Hvad sker der, når vi fryser torsken?

Hvad sker der, når vi fryser torsken? Inger V. H. Kjærsgård (ivk@difres.dk) Mette R. Nørrelykke mette.rindom.norrelykke@ teknologisk.dk Flemming Jessen (flj@difres.dk).............. Danmarks Fiskeriundersøgelser Afdeling for Fiskeindustriel Forskning 42 Mange af de fisk vi spiser i dag, bliver fanget langt fra kysten. For at sikre at de kommer i land som et højkvalitetsprodukt, bliver fisken frosset ombord på fiskefartøjet. Hvorvidt fiskene bliver ved med at være et højkvalitetsprodukt afhænger imidlertid af, hvor længe og hvor koldt fisken bliver opbevaret, og hvilken art der er tale om. F.eks. vil frysning af torsk ved -20ºC eller -30ºC i et år betyde, at nogle af de vigtige proteiner i muskelfibrene ændres. Fryselagring i tre til seks måneder synes derimod at give mindre ødelæggelser i muskelstrukturen og dermed spisekvaliteten......................................................... Fiskekød Når vi spiser svine- okse- eller kalvekød, foretrækker de fleste lagret kød, som er mørt og nemt at tygge. Når det gælder fisk, er det omvendt, for her falder spisekvaliteten typisk, når fisken lagres. Den bliver ofte mere fisket i smagen og løs og tør i strukturen. Grundlæggende er alle celler (boks 1) og alt muskelvæv (boks 2) opbygget på samme vis, uanset om det stammer fra pattedyr, fjerkræ eller fisk. Hovedparten af musklen (kødet) består af proteiner, lipider (fedtstoffer) og vand. Proteinerne danner muskelens struktur og er derfor afgørende for kødets konsistens. Strukturen i muskelceller er opbygget af henholdsvis tynde og tykke protein-filamenter, hvor de vigtigste proteiner er henholdsvis aktin, tropomyosin og troponin i de tynde filamenter, og myosin heavy chain (MHC) og myosin light chain (MLC) 1, MLC 2 og MLC 3 i de tykke filamenter (boks 2). Når de proteiner, der udgør musklens struktur, nedbrydes, bliver musklen blød. Der sker et væsketab, og kødet vil blive tørt og trevlet, når det tilberedes. Der er typisk to forskellige årsager til, at musklens proteiner nedbrydes. Den ene årsag er mekanisk stress, hvor proteinerne rives i stykker. Den anden er, at proteinerne nedbrydes af særlige enzymer proteaser. Når en fisk dør, sker der en ændring af ph i musklen, hvilket medfører en aktivering af proteaserne. Proteomanalyse For at få en bedre forståelse af årsagen til kvalitetsforringelsen under lagring af fisk har Danmarks Fiskeriundersøgelser gennem en årrække anvendt den såkaldte proteomanalyse (boks 3). Proteomanalyse giver et øjebliksbillede af alle de proteiner, der er i musklen, når prøven bliver udtaget, herunder koncentrationen af alle de enkelte proteiner. Typisk vil der kunne analyseres omkring 2000 forskellige proteiner fra en almindelig muskelprøve. I det forsøg, der er beskrevet her, er metoden brugt til at undersøge, hvad der sker med proteinerne i fiskekød ved forskellige lagringsbetingelser. De store datamængder, der opnås ved at bruge proteomanalyser,

