B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack

B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack 3300759JAA(04) 2015-07 Dansk TILSIGTET BRUG BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack (BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis kompleks (DTB) direkte påvisning-reagenspakke), til brug med BD ProbeTec ET systemet, anvender SDA (Strand Displacement Amplification (amplifikation ved hjælp af strengforskydning))-teknologi til den direkte kvalitative påvisning af Mycobacterium tuberculosis kompleks DNA fra dekontaminerede, afkogte kliniske prøver fra luftvejene såsom spyt, induceret spyt, bronkiale skylninger og andre præparater fra luftvejene. BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Assay (BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis kompleks (DTB) direkte påvisning-analyse) er beregnet til brug som en direkte test til evaluering af præparater fra ubehandlede patienter, der formodes at have tuberkulose. Ubehandlede patienter er dem, der: (1) ikke har modtaget behandling for tuberkulose; (2) ikke har modtaget sådan behandling inden for de sidste 12 måneder; eller (3) har modtaget behandling i mindre end 7 dage. RESUMÉ OG FORKLARING Cirka en tredjedel af verdens befolkning er inficeret med Mycobacterium tuberculosis og er udsat for en 10 % risiko for at udvikle sygdommen gennem deres livstid. 1,2 Tuberkulose dræber omkring 3 millioner mennesker årligt verden over, hvilket gør tuberkulose til den førende dødsforårsagende smittefarlige sygdom. 1,3 M. tuberculosis organismens langsomme vækst forsinker klinisk diagnose og behandling, hvilket bidrager til spredning af sygdommen. U.S. Centers for Disease Control and Prevention (de amerikanske centre for sygdomskontrol og forebyggelse) (CDC) har anbefalet, at der skal gøres alt for, at laboratorier kan benytte de hurtigste metoder til at diagnosticere mycobakterier. 3 Anvendelse af DNA amplifikationsteknikker, såsom SDA, muliggør hurtig påvisning og identifikation af M. tuberculosis kompleks DNA i kliniske præparater og fremmer dermed hurtigere medicinsk indgriben. Mycobacterium tuberculosis kompleks (DTB) reagenspakken anvendes med BD ProbeTec ET systemet. Testsystemet anvender homogen SDA-teknologi som amplifikationsmetoden og fluorescensenergioverførsel (ET) som metoden til påvisning af tilstedeværelsen af Mycobacterium tuberculosis kompleks direkte fra dekontaminerede, afkogte præparater fra luftvejene (NALC-NaOH sedimenter). Mycobacterium tuberculosis komplekset består af M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum og M. microti. 4,5 PROCEDURENS PRINCIPPER BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) analysen er baseret på den samtidige amplifikation og påvisning af fokus-dna ved hjælp af amplifikationsprimere og en fluorescensmærket detektorprobe. 6-8 SDA reagenserne tørres i to separate mikrobrønde til engangsbrug. Det behandlede NALC-NaOH sediment tilsættes primermikrobrønden, som indeholder amplifikationsprimere, fluorescensmærkede detektorprober og andre reagenser. Efter inkubation overføres reaktionsblandingen til amplifikationsmikrobrønden, som indeholder to enzymer (en DNA polymerase og en restriktionsendonuklease), som er nødvendige for SDA. Amplifikationsmikrobrøndene forsegles for at forhindre kontaminering, og inkuberes i en varmekontrolleret fluorescensaflæser, som overvåger reaktionen for dannelsen af forstærkede produkter. Hver reaktion sam-forstærker og påviser en intern IAC (Internal Amplification Control [intern amplifikationskontrol]). Formålet med denne kontrol er at bekræfte gyldigheden af amplifikationsreaktionen og identificere potentiel hæmning fra det bearbejdede præparat. Resultater rapporteres gennem en algoritme som positive, negative eller inkonklusive. REAGENSER OG MATERIALER Hver BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex [DTB] Direct Detection Reagent Pack (BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis kompleks [DTB] direkte påvisning-reagentpakke) indeholder: DTB primermikrobrønde, 3 x 32: 4 oligonukleotider 7,6 pmol; dntp 37,6 nmol; detektorprober 30 pmol; syntetisk oligonukleotid 10.500 kopier DTB amplifikationsmikrobrønde, 3 x 32: Restriktionsenzym 25,5 enheder; DNA polymerase 8 enheder; dntps 10 nmol Tilbehør: 10 låg, 8 engangsposer, 16 forseglere Hvert BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen Processing Kit (BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis kompleks (DTB) direkte påvisning-præparatbearbejdningskit) indeholder: DTB vaskebuffer 1 225 ml opløsning indeholdende urea; CAPS buffer; dimethylsulfoxid; glycerol og natriumhydroxid. DTB lyseringsbuffer 2 50 ml opløsning af kaliumhydroxid: DTB neutraliseringsbuffer 3 150 ml opløsning indeholdende bicin, kaliumhydroxid, dimethylsulfoxid, glycerol og 0,03 % Proclin (konserveringsmiddel). Hvert BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Control Set (BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis kompleks [DTB] direkte påvisning-kontrolsæt) indeholder: DTB positiv kontrol - tørrede laksetest DNA 5 µg og 750 kopier af syntetisk oligonukleotid pr. reaktion 5250 totale kopier. DTB negativ kontrol tørrede laksetest DNA 5 µg. 1

Instrumenter, udstyr og materialer: BD ProbeTec ET instrument og instrumentplade, BD ProbeTec ET primer- og opvarmerapparat, BD ProbeTec ET oven (BD ProbeTec ET ovn) ovn eller almindelig laboratorieovn der er i stand til at opvarme prøven til 101 C ± 1 C i mindst 30 min. og højest 35 min, BD ProbeTec ET akustisk bad og akustisk badindsats, BD ProbeTec ET pipettor og strømforsyning, 2 ml prøveglasstativ, klart pipetteringsstativ, 2 ml prøveglas og hætter, 2 ml hætter og BD ProbeTec ET tilbehørskit, CultureSwab EZ podepinde. Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt: Mikrocentrifuge med aerosolindeholdende og stadardrotorer, der kan klare 12.200 x g (såsom Eppendorf model 5417C mikrocentrifuge) vortexmixer, engangshandsker, pipetter med aerosolresistente spidser,der kan levere volumener på 100 µl, 500 µl, 600 µl og 1 ml, 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox*, sterile beholdere, der kan rumme aliquoter med de 3 DTB buffere, ur, tuberkeldræbende desinfektionsmiddel, absorberende puder/gaze, kalibreret termometer. *Tilsæt 7,5 g Alconox til 1 L af en 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit og bland. Klargør frisk blanding dagligt. Krav til opbevaring og håndtering: DTB reagenspakker kan opbeva res ved 2 33 C. De uåbnede reagenspakker må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Så snart en pose åbnes, er mikrobrøndene stabile i 4 uger, hvis de forsegles korrekt, eller indtil udløbsdatoen, alt efter hvad der kommer først. Må ikke nedfryses. DTB bearbejdningsreagenser kan opbevares ved 2 33 C. Reagenserne må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Må ikke nedfryses. DTB kontroller kan opbevares ved 2 33 C. Kontroller må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Må ikke nedfryses. