtrykkeligt er angivet. 5. Køberen og brugeren af kittet indvilliger i ikke at tage, eller lade andre tage, skridt der kunne føre til, eller fremme, handlinger der forbydes ovenfor. QIAGEN kan håndhæve forbudene i denne begrænsede licensaftale i enhver ret, og vil inddrive alle undersøgelses- og retsomkostninger, herunder advokatsalærer, i ethvert søgsmål for at håndhæve denne begrænsede licensaftale samt alle deres intellektuelle ejendomsrettigheder i forbindelse med kittet og/eller komponenterne deri. For opdaterede licensbetingelser henvises til www.qiagen.com. 2009-2014 QIAGEN. Alle rettigheder forbeholdes.

www.qiagen.com Australia Orders 1-800-243-800 Fax 03-9840-9888 Technical 1-800-243-066 Austria Orders 0800-28-10-10 Fax 0800-28-10-19 Technical 0800-28-10-11 Belgium Orders 0800-79612 Fax 0800-79611 Technical 0800-79556 Brazil Orders 55-11-5079-4000 Fax 55-11-5079-4001 Technical 0800-557779 China Orders 800-988-0326 Fax 800-988-0329 Technical 800-988-0325 Denmark Orders 80-885945 Fax 80-885944 Technical 80-885942 Finland Orders 0800-914416 Fax 0800-914415 Technical 0800-914413 France Orders 01-60-920-926 Fax 01-60-920-925 Technical 01-60-920-930 Germany Orders 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Technical 02103-29-12400 Hong Kong Orders 800 933 965 Fax 800 930 439 Technical 800 930 425 Ireland Orders 1800 555 049 Fax 1800 555 048 Technical 1800 555 061 Italy Orders 800-789-544 Fax 02-33430-4826 Technical 800-787980 Japan Telephone 03-6890-7290 Fax 03-5547-0818 Technical 03-6890-7300 Korea (South) Orders 080-000-7146 Fax 1544 7146 Technical 1544 7145 Luxembourg Orders 8002-2076 Fax 8002-2073 Technical 8002-2067 Mexico Orders 01-800-7742-639 Fax 01-800-1122-330 Technical 01-800-7742-436 The Netherlands Orders 0800-0229592 Fax 0800-0229593 Technical 0800-0229602 Norway Orders 800-18859 Fax 800-18817 Technical 800-18712 Singapore Orders 1800-742-4362 Fax +65-68548184 Technical 1800-742-4368 Spain Orders +34-91-630-7050 Fax +34-91-630-5145 Technical +34-91-630-7050 Sweden Orders 020-790282 Fax 020-790582 Technical 020-798328 Switzerland Orders 055-254-22-11 Fax 055-254-22-13 Technical 055-254-22-12 UK Orders 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Technical 01293-422-999 1060171DA 148051793 Sample & Assay Technologies