FISK & HAV 2006 nr. 61 A forventes på længere sigt også at give os viden, som kan anvendes til at udvikle et simpelt testsystem til kvalitetsbedømmelse af de fisk, der skal anvendes til konsum. Hypotesen er, at hvis f. eks. et bestemt protein (markørprotein) går fra at være vandopløseligt i friske fisk til ikke at være vandopløseligt, når fisken har været lagret i lang tid, vil det kunne anvendes som markørprotein for kvalitet. Markørproteiner anvendes allerede i dag i stor udstrækning af læger til f.eks. at afgøre, om mennesker med halsbetændelse har en bakteriel streptokok infektion. Proteomanalysen blev introduceret første gang i 1995. Det er en arbejdstung og avanceret teknik, hvor bl.a. analysen af proteinpletterne i gelerne er meget tidskrævende. Siden 1995 er der sket en stor udvikling, og proteomanalyse er i dag et vigtigt og udbredt analyseværktøj, som anvendes inden for mange forskellige forskningsgrene f.eks. i den medicinske kræftforskning. Et af de nyere tiltag i forbindelse med proteomanalysen er at kombinere den med multivariat dataanalyse (boks 4), et felt hvor Danmarks B 3 måneder ved -30 C Opbevaring ved 2 C i 0 og 14 dage -30:03:00-30:03:14 6 måneder ved -30 C Opbevaring ved 2 C 6 måneder ved -20 C Opbevaring ved 2 C i 0, 7 og 14 dage i 0, 7 og 14 dage 12 måneder ved -30 C -30:06:00-30:06:07-30:06:14 Opbevaring ved 2 C i 0 og 14 dage -30:12:00-30:12:14 12 måneder ved -20 C -20:06:00-20:06:14 Opbevaring ved 2 C i 0 og 14 dage -20:12:00-20:12:14 Fiskeriundersøgelsers afdeling for Fiskeindustriel Forskning er blandt pionererne. Hvad er det egentlig, man ser og måler i torsk, der har været frosset ned? I det forsøg vi beskriver her har vi undersøgt proteinsammensætningen i torskefileter ved forskellige opbevaringsbetingelser. Der var tale om varierende frysetemperaturer og varierende nedfrysningsperioder og lagringstider på køl. Fiskene på køl blev pakket i modificeret atmosfære pakning (MAP) og opbevaret ved 2 ºC efter optøning (figur 1). I alt er 11 forskellige opbevaringsbetingelser blevet undersøgt og sammenlignet. Ændringer i fiskemusklernes proteinsammensætning kan man måle ved at opløse proteinerne og adskille dem på 2D-geler (boks 3). Typisk vil man på den måde kunne opløse 1500-2000 proteiner fra hver muskelprøve. De kan så ses som enkelte pletter i 2D-gelerne (figur 2). Da proteinerne i den øverste del af gelen ofte ligger meget tæt, kan det imidlertid være svært at skelne dem fra hinanden. Derfor har vi her sorteret proteinerne, så det kun er proteiner med pi værdier på 3-10 og proteinstørrelser på ca. Figur 1 Flowdiagram af lagringsbetingelserne Torskefileterne var først fryselagret ved -30 ºC i 3 måneder. Herefter blev de yderligere fryselagret 3 måneder (6 måneders total frysetid) eller 9 måneder (12 måneders total frysetid). Numrene i kasserne med den tykke kant viser prøvenavnene og svarer til de følgende værdier: frysetemperatur: måneders frossen lagring: dage i modificeret atmosfære pakning (MAP) ved 2º C. 43