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER: Til in vitro diagnostik. 1. Foretagelse af denne test til påvisning af M. tuberculosis kompleks fra præparater, som ikke er fra luftvejene, inklusive men ikke begrænset til blod, CSF, fæces eller urin, er ikke blevet demonstreret. Foretagelse af BD ProbeTec ET DTB analysen er ikke blevet evalueret med præparater bearbejdet med metoder andre end dem, der er beskrevet i denne indlægsseddel. 2. Håndterings- og bearbejdningstrinene for præparater til og med varmeinaktiveringstrinet bør udføres i et Klasse II biologisk sikkerhedsskab (BSC). Præparatcentrifugering inden varmeinaktiveringstrinet bør kun foretages med den aerosolindeholdende rotor. Den aerosolindeholdende rotor bør kun åbnes i BSC. Anvend kun standardrotoren til centrifugering af præparater efter varmeinaktivering uden for BSC. 3. Dyrk alle bearbejdede præparater for at fastslå, om mycobakterier andre end tuberculosebakterier (MOTT) er til stede, foretag en antimycobakteriel følsomhedsundersøgelse, fastslå underarter af M. tuberculosis kompleks og/eller vurdér levedygdigthed. 4. Patogene mikroorganismer, herunder Hepatitis B-virus og human immundefekt virus (HIV), kan være til stede i præparater. Disse præparater skal derfor håndteres som værende smittefarlige ved brug af etablerede laboratorieprocedurer 9,10,11 og/eller instutionelle retningslinier. 5. Mikrobrønde, kontroller eller bearbejdningsbuffere fra kit med forskellige lotnumre må ikke ombyttes eller blandes. 6. Anvend fastlagt laboratoriepraksis ved bortskaffelse af brugte pipettespidser, prøveglas, primerlåg og andre engangsartikler. 7. Brug kun BD ProbeTec ET pipettor og BD ProbeTec ET pipettespidser til overførsel af bearbejdede prøver til primermikrobrønde og overførsel af prøver fra primermikrobrøndene til amplifikationsmikrobrøndene. 8. Reagensposer indeholdende ubrugte primermikrobrønde og amplifikationsmikrobrønde SKAL lukkes omhyggeligt igen efter åbning. Bekræft, at der findes et tørremiddel, inden reagensposerne lukkes. 9. Pladen indeholdende amplifikationsmikrobrønde SKAL være korrekt lukket med amplifikationsforsegleren, inden pladen flyttes fra BD ProbeTec ET primer- og opvarmerapparat til BD ProbeTec ET instrumentet. Lukning er nødvendig for at undgå kontaminering af instrumentet og arbejdsområdet med amplifikationsprodukter. Forseglingsmaterialet må ikke på noget tidspunkt fjernes fra mikrobrøndene. 10. Hvis en testplade overskrider 6 kolonner (> 48 prøver og kontroller) skal et HELT ark med amplifikationsforsegler anvendes for at forhindre mulig kontaminering. 11. Brug de vedlagte engangsposer til bortskaffelse af de forseglede amplifikationsmikrobrønde efter testning for at forhindre kontaminering af arbejdsområdet med amplifikationsprodukter. 12. SKIFT HANDSKER ved specificerede trin under bearbejdning af prøver og analyseproceduren for at undgå krydskontaminering af præparater. Hvis handsker får kontakt med præparater, skiftes handskerne straks for at undgå at kontaminere andre præparater. 13. I tilfælde af, at arbejdsområdet eller udstyret kontamineres med bearbejdet prøve, rengøres det kontaminerede område grundigt med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox, og der skylles grundigt med deioniseret/destilleret vand. Lad overfladen tørre fuldstændigt, inden der fortsættes. 14. Rengør hele arbejdsområdet bordflader og instrumentflader med 1 % natriumhypochlorit med Alconox dagligt. Skyl grundigt med deioniseret/destilleret vand. Lad overflader tørre fuldstændigt, inden De fortsætter med yderligere testning. 15. Primermikrobrønde med residualvæske (efter overførsel af væske fra primermikrobrønde til amplifikationsmikrobrønde) udgør en kilde til kontaminering af fokus. Forsegl omhyggeligt primermikrobrønde med pladeforsegleren inden bortskaffelse. 16. Fingre eller hænder må ikke placeres i det akustiske bad, når ultralydteknikken er TÆNDT. Hvis dette gøres, kan det forårsage ubehag og mulig hudirritation. Langvarende skade af bløddele kan også forekomme. 17. Kontrollér ikke temperaturen på det akustiske bad med et kviksølvtermometer. Et digitalt termometer er vedlagt til dette formål. 18. Kontakt Teknisk service i tilfælde af en usædvanlig situation, som for eksempel, hvis der spildes ned i BD ProbeTec ET instrumentet, eller kontaminering med DNA, som ikke kan fjernes ved hjælp af rengøring. 19. Hvis der anvendes en almindelig laboratorieovn, skal man gå frem i henhold til ovnens brugervejledning for så vidt angår korrekt betjening og sikkerhedsforholdsregler. 20. Benyt etablerede laboratorieprocedurer for så vidt angår håndteringen af prøverne under og/eller efter varmeinaktivering. 2

Kat. Nr. Beskrivelse 240862 BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, ti 75 ml flasker med NALC-NaOH opløsning og 5 pakker med fosfatbuffer. 240863 BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, ti 150 ml flasker med NALC-NaOH opløsning og 10 pakker med fosfatbuffer. Farligt H314 Forårsager svære forbrændinger af huden og øjenskader. P260 Indånd ikke pulver/røg/gas/tåge/damp/spray. P280 Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/ ansigtsbeskyttelse. P264 Vask grundigt efter brug. P303+P361+P353 VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Tilsmudset tøj tages straks af/fjernes. Skyl/brus huden med vand. P405 Opbevares under lås. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. Kat. Nr. Beskrivelse 440643 BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen Processing Kit Advarsel H315 Forårsager hudirritation. H319 Forårsager alvorlig øjenirritation. H335 Kan forårsage irritation af luftvejene. P280 Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/ansigtsbeskyttelse. P264 Vask grundigt efter brug. P312 I tilfælde af ubehag, ring til en GIFTINFORMATION eller en læge. P405 Opbevares under lås. P403+P233 Opbevares på et godt ventileret sted. Hold beholderen tæt lukket. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. Farligt H302 Farlig ved indtagelse. H314 Forårsager svære forbrændinger af huden og øjenskader. P260 Indånd ikke pulver/røg/gas/tåge/damp/spray. P280 Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/ ansigtsbeskyttelse. P264 Vask grundigt efter brug. P303+P361+P353 VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Tilsmudset tøj tages straks af/fjernes. Skyl/brus huden med vand. P405 Opbevares under lås. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. Advarsel H302 Farlig ved indtagelse. P264 Vask grundigt efter brug. P301+P312 I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: I tilfælde af ubehag, ring til en GIFTINFORMATION eller en læge. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. PRØVEINDSAMLING OG -HÅNDTERING Alle præparater skal indsamles og transporteres som anbefalet af CDC, Clinical Microbiology Procedures Handbook (håndbogen om kliniske mikrobiologiprocedurer) eller laboratoriemanualen. 1,8 AFKOGNING, DEKONTAMINERING OG KONCENTRERING Prøver skal behandles vha. NALC-NaOH-metoden som anbefalet af CDCs Public Health Mycobacteriology mycobakteriologi i det offentlige sundhedsvæsen: A Guide for the Level III Laboratory (vejledning til niveau III-laboratorier). 1 Som et alternativ kan BBL MycoPrep kittet anvendes til bearbejdning af mycobakteriepræparater (se Tilgængelighed ). BEMÆRK: Hvis BD ProbeTec ET analysetestning ikke foretages øjeblikkeligt, kan NALC/NaOH-sedimenter opbevares på følgende måde: (a) Ved 2 8 C i op til 5 dage. (b) Opbevar nedfrosne ved -20 C eller koldere (ikke-selvafrimende fryser), hvis mere end 5 dage, i op til tre måneder. Frosne sedimenter skal optøs ved stuetemperatur inden bearbejdning for BD ProbeTec ET DTB testning. 3

PROCEDURE FOR KLARGØRING AF PRØVER A. Klargøring på BD ProbeTec ET DTB prøvebearbejdning Uden for BSC 1. Prøvebearbejdningsbufferne skal være ved stuetemperatur og blandes grundigt inden brug. Afmål tilstrækkelige buffervolumener over i korrekt mærkede, sterile beholdere for at undgå kontaminering af stambuffere på følgende måde: a. DTB vaskebuffer 1 1 ml pr. NALC-NaOH sediment til bearbejdning plus 1 2 ml ekstra for at lette pipettering. b. DTB lyseringsbuffer 2 0,1 ml pr. NALC-NaOH sediment og kontroller til bearbejdning plus 0,5 1 ml ekstra for at lette pipettering. c. DTB neutraliseringsbuffer 3 0,6 ml pr. NALC-NaOH sediment og kontroller til bearbejdning plus 0,5 1 ml ekstra for at lette pipettering. d. Undgå kontaminering af buffere - hæld ikke resterende buffer tilbage i flaskerne. 2. Anvend mærkater vedlagt de samme prøveglas og mærk ét 2 ml prøveglas for hvert NALC-NaOH sediment, som skal bearbejdes. 3. Tag hætterne af prøveglassene og dispensér 1,0 ml DTB vaskebuffer 1 over i hvert glas. Sæt hætterne tilbage på glassene. 4. Flyt prøveglassene til BSC. B. Bearbejdning af NALC-NaOH sedimentprøver til BD ProbeTec ET DTB testning Inden i BSC BEMÆRK: Som forberedelse på dekantering af præparater klargør en væskebeholder til biologisk farligt affald. 1. Vortex det første NALC-NaOH sediment i 5 sek. 2. Overfør 500 µl NALC-NaOH sediment ved brug af en pipettor udstyret med en ny aerosolresistent spids til det korrekt mærkede prøveglas indeholdende 1 ml DTB vaskebuffer 1. 3. Sæt hætten godt fast på glasset. 4. Gentag trin 1 3 for hvert NALC-NaOH sediment. 5. SKIFT HANDSKER. 6. Vortex hvert prøveglas i 5 sekunder. 7. Sæt hvert glas i den aerosolindeholdende rotor og sæt det aerosolindeholdende låg godt fast. Tør rotorens ydre af med håndklæder eller gaze fugtet med en antimikrobiel opløsning. 8. Overfør den aerosolindeholdende rotor til mikrocentrifugen. Centrifugér prøverne ved 12.200 x g i 3 min. BEMÆRK: De angivne centrifugeringsforhold skal overholdes, da utilstrækkelig centrifugering kan forårsage falskt negative resultater. 9. Fjern forsigtigt rotoren fra mikrocentrifugen (uden at bryde den aerosoltætte forsegling) umiddelbart efter centrifugering og returnér rotoren til BSC. 10. Fjern det aerosolindeholdende låg og fjern straks prøverne fra rotoren, idet der udvises forsigtighed for at minimere genblanding af supernatanten og sedimentet. 11. Tag hætten af det første glas og dekantér supernatanten over i væskeaffaldsbeholderen i BSC. Foretag en jævn inverteringsbevægelse og afslut med en nedadgående rap drejning af det inverterede glas. Bemærk: Sediment kan frigøres med tiden. Foretag trin 9, 10 og 11 uden forsinkelse. 12. Sæt hætten fast igen og placér glasset i et 2 ml prøveglasstativ. 13. Gentag trin 11 og 12 for alle prøver. 14. SKIFT HANDSKER. C.1. Prøveopvarmning BD ProbeTec ET ovn. Noter: Sørg for at hætterne sidder godt fast på alle glas. Efterse hætterne på prøveglassen for at sikre, at O-ringene sikker korrekt, inden opvarmning af prøver i ovnen. Hvis en O-ring forekommer ødelagt eller hvis den mangler, skal der anvendes en ny hætte. Der henvises til brugervejledningen til BD ProbeTec ET systemet for fuldstændige betjeningsinstruktioner, inklusive relevante forholdsregler og advarsler. 1. Placér 2 ml prøveglasstativet i ovnen og luk døren. 2. Vælg RUN#1 (KØR#1). Tryk på OK. 3. Tryk på START for at initialisere kørslen. 4. Når opvarmningsprogrammet starter, skal følgende trin foretages: a. Klargør BD ProbeTec ET akustisk bad. Dette omfatter: (1) Placér den akustiske badindsats i badet. (2) Fyld det akustiske bad til indikatorstregen Maximum med varmt postevand. (BEMÆRK: Deioniseret vand bør ikke anvendes.) (3) Indstil temperaturen til 65 C og tænd for varmeapparatet. (4) Kør ultralydteknik i 60 min (standardindstilling) med låget til det akustiske bad påsat. b. Sikr standardrotoren i mikrocentrifugen. 5. Efter 15 min med opvarmningsprogrammet, skal ovnens eksterne termometer kontrolleres og temperaturen noteres for at sikre, at temperaturen viser 95 C. 6. Ved slutningen af opvarmningsprogrammet vil et hørtbart bip lyde, og LCD-displayet angiver, at kørslen er DONE (FULDFØRT). Lås dørens lås op ved at trykke på tasten OPEN DOOR (ÅBN DØR) og fjern 2 ml prøveglasstativet. 4