Figur 2 2D-geler af torskemuskelproteiner Mw 3.5 ph 9.0 36.5 opløst efter fem forskellige lagringsbetingelser 31.0 Proteinerne blev først adskilt efter ladning med en pi gradient 21.5 på 3-10 og derefter med 12 % SDS-PAGE. Gelerne er sølvfarvet. Prøverne er navngivet som anført i figur 1. 14.4-30:03:00 3.5 ph 9.0 3.5 ph 9.0 Hvide ellipser markerer de Mw proteiner, der tydeligst for- 36.5 svinder efter lang fryselagringstid. Her er kun vist det 31.0 partielle proteom, som er markeret med en stiplet line i figur 3. 21.5 14.4-30:06:00-20:06:00 3.5 ph 9.0 3.5 ph 9.0 Mw 36.5 31.0 21.5 14.4-30:12:00-20:12:00 44 12-40 kda, der er analyseret i detaljen. I dette tilfælde svarer det til pletterne inden for den stiplede firkant i figur 3. I forsøget blev proteinpletterne i 2D-gelerne fra de 11 prøver sammenlignet (figur 1). Det viste sig at seks kraftige (dvs. at der er meget af dem i musklen) proteinpletter forsvandt efter 12 måneder uafhængigt af, hvad frysetemperaturen havde været. Det betyder, at de bliver nedbrudt, mens fiskene ligger i fryseren, og at det ikke har nogen betydning

FISK & HAV 2006 nr. 61 A Mw 97.4 66.3 55.4 Actin; 4017 36.5 Tropomyosin; 1710 31.0 MLC 1; 1305 MLC 2; 1203 21.5 MLC 3; 101 1 4.4 3 pi 1 0 Myosion heavy chain f; 2108 for nedbrydningen af disse proteiner, om fiskene har været opbevaret ved -30 ºC eller -20 ºC. Hvad er det for proteiner, der ændrer sig, og hvad betyder det? Nogle af de proteiner, der ændrede sig mest under langvarig frysning, var muskelfilament proteinerne: MLC 1 (plet 1305), MLC 2 (plet 1203), MLC 3 (plet 101) og tropomyosin (plet 1710) (figur 2). Desuden steg koncentrationen af et proteinfragment fra MHC (plet 2108) og to aktin-fragmenter (plet 3412 og 3506). Ændringerne blev fundet ved at sammenligne prøver, der havde været frosset i hhv. 3, 6 og 12 måneder. B Aldose A; 8803 GADPH; 8702 Actin f; 3506 Tim; 6303 Actin f; 3412 8110 8108 9101 8803). Disse proteiner udgør ikke direkte en del af muskelstrukturen i fisken, men findes i strukturen omkring de tynde filamenter. Det er derfor sandsynligt, at der sker en nedbrydning af disse proteiner samtidig med, at der sker en nedbrydning af aktin i de tynde filamenter. Hvad betyder ændringen af disse proteiner? Som nævnt tidligere, er strukturen i muskelceller bygget op af henholdsvis tynde og tykke filamenter, hvor de vigtigste proteiner er henholdsvis aktin, tropomyosin og troponin i de tynde filamenter, og MHC og MLC 1, 2 og 3 i de tykke filamenter. Figur 3 Sølvfarvet 2D-gel af 60 µg opløst torskemuskel protein efter 6 måneders lagring ved -30 ºC og 7 dage i MAP, ved 2 ºC Den stiplede firkant viser området, hvor der er analyseret videre på proteinpletterne. Proteinpletter, der ændrer sig i koncentration som følge som lagringstiden, er identificeret med nano-lc-ms/ms (boks 5), og er markeret med en cirkel. Plet 3506, 3412, 2108 og 5104 er fragmenter af hhv. aktin, MHC og nucleoside diphosphate kinase B. Plet 8110, 8108 og 9101 er ikke blevet identificeret, men er markeret, da det er nogle af de proteiner, der korrelerer stærkt med fryselagringstiden. Endvidere så vi markante ændringer af proteinerne: triose-phosphate isomerase (plet 6303), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (plet 8702) og aldolase A (plet I de prøver, som havde været frosset i 12 måneder viste stigningen i koncentrationen af aktinfragmenterne (plet 3412 og 3506), at der var sket en nedbrydning af aktin. 45