Bemærk: Eventuelle mycobakterier i prøveglassene er nu ikke-levedygtige og efterfølgende manipuleringer kan finde sted uden for BSC. Prøverne skal fortsat behandles som potentielt biologisk farlige. C.2. Prøveopvarmning - almindelig laboratorieovn NOTER: Sørg for, at hætterne sidder godt fast på prøveglassene. Efterse hætterne på prøveglassene for at sikre, at O-ringene sidder korrekt, inden opvarmning af prøver i ovnen. Hvis O-ringen forekommer ødelagt eller hvis den mangler, skal der anvendes en ny hætte. Der henvises til ovnens brugervejledning for fuldstændige betjeningsinstruktioner, herunder relevante forholdsregler og advarsler. 1. Placér 2 ml prøveglasstativet i ovnen og luk døre. 2. Temperaturen i prøven skal nå 101 C ± 1 C og holdes der i mindst 30 min. og højest 35 min. Gældende vejledning for så vidt angår inkubationstid og -temperatur skal følges. 3. Mens prøverne opvarmes i ovnen, gøres følgende: a. Klargør BD ProbeTec ET ultralydsbad. Dette omfatter: (1) Placér ultralydsbadindsatsen i badet. (2) Fyld ultralydsbadet til indikatorstregen Maximum med varmt postevand. (BEMÆRK: Der må ikke anvendes deioniseret vand). (3) Indstil temperaturen til 65 C og tænd for varmeapparatet. (4) Kør ultralydsrensningen i 60 min (standardindstilling) med låget til ultralydsbadet påsat. b. Fastgør standardrotoren i mikrocentrifugen. 4. Tag 2 ml prøveglasstativet ud ved afslutningen af ovnens varmecyklus. ADVARSEL: Håndtér ikke det varme prøvestativ uden egnet personligt beskyttelsesudstyr. Manglende overholdelse af dette kan føre til forbrænding. BEMÆRK: Eventuelle mycobakterier i prøveglassene er nu ikke-levedygtige og efterfølgende manipuleringer kan finde sted uden for BSC. Prøverne skal fortsat behandles som potentielt biologisk. D. Prøvelysering BD ProbeTec ET akustisk bad ADVARSEL: Fingre eller hænder må ikke placeres i det akustiske bad, når ultralydteknikken er TÆNDT. Hvis dette gøres, kan det forårsage ubehag og mulig hudirritation. Langvarende skade af bløddele kan også forekomme. ADVARSEL: Kontrollér ikke temperaturen på det akustiske bad med et kviksølvtermometer. Et digitalt termometer er vedlagt til dette formål. BEMÆRK: Der henvises til brugervejledningen til BD ProbeTec ET systemet for fuldstændige betjeningsinstruktioner, inklusive relevante forholdsregler og advarsler. 1. Placér prøveglassene i mikrocentrifugen med standardrotoren. 2. Luk låget og impulscentrifugér i 10 sek. 3. Fjern glassene fra centrifugen og undersøg prøveglassene for kondensat. Hvis kondensat observeres, skal centrifugering gentages. 4. Sæt glassene tilbage i 2 ml prøveglasstativet. 5. Tag hætten af det første glas. Dispensér 100 µl DTB lyseringsbuffer 2 over i glasset ved brug af en pipettor med en aerosolresistent spids. Sæt hætten tilbage på prøveglasset og stram den. 6. Gentag for alle prøver, idet en ny spids bruges for hver prøve. 7. SKIFT HANDSKER. 8. Vortex hvert glas i 5 sek. Efterhånden som glassene sættes tilbage i 2 ml prøveglasstativet, skal det sikres, at glassene er tæt tillukkede. Skub glasset, således at kanten af glasset sidder i indkærvningen i stativet. Dette indretter glassene korrekt for maksimal eksponering for ultralydsenergi. 9. SLUK for ultralydteknikken og bekræft, at vandstanden falder til mellem indikatorstregerne Minimum og Maximum på den akustiske badindsats. Aftap eller tilsæt varmt postevand efter behov. Kontrollér temperaturen på det akustiske bad med det digitale termometer for at sikre, at temperaturen er 65 ± 5 C. Fjern termometeret fra badet. 10. Overfør 2 ml prøveglasstativet til den akustiske badindsats. Sæt låget tilbage på det akustiske bad. 11. Indstil uret for det akustiske bad til 45 min, TÆND for ultralydteknikken. 12. SLUK for det akustiske bad ved slutningen af den akustiske procedure og fjern 2 ml prøveglasstativet. Placér stativet på et absorberende papirhåndklæde for at tørre. E. Prøveneutralisering 1. Placér prøveglassene i mikrocentrifugen med standardrotoren. 2. Luk låget og impulscentrifugér i 10 sek. 3. Fjern glassene fra centrifugen og undersøg prøveglassene for kondensat. Hvis kondensat observeres, skal centrifugering gentages. 4. Placér glassene i det klare pipetteringsstativ. 5. Tag hætten af det første glas. Dispensér 600 µl DTB neutraliseringsbuffer 3 over i glasset ved brug af en pipettor med en aerosolresistent spids. Sæt hætten tilbage på prøveglasset og stram den. 6. Gentag for alle prøver, idet en ny spids bruges for hvert glas. 5

7. SKIFT HANDSKER. 8. Vortex hvert glas i 5 sekunder. 9. Impulscentrifugér glassene ved at følge trin 1 3 ovenfor. 10. Sæt glassene tilbage i det klare pipetteringsstativ. 11. Bearbejdede prøver er nu klar til testning på BD ProbeTec ET systemet. BEMÆRK: Hvis testning ikke foretages med det samme, kan bearbejdede prøver opbevares på følgende måde: a) Ved 18 33 C i op til 12 h. b) Ved 2 8 C i op til 4 dage. Prøver skal genopvarmes i BD ProbeTec ET ovnen eller almindelig laboratorieovnen der er i stand til at opvarme prøven til 101 C ± 1 C i mindst 30 min. og højest 35 min, inden testning. c) Nedfrosne ved -20 C eller koldere (ikke-selvafrimende fryser) i op til 3 måneder. Frosne præparater skal optøs ved stuetemperatur og genopvarmes i BD ProbeTec ET ovnen eller almindelig laboratorieovnen der er i stand til at opvarme prøven til 101 C ± 1 C i mindst 30 min. og højest 35 min, inden testning. d) Efter glassene er blevet genopvarmet (i trin b og c ovenfor), placeres de i mikrocentrifugen ved brug af standardrotoren. Luk låget og impulscentrifugér i 10 sek. Fjern glassene fra centrifugen og undersøg hætterne for kondensat. Hvis kondensat observeres, skal centrifugering gentages. Placér glassene i det klare pipetteringsstativ. Prøver er nu klar til testning på BD ProbeTec ET systemet. TESTPROCEDURE A. Klargøring af instrument 1. Tænd for instrumentet og lad det varme op inden analysen påbegyndes. a. Primer- og opvarmerapparatet kræver ca. 90 min til opvarmning og stabilisering. Indstillingspunktet for primerkomponenten i primer- og opvarmerapparatet er 72,5 C. Indstillingspunktet for opvarmerkomponenten i primer- og opvarmerapparatet er 54 C. b. BD ProbeTec ET instrumentet er softwarestyret og kræver ca. 30 min til opvarmning. 2. Primer- og varmeapparatets temperaturer skal kontrolleres inden analysen påbegyndes. Termometret i primervarmerapparatet skal vise mellem 72 73 C. Termometret i opvarmerapparatet skal vise mellem 53,5 54,5 C. 3. Kontrollér temperaturen på BD ProbeTec ET skærmbilledet. Temperaturen skal vise 47,5 55,0 C. B. BD ProbeTec ET pipettor Der henvises til brugermanualen til BD ProbeTec ET systemet for detaljerede forklaringer på tastaturfunktionerne i BD ProbeTec ET Pipettoren. Følgende programmer er påkrævet til udførsel af DTB-analysen. Program 1 overfører væske fra de bearbejdede prøver til primermikrobrøndene. Program 5 overfører væske fra primermikrobrøndene til amplifikationsmikrobrøndene. Programmér pipettoren som følger: Program 1: 1. Tænd for pipettoren. Pipettoren vil bippe en gang, blinke ZERO, (nul), blinke softwareversionsnummer og bippe en gang til. 2. Tryk på den blå Prog tast. Tryk på Vol (Volumen) tasten, indtil 1 vises for at vælge Program 1. Tryk på Enter. 3. Tryk på Prog tasten og hold den nede for at gå i programmeringsmodus. Mens De trykker på Prog (Program) tasten, trykker De samtidigt på specialfunktionstasten med en pipettespids eller enden af en papirclips. 4. Tryk på Fill. Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 200. Tryk på Enter. 5. Tryk på Disp (Dispensér). Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 150. Tryk på Enter. 6. Tryk på Purge (Tøm). Tryk på Enter. 7. Tryk på Enter endnu en gang for at gemme programmet og afslutte. De skulle høre et bip, der angiver, at programmeringen er færdig. 8. Bekræft programmet ved at trykke på udløseren for at gå frem gennem hvert trin. Efterhånden som De går gennem hvert punkt, indstiller De hastigheden på aspiration/dispensér med Vol (Volumen) tasten. Hastighedsindikatoren fremkommer ved hvert trin. Brug Vol tasten til at justere hastighedsindikatoren til at vise 2 firkanter for trinene Fill og Disp og 3 firkanter for Purge. Program 5 1. Tryk på Prog (Program) tasten. Tryk på Vol (Volumen) tasten, indtil 5 vises for at vælge Program 5. Tryk på Enter. 2. Tryk på Prog tasten og hold den nede for at gå i programmeringsmodus. Mens De trykker på Prog (Program) tasten, trykker De samtidigt på specialfunktionstasten med en pipettespids eller enden af en papirclips. 3. Tryk på Fill. Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 100. Tryk på Enter. 4. Tryk på Disp (Dispensér). Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 100. Tryk på Enter. 5. Tryk på Mix (Bland). Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 50. Tryk på Enter. 6. Tryk på Enter endnu en gang for at gemme programmet og afslutte. De skulle høre et bip, der angiver, at programmeringen er færdig. 7. Bekræft programmet ved at trykke på udløseren for at gå frem gennem hvert trin. Efterhånden som De går gennem hvert punkt, indstiller De hastigheden på aspiration/dispensér/bland med Vol (Volumen) tasten. Hastighedsindikatoren fremkommer ved hvert trin. Brug Vol (Volumen) tasten til at justere hastighedsindikatoren til at vise 2 firkanter for funktionerne fyld og dispensér. Brug Vol (Volumen) tasten til at justere hastigheden for blandingen, så den viser 3 firkanter. 6

Programgennemgang Programmerne skal gennemgås, inden proceduren påbegyndes. Sæt pipettoren til TÆNDT for at gennemgå programmerne. Tryk på den blå Prog tast. Tryk på Vol tasten, indtil nummeret, som angiver programmet til gennemgang, vises. Tryk på Enter tasten. Brug pipetteringsudløseren til at avancere trinvist gennem programmet. Program 1: Dette program aspirerer 200 µl og dispenserer 150 µl. Pipettorens display skal vise som følger: Fill 200 µl S II Dispense 150 µl S II Purge S III (Tøm S III) Gennemgå Program 5 på samme måde: Program 5: Dette program aspirerer 100 µl; dispenserer 100 µl, og blander 50 µl tre gange. Pipettorens display skal vise som følger: Fill 100 µl S II Dispense 100 µl S II Mix 50 µl S III Nul (blinker skiftevis) C. Pladelayout Pladelayoutrapporten genereres fra BD ProbeTec ET instrumentet efter analysetype, præparatidentifikation, kontrollotnumre og kitlotnumre logges ind i systemet. Pladelayoutrapporten viser det fysiske layout af præparater og kontroller for hver plade, der skal testes. Denne orientering bruges til både primermikrobrøndpladen og amplifikationsmikrobrøndpladen. For DTB analysen er primermikrobrøndene de fuldkomne orange mikrobrøndstrimler. Amplifikationsmikrobrøndene er de orangestribede mikrobrøndstrimler. D. Klargøring af analysekontroller Bemærk: BD ProbeTec ET DTB kontrollerne, DTB lyseringsbuffer 2 og DTB neutraliseringsbuffer 3 bør være ved stuetemperatur inden brug. Brug buffere, som tidligere blev afmålt til prøvebearbejdning. Bland grundigt inden brug. 1. For hver kørsel (plade), der skal testes, klargøres ét DTB negativt kontrolglas og ét DTB positivt kontrolglas. Hvis en plade indeholder mere end ét DTB reagenspakke-lotnummer, skal kontroller testes med hver lot. 2. Tag hætten af det negative kontrolglas. a. Dispensér 100 µl DTB lyseringsbuffer 2 ved brug af en ny pipettespids. b. Dispensér 600 µl DTB nuetraliseringsbuffer 3 ved brug af en ny pipettespids. 3. Sæt hætten godt fast på glasset og vortex i 5 sek. 4. Tag hætten af det positive kontrolglas. a. Dispensér 100 µl DTB lyseringsbuffer 2 ved brug af en ny pipettespids. b. Dispensér 600 µl DTB nuetraliseringsbuffer 3 ved brug af en ny pipettespids. 5. Sæt hætten godt fast på glasset og vortex i 5 sek. 6. Placér kontrolglassene i mikrocentrifugen med standardrotoren. Luk låget og impulscentrifugér i 10 sekunder. Fjern glassene fra centrifugen og placér dem i det klare pipetteringsstativ. E. Testprocedure 1. Fjern og kassér hætterne fra prøveglassene og kontrollerne for den første kørsel. 2. SKIFT HANDSKER. 3. Klargør primermikrobrøndpladen ved hjælp af pladelayoutrapporten. 4. Genforsegl mikrobrøndposen på følgende måde. a. Anbring posen på en plan flade. Hold den åbne ende fladt med den ene hånd. b. Lad fingrene løbe hen over ydersiden, mens tryk påføres, af forseglingen fra den ene kant af posen til den anden. c. Se efter for at sikre, at posen er forseglet. 5. Vælg Program 1 på BD ProbeTec ET pipettoren. 6. Saml pipettespidser op. Udvid pipettoren ved at trække afstandsknoppen helt ud. BEMÆRK: Sørg for, at spidserne er sat forsvarligt på pipettoren, så lækage undgås. Bemærk: ved aspiration af prøver vær forsigtig med at undgå pelletdebris, som kan tilstoppe pipettespidserne og påvirke testresultater. 7. Aspirér 200 µl fra den første kolonne af prøver. 8. Pres forsigtigt pipettoren sammen, lad pipettespidserne berøre siderne af brøndene og dispensér 150 µl i den første kolonne af primermikrobrøndene (1 A-H). Bemærk: Det er vigtigt at dispensere væsker mod mikrobrøndenes indvendige væg for at sikre nøjagtighed og præcision og undgå krydskontaminering. 9. Kassér spidserne. Tryk ned på pipetteringsudløseren for at nulstille pipettoren. 10. Saml nye spidser op, udvid pipettoren og aspirér 200 µl fra den anden kolonne med prøver. 11. Pres forsigtigt pipettoren sammen, lad pipettespidserne berøre siderne af brøndene og dispensér 150 µl i den anden kolonne af primermikrobrøndene (2 A-H). 7