Figur 4 PCA score og loadingsplot af data fra 2D-gelerne (A) Scoreplot af alle prøverne. Prøverne er navngivet som vist i figur 1. (B) Loadingsplot. De proteinpletter, der er meget af i prøver, der har været frosset i 3 og 6 mdr., ligger længst til højre, mens de proteinpletter, der har en høj koncentration i de fisk, der har været frosset i 12 mdr. ligger længst til venstre. Principal komponent 2 4 2 0-2 -4 A -30: 1 2 : 00-30: 1 2 :1 4-3 0:1 2 :00-20:1 2 : 1 4-20: 1 2 : 1 4-30:1 2 :1 4-20: 1 2 : 00 Scores -30:06:07-30: 06: 07-20: 06:1 4-20:06: -30: 06:1 1 4 4-30:03 :00-30:06:00-20: 06: 00-30:03 :1 4-3 0:03 :00-30:06:00-30:03 :1 4-5 -4-3 -2-1 0 1 2 3 4 Principal komponent 1 Principal komponent 2 0.3 0.2 0.1 0-0.1-0.2 B X-loadings 71 04 71 02 5 1 04 7401 1 1 1 1 4 2004 21 08 73 3 408 02 2 4 2 4 5 1 5 5 63 09 1 403 21 06 1 404 5 5 4 5 1 1 21 2 1 3 2 2 2 2 2 7 2 5 2 2 2 2 4 5 4 4 4 4 402 4 3 5 4 2 4 7 4 5 5 5 5 5 5 7 7 1 21 206 0 11 5 1 01 201 408 41 503 504 604 1 0 1 21 3 208 1 1 508 505 809 704 409 605 041 1 209 1 3 05 1 402 25 052207 1 21 2706 003 3 1 3 407 5161 06 3 35503 3 21 3 1 04 61 6503 71 01 01 717001 08 7807 3 4051 033 21 107 1 505 1 1 701 51 204 1 01 509 1 203 1 401 507 502 3 2 81 4 03 207 21 4 1 1 21 406 604 703 21 011 3 006 3 702 5 501 1 5602 04 1 603 51 1 506 801 2005 23 409 2204 2604 3 3 23 2209 606 708 1 61 1 706 21 704 0 21 03 21 09 21 23 02 2208 2404 2202 2201 2203 21 2206 2205 2702 23 26052606 09 23 206 41 3 34003 06 23 23 261 2401 1 2502 2402 2501 24062405 2705 3 2704 2409 07 2801 203 205 201 603 3 208 21 21 2408 1 2607 3 03 008 1 261 61 2 1 2708 2808 1 3 4 209 3 3 506 509 221 3 40044006 5404 6001 602 341 607 4401 41 4406 5409 3 3 3 202 3 3 403 605 3 803 41 41 4205 43 41 4202 4203 4206 054141 01 4201 4204 43 4405 4403 43 43 441 4407 4503 4502 4504 4606 43 4607 4608 5002 4402 5005 14806 53 51 01 5 3 08 5407 5 4408 4409 4601 3 604 321 1 1 1 347 404 4602 2703 4604 01 3 701 47 53 401 53 5 53 5402 5405 5406 408 403 5 41 55 5 504 5502 55055 601 5 41 1 5 507 5603 5604 5605 5602 5606 5609 57 5561 5607 5703 571 5806 56006 803 61 6003 5807 5708 5705 09 581 0 61 61 7404 08 63 62056206 63 6201 6202 640264 6603 64056404 6407 7202 65 6406 6403 6203 61 63 6204 63 6408 6502 6208 6604 6606 6504 6608 63 6601 63 6605 03 6607 6703 7407 8201 6705 71 74027 73 7207 77206 17204 6707 7403 3 6706 6709 205 7504 7 6602 6701 005 75077 501 761 7605 7607 4704 61 63 5801 4805 6704 6708 203 761 7508 7604 6801 1 7606 7601 7702 681 503 7405 7406 7506 7608 7603 6808 7602 0 7703 761 2 7705 81 7701 708 01 81 83 8509 7 7709 0 7802 01 83 7804 81 83 85 098401 81 7806 7803 7 81 0 8005 81 8204 8403 8502 83 8406 0783 8407 1 8202 8405 0 8803 8701 8802 8501 8404 8601 8408 106 06 7 509 81 1 0 818602 8703 71 85 7502 03 8402 851 1 9406 8702 48014808 9407 4404 9405 81 08 4705 4702 1 47 507 2603 4803 4804 4605 03 3 7 02 2403 261 2806 91 01 2 3 1 09 8809 3 402 7 4 2707 45 05 2601 261 2608 5 2609 3 704 401 4603 2503 3 705-0.3-0.1 5-0.1 0-0.05 0 0.05 0.1 0 0.1 5 0.20 0.25 Principal komponent 1 46