BEMÆRK: Pipettoren må ikke presses sammen over prøver eller mikrobrønde, da dette kan forårsage kontaminering. Pludselige bevægelser kan forårsage dråber eller aerosoler. 12. Kassér spidserne. BEMÆRK: Kassér spidserne forsigtigt for at undgå små dråber eller aerosoler, som kan kontaminere arbejdsområdet. 13. Fortsæt med at overføre de resterende prøver til kørslen. 14. Dæk primermikrobrøndpladen med primerlåget og lad pladen inkubere ved stuetemperatur i mindst 20 min. (Kan inkubere op til 6 h.) BEMÆRK: Sæt nye hætter på de bearbejdede prøver. SKIFT HANDSKER. 15. Ved slutningen af primerinkubation klargøres amplifikationsmikrobrøndpladen. Konfigurér amplifikationsmikrobrønden i en plade, der matcher pladelayoutrapporten (samme som primerpladen). Forsegl amplifikationsmikrobrøndposerne igen som beskrevet i trin 4. 16. Tag låget af primermikrobrøndpladen og overfør pladen til primervarmeapparatet. Anbring STRAKS amplifikationsbrøndpladen i opvarmerapparatet for at forvarme. 17. Indstil uret til 10 min. (BEMÆRK: Korrekt tid er vigtig for dette punkt.) 18. Ved afslutningen af de 10 min (+/ 1 min) inkubation vælges Program 5 på pipettoren. 19. Saml straks spidserne op og overfør 100 µl fra kolonne 1 i primermikrobrøndpladen til kolonne 1 i amplifikationsmikrobrøndpladen. Lad pipettespidserne berøre siderne af brøndene og dispensér væsken. Lad efter dispenseringen pipettoren blande væsken i brøndene automatisk. 20. Kassér spidserne. Saml nye spidser op og fortsæt med at overføre reaktionsblandingen fra primermikrobrøndene til amplifikationsmikrobrøndene, kolonne efter kolonne, idet der bruges nye spidser for hver kolonne. 21. Når den sidste kolonne er blevet overført, fjernes bagbeklædningen fra en amplifikationsforsegler. (Én amplifikationsforsegler [1/2] vil dække op til 6 kolonner; hvis pladen overskrider 6 kolonner, SKAL et helt forseglerark anvendes). Hold forsegleren i kanterne og læg den over mikrobrøndene. Brug retningslinierne på opvarmerapparatet som hjælp ved påførsel af forsegleren. Tryk ned på forsegleren for at sikre, at alle mikrobrønde er helt forseglet. 22. Ved BD ProbeTec ET betjeningspanelen flyttes bæreren ud og døren og pladelåget åbnes. Overfør STRAKS (indenfor 30 s) den forseglede amplifikationsmikrobrøndplade til BD ProbeTec ET instrumentet og start kørslen. (Der henvises til brugervejledningen til BD ProbeTec ET systemet for detaljerede instruktioner.) 23. Når kørslen er startet, færdiggøres følgende del af rengøringsproceduren: a. Forsegl primermikrobrøndpladen med en amplifikationsforsegler og fjern pladen fra primer- og opvarmerapparatet. (Brug den varmebestandige handske ved fjernelse af pladen temperaturen overskrider 70 C.) b. Lad pladen afkøle på bordet i 5 min. Kassér primermikrobrøndene i en beholder til biologisk farligt affald. c. Rengør metalpladen: Skyl pladen med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox opløsning. Skyl pladen med destilleret eller deioniseret vand. Pak pladen ind i et rent håndklæde og lad den tørre, inden den tages i brug igen. 24. Når kørslen er færdig, vil der genereres en udskrift af testresultaterne. 25. Flyt pladebæreren ud af platformen, åbn døren og fjern pladen. Luk døren og sæt pladeplatformen tilbage i instrumentets indre. 26. Fjern de forseglede amplifikationsmikrobrønde fra pladen. Forsigtig: Forseglingsmaterialet må ikke fjernes fra mikrobrønde. De forseglede mikrobrønde kan let fjernes som en enkelt enhed ved at holde fast i top og bund af forsegleren og løfte lige op og ud af pladen. Anbring de forseglede mikrobrønde i engangsposen. Forsegl posen. 27. Rengør metalpladen: Skyl pladen med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox opløsning. Skyl pladen med destilleret eller deioniseret vand. Pak pladen ind i et rent håndklæde og lad den tørre, inden den tages i brug igen. 28. Ved dagens sidste kørsel udføres følgende rengøringsprocedurer: a. Rengør bordpladerne med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox. Lad opløsningen forblive på arbejdsoverfladerne i 2 3 min, tør derefter af med destilleret eller deioniseret vand. b. Rengør prøveglasstativet og det klare pipetteringsstativ ved at nedsænke i 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox i højst 60 sek. Skyl grundigt med destilleret eller deioniseret vand og lad lufttørre. c. Rengør de ydre overflader på primer- og opvarmerapparatet og BD ProbeTec ET instrumentet med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox. Tør overfladerne af med destilleret eller deioniseret vand. d. Rengør pipettorhåndtaget (KUN HÅNDTAGET) med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox. Tør håndtaget af med destilleret eller deioniseret vand og tør med et rent håndklæde. e Genoplad pipettoren. f. Kassér den forseglede engangspose og biologisk farligt affald i overensstemmelse med fastlagte procedurer for bortskaffelse af kontamineret affaldsmateriale. 8

Kvalitetskontrol BD ProbeTec ET DTB Control Set leveres separat. En positiv og en negativ kontrol skal inkluderes i hver analysekørsel og for hvert nyt reagenskit-lotnummer. Kontroller kan placeres tilfældigt. Den DTB positive kontrol overvåger for reagensfejl, fuldførsel af væsentlige procedureelementer (pipettering og inkuberinger), amplifikation og påvisning. Den negative kontrol overvåger for reagens- og/eller miljømæssig kontaminering. Den DTB positive og DTB negative kontrol skal testes som henholdsvis positiv og negativ for at kunne rapportere prøveresultater. Hvis kontrollerne ikke præsterer som forventet, betragtes analysekørslen som ugyldig og intrumentet vil ikke rapportere patientresultater. Hvis kvalitetskontrollen ikke opfylder de forventede resultater, gentages hele kørslen med et nyt sæt kontroller, nye mikrobrønde og de bearbejdede præparater. Hvis de gentagede kvalitetskontroller ikke giver de forventede resultater, kontaktes Teknisk service (se Tolkning af resultater ). Der henvises til afsnit D i TESTPROCEDURE for vejledning i klargøring af kontrollerne. Så snart kontrollerne er blevet klargjort, fortsættes testning som beskrevet i afsnit E i TESTPROCEDURE. En intern amplifikationskontrol (IAC) er ophobet i primermikrobrønden. IAC indeholder nukleinsyrefokus, som forstærkes ved tilstedeværelsen af prøvematricen. IAC er designet til at bekræfte gyldigheden af amplifikationsreaktionen og til at identificere potentiel hæmning fra det bearbejdede præparat. Prøvebearbejdningskontrol: En procedurekontrol bør testes regelmæssigt i overensstemmelse med lokale regler for at teste effektiviteten af prøvebearbejdning. Procedurekontrollerne består af en suspension af M. tuberculosis (f.eks. American Type Culture Collection, H37Ra ATCC 25177). Suspensionen bør klargøres på følgende måde: 1. Klargør en McFarland nr. 1 suspension af organismen. 2. Fortynd McFarland suspensionen 1:100 oksealbumin (FraktionV), (f.eks. pipettér 0,1 ml McFarland suspension over i 9,9 ml oksealbumin og bland grundigt). 3. 1,0 ml aliquoter kan nedfryses ved -20 C eller koldere (ikke-selvafrimende fryser). 4. Cellesuspensionen bør klargøres som en rutineprøve til testning på BD ProbeTec ET systemet. Overvågning for tilstedeværelsen af DNA kontaminering: Inden første kørsel af BD ProbeTec ET DTB analysen og mindst én gang om måneden derefter skal følgende testprocedure foretages for at overvåge arbejdsområdet og udstyrets overflader for tilstedeværelsen af DNA kontaminering. Overvågning af miljøet er væsentligt for at påvise kontaminering, inden der opstår et problem. 1. Brug CultureSwab EZ podepind for hvert område*, der skal testes. 2. Mærk et prøveglas for hvert område, der skal podes, og pipettér 100 µl DTB lyseringsbuffer 2 og 600 µl DTB neutraliseringsbuffer 3 over i hvert glas. 3. Dyp den første podepind i bufferblandingen i prøveglasset, og aftør det første område med en bred, fejende bevægelse. 4. Bland podepinden i bufferblandingen, tryk podepinden af, sæt hætten tilbage på glasset og vortex i 5 sek. Kassér podepindene. 5. Gentag for hvert podet område. 6. Placér glassene i prøveglasstativet og opvarm i ovnen (afsnit C under PROCEDURE FOR KLARGØRING AF PRØVER). 7. Mens glassene varmes op, bruges rene håndklæder vædet med vand til at fjerne rester af bufferblandingen fra de podede overflader. 8. Efter opvarmning placeres glassene i mikrocentrifugen med standardrotoren, låget lukkes og impulsudskil i 10 sek. 9. Fjern glassene fra centrifugen og undersøg hætterne for kondensat. Hvis kondensat observeres, skal centrifugering gentages. 10. Placér glassene i det klare pipetteringsstativ og fortsæt med TESTPROCEDUREN. *Anbefalede områder, der skal testes, omfatter: ovnens overflade, akustisk bad, 2 ml prøveglasstativ, klart pipetteringsstativ, primer- og opvarmerapparat, sorte mikrobrøndplader, pipettorhåndtag, instrumentets taster, instrumentets tastatur og arbejdsbordet. Hvis et område giver et positivt resultat, rengøres området med frisk 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox. Sørg for, at hele området er vædet med blegemiddelopløsningen og lad blegemiddelopløsningen få lov at blive på fladen i mindst 2 min, eller indtil tørhed opnås. Fjern overskydende blegemiddelopløsning med et rent håndklæde, hvis det er nødvendigt. Aftør området med et rent håndklæde vædet med deioniseret eller destilleret vand og lad fladen tørre. Test området igen. Gentag, indtil der foreligger negative resultater. Hvis der bliver ved med at være kontaminering, kontaktes Teknisk service for yderligere information. TOLKNING AF TESTRESULTATER DTB analyseresultat Positivt Negativt Inkonklusivt Anbefalet rapport Probeanalyse positiv for tilstedeværelsen af M. tuberculosis kompleks DNA. AFB dyrkning afventes. Probeanalyse negativ for tilstedeværelsen af M. tuberculosis kompleks DNA. AFB dyrkning afventes. Gentag probeanalyse fra bearbejdet præparat. Hvis positiv eller negativ, anvendes passende erklæring beskrevet ovenfor. Hvis inkonklusiv fortsat rapportes, Underskriv med initialer og gentag probeanalyseresultat er inkonkusivt. Indsend et nyt præparat til testning. AFB dyrkning afventes. PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 1. Denne metode er kun blevet testet med præparater fra luftvejene, såsom spyt (induceret eller ekspektoreret), bronchoalveolær lavager, samt bronkialt og trachialt aspirat. Ydelse med andre præparater er ikke blevet vurderet. 2. Et negativt resultat udelukker ikke muligheden for, at koncentrationen af fokusorganismen er til stede under testens sensitivitet. 3. Som det er tilfældet med andre diagnostiske test, bør resultater fra DTB analysen tolkes sammen med andre laboratorie- og kliniske data, som er til rådighed for lægen. 9

4. DTB analysen skelner ikke mellem medlemmer af M. tuberculosis komplekset M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum og M. microti. 5. Optimal effektivtet for denne analyse kræver adækvat præparatopsamling og -håndtering. 6. De angivne centrifugeringsforhold skal overholdes, da utilstrækkelig centrifugering kan forårsage falskt negative resultater. 7. DTB analysen påviser ikke varianter af M. tuberculosis komplekset, som mangler indsættelsessekvensen IS6110. 8. Anvendelse af DTB analysen er begrænset til personale, som har modtaget træning i analyseproceduren og BD ProbeTec ET systemet. 9. DTB analysen kan ikke bruges til at vurdere terapeutisk succes eller fiasko, da nukleinsyrer fra Mycobacterium tuberculosis kompleksorganismer kan persistere efter antimikrobiel behandling. 10. DTB analysen er ikke beregnet til at erstatte dyrkning med det formål at teste antimikrobiel følsomhed. 11. DTB analysen giver kvalitative resultater. Der kan ikke bestemmes en sammenhæng mellem størrelsen af MOTA scoren og antallet af celler i en positiv prøve. 12. M. tuberculosis kompleksets probesekvens, IS6110, er specifik for M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum og M. microti. 13. DTB analysen vil påvise varianter af ikke-tuberkulose mycobakteriearter, som kan indeholde IS6110 sekvensen. 14. En analyses prædiktive værdi afhænger af sygdommens prævalens i en særlig population. 15. Effektiviteten af andre potentielle variabler, såsom antimikrobiel behandling eller sominficerede prøver, er ikke blevet fastlagt. 16. Hvis der anvendes en almindelig laboratorieovn, skal det sikres, at væsken i prøveglassene når en temperatur på 101 ± 1 C og at den holdes der i mindst 30 min. med henblik på at sikre, at mycobakterier, der måtte findes i prøven gøres ikke-levedygtige. FORVENTEDE RESULTATER Ialt 1157 præparater indsamlet fra 986 patienter blev analyseret på to geografisk-forskellige kliniske undersøgelsessteder med BD ProbeTec ET DTB analysen. En fordeling af hyppigheden af de indledende MOTA scorer vises i Figur 1. BD ProbeTec ET DTB resultater er fremsat og sammenlignet med resultater af reference TB og udstrygning med syrefaste baciller (AFB). Et reference TB resultat var baseret på et resultat af mycobakteriedyrkning eller patientdiagnose fra skemagennemgang. Tilstedeværelsen eller fraværet af Mycobacterium tuberculosis komplekset bestemmes ved at relatere BD ProbeTec ET DTB MOTA scorer for præparaterne til forudbestemte afskæringsværdier. MOTA scoren er en metrik, der anvendes til at vurdere signalstørrelsen som et resultat af reaktionen. MOTA scorens størrelse antyder ikke niveauet af organisme i præparatet. Alle beregninger udføres automatisk af instrumentsoftwaren. Præparaterne testet på de to steder blev identificeret af BD ProbeTec ET som positive, negative eller inkonklusive. Kun ét præparat genererede et inkonklusivt resultat ved den originale testning. Dette præparat var negativt ved gentagelse. Figur 1: Fordeling af hyppighed af DTB MOTA scorer 900 800 700 600 792 Hyppighed 500 400 300 200 184 100 0 31 10 12 1 36 6 3 82 2 < 3.400 3.400 19.999 20.000 39.999 DTB MOTA 40.000 59.999 60.000 79.999 80.000 Reference TB (-) Reference TB (+) Resultat for udstrygning og reference TB 0 3.399 3.400 19.999 20.000 39.999 40.000 59.999 60.000 79.999 80.000 Udstrygning (+) TB (+) 2 1 19 144 60 1 Udstrygning (+) TB ( ) 18 0 1 1 0 0 Udstrygning ( ) TB (+) 29 11 17 40 22 1 Udstrygning ( ) TB ( ) 774 10 0 5 1 0 10

FUNKTIONSDATA Klinisk evaluering BD ProbeTec ET DTB analysen blev evalueret på to geografisk-forskellige kliniske steder, hvor prævalens af tuberkulose gik fra 9,2 % til 34,1 %. Ialt 1157 præparater fra 986 patienter blev testet med DTB analysen og resultater blev sammenlignet med mycobakteriedyrkning. BD ProbeTec ET DTB analysens resultater vises i tabel 1 (efter præparat) og i tabel 2 (efter patient). Resultater er separeret efter udstrygningsstatus. Alle præparater fra en patient anvendes til at kategorisere den patient. Antallet af præparater pr. patient gik fra ét til tre. En patient, som bidrager ét eller flere positive DTB resultater, defineres som en DTB positiv patient. En patient, som bidrager ét eller flere dyrkningspositive resultater for DTB kompleks, defineres som en dyrkningspositiv patient. Tabel 1: DTB resultat sammenlignet med indledende dyrkningsresultat efter præparat DTB resultater Udstrygningsresultater Dyrkning (+) Dyrkning ( ) (+) Udstrygning (+) 223 4 Udstrygning ( ) 88 19 ( ) Udstrygning (+) 2 18 Udstrygning ( ) 29 774 Tabel 2: DTB resultat sammenlignet med indledende dyrkningsresultat efter patient DTB resultater Udstrygningsresultater Dyrkning (+) Dyrkning ( ) (+) Udstrygning (+) 192 3 Udstrygning ( ) 82 16 ( ) Udstrygning (+) 2 17 Udstrygning ( ) 23 651 Der var 54 uoverensstemmende DTB resultater sammenlignet med indledende dyrkningsresultater. Gennemgang af patientskemaet blev anvendt til at etablere diagnose for alle uoverensstemmende resultater. Et reference TB resultat var baseret på et resultat af mycobakteriedyrkning eller patientdiagnose fra skemagennemgang. BD ProbeTec ET DTB analysens resultater sammenlignet med reference TB resultater vises i tabel 3 (efter præparat) og i tabel 4 (efter patient). Resultater er separeret efter udstrygningsstatus. Tabel 3: DTB resultat sammenlignet med reference TB resultat efter præparat DTB resultater Udstrygningsresultater Reference TB (+) Reference TB ( ) (+) Udstrygning (+) 225 2 Udstrygning ( ) 91 16 ( ) Udstrygning (+) 2 18 Udstrygning ( ) 29 774 Tabel 4: DTB resultat sammenlignet med reference TB resultat efter patient DTB resultater Udstrygningsresultater Reference TB (+) Reference TB ( ) (+) Udstrygning (+) 193 2 Udstrygning ( ) 83 15 ( ) Udstrygning (+) 2 17 Udstrygning ( ) 23 651 Skønnede effektivitetsparametre vises i tabel 5 sammenlignet med indledende dyrkningsresultater og reference TB resultater. Sensitivitetsparametre er separeret efter udstrygningsresultater. Tabel 5: Skønnet effektivitet for DTB analyse BD ProbeTec ET sammenlignet med dyrkningsresultat Total sensitivitet Udstrygning (+) sensitivitet Udstrygning (-) sensitivitet Specificitet BD ProbeTec ET sammenlignet med reference TB resultat Total sensitivitet Udstrygning (+) sensitivitet Udstrygning (-) sensitivitet Specificitet 90.9% 99.1% 75.2% 97.2% 91.1% 99.1% 75.8% 97.8% ANALYTISKE UNDERSØGELSER Præcision: Præcisionspaneler blev testet på tre steder (to eksterne og ét internt). Hvert panel bestod af to negative prøver, to lavt positive prøver (95 CFU/mL) og to moderat høje positive prøver (1000 CFU/mL). De positive prøver blev klargjort ved at spike en negativ NALC-NaOH sedimentpool med kendte mængder af Mycobacterium tuberculosis. Prøverne blev testet i tre eksemplarer på seks forskellige kørsler. Positive og negative analysekontroller var inkluderet i hver kørsel. Fordi ingen sted-til-sted eller dag-til-dag foranderlighed forekom, er dataene fra alle steder kombineret og fremlagt i tabel 6. 11

Tabel 6 Prøve Antal observationer % korrekt Moderat høj (+) 108 100 Lav (+) 108 97.2 Negativ (-) 108 99.1 Analytisk sensitivitet: Påvisningsgrænsen (LOD) for DTB analysen defineres som minimumsantallet af nukleinsyrefokuser, som kan påvises 95 % af tiden med systemet. Denne LOD blev bestemt at være 204 kopier pr. reaktion af fokussekvensen IS6110. Denne indsættelsessekvens kan eksistere i Mycobacterium tuberculosis kompleksorganismer i op til 23 kopier pr. organisme. Når 31 isolater tilhørende komplekset blev testet, blev LOD vist som værende ni CFU pr. reaktion eller 125 CFU/mL. Den nedre sensitivitetsgrænse for en AFB udstrygning er cirka 1 x 10 4 CFU/mL. Analytisk specificitet: Spcificitet for DTB analysen blev vurderet ved at teste ethundredogtyve (120) organismer ved koncentrationer mellem 10 6 10 8 CFU/mL. Disse organismer, som måske eller måske ikke er til stede i præparater fra luftvejene, inkluderede 66 bakterier, 39 ikke-tuberkulose mycobakterier, seks gærarter og fungi og ni viruser. Ingen af de testede organismer krydsreagerede med DTB analysen, og der var ingen hæmning af IAC. Interfererende stoffer: Potentielt interfererende stoffer, som kan forekomme i præparater fra luftvejene, blev testet med DTB analysen. Potentielt interfererende stoffer blev evalueret i fraværet af fokusorganisme. Ingen af de testede stoffer interfererede med DTB analysen, og der var ingen hæmning af IAC. Testede stoffer Fuldblod (2,5% 10%) Humane hvide blodceller (1000 50.000 WBC/µL*) Lidokain (2 %) Fenolhalsspray (0,02 x normal dosering) Spytinduktionopløsning (3 % NaCl) Astmamedicin (fire ved normal dosering) Anti-tuberkulose lægemidler (ni ved normal dosering) Anti-retrovirale lægemidler (tre ved normal dosering) *Præparater indeholdende 50.000 WBC/µL kan resultere i NALC-NaOH sedimentfrigivelse under dekanteringstrinet. BESTILLING Kat. Nr. Beskrivelse 440610 BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack, 96 test. 440643 BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen Processing Kit 440631 BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Control Set direkte påvisning-kontrolsæt) 440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit (20 primerlåg, amplifikationsforseglere og bortskaffelsesposer). 440458 Pipettespidser, 6 x 120. 440661 BD ProbeTec ET Sample Tubes and Caps, 2mL, 200/pakke 440679 BD ProbeTec ET Sample Tube Caps, 2mL 200/pakke 440681 BD ProbeTec ET Sample Tube Rack, 2 ml. 440698 Klart pipetteringsstativ. 440478 BD ProbeTec ET Instrument. 440480 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (120V). 440487 BD ProbeTec ET Pipettor. 441752 Oven Large Convection 230V. 440689 BD ProbeTec ET Sonic Bath. 240862 BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, ti 75 ml flasker med NALC-NaOH opløsning og 5 pakker med fosfatbuffer. 240863 BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, ti 150 ml flasker med NALC-NaOH opløsning og 10 pakker med fosfatbuffer. 12