FISK & HAV 2006 nr. 61 Samtidig A så vi, at tropomyosin (plet 1710), som er det protein, der binder aktinfilamenterne sammen, også nedbrydes, og derved bliver de tynde filamenters struktur blødere. MHC udgør basis i de tykke filamenter. I prøverne så vi, at koncentrationen af et MHC fragment steg under lagringsforløbet, samtidig med at koncentrationen af MLC 1, 2 og 3 faldt. Begge dele er klare tegn på, at de tykke filamenter også bliver nedbrudt. Tilsammen udgør de ovenfornævnte proteiner grundstrukturen i muskelcellerne. Ændringer i koncentrationen, interaktionen og bindingen af disse proteiner viser, at der er en klar sammenhæng mellem fryselagringstiden, og graden af hvor ødelagt muskelstrukturerne bliver. Disse ødelæggelser er sandsynligvis årsagen til, at fiskemusklen under fryselagring mister sin evne til at binde vand, hvilket igen betyder, at fiskekødet efter tilberedning vil blive mindre saftigt. Torsk og gris Proteomanalyser af forskellige opbevaringsforløb for svinekød viser en stigning i koncentrationen af et aktin-fragment, der minder om det, vi finder i torsk. Det indikerer, at mønsteret for proteinnedbrydningen er det samme i begge arter. Et faktum der eventuelt kan udnyttes, hvis det lykkes at identificere en proteinmarkør for kvalitet. Proteomanalyse kombineret med multivariat dataanalyse Efter den traditionelle analyse af proteinpletterne blev proteomdata underkastet endnu en analyse. Denne gang blev der anvendt et multivariat databehandlingsprogram kaldet unscrambler (boks 4). I B PCA scoreplottet af proteinpletterne fra 2D-gelerne ses det, at prøverne danner to grupper (figur 4A). En i højre side af diagrammet med prøver fra alle de fisk, der har været frosset i 3 eller 6 måneder og en til venstre, som indeholder alle de prøver, der har været frosset i 12 måneder. I PCA loadingsplottet (figur 4B) ses x-variablene dvs. proteinpletnumrene. Proteinpletterne i venstre udkant af plottet er dem, der er kraftige i prøverne efter 12 måneders fryselagring f. eks. plet 7104, mens f.eks. plet 8803 er kraftig i 3 og 6 måneds prøverne. Dette ses også i gelerne (figur 2). Ved at kigge på akserne ses, at 17 % af variationen beskrives af PC1, der beskriver forskellene i fryselagringstiden, nemlig 3 og 6 måneder versus 12 måneders fryselagring. Langs PC2 kan grupperingen ikke beskrives i forhold til lagringsbetingelserne (det eksperimentelle design), men kan skyldes individforskelle i de enkelte fisk, som f.eks. alder eller køn. Desværre har vi ikke information om denne biologiske variation i dette forsøg. Det fremgår, at der ikke er den store forskel i proteinpletmønsteret alt efter om prøverne har været opbevaret ved -20 ºC eller -30 ºC eller 0 eller 7 dage ved 2 ºC. Ved at lave en DPLSR (boks 4) af proteomdataene (figur 5) finder vi, at 288 ud af de i alt 504 proteinpletter i datasættet korrelerer med fryselagringstiden. Resultatet er vist i et korrelationsplot hvor alle x- og y-variable er vist i samme graf. De proteinpletter, der ligger i samme område som en designvariabel (f.eks. temperaturen), korrelerer med denne. Analysen viser altså, at prøver fra de fisk, der havde været frosset i tre eller seks måneder klart adskilte sig fra de prøver, hvor fisken havde været frosset i tolv måneder. Resultaterne viser endvidere, at der efter 6-47

Figur 5 DPLSR af x (proteinpletterne) og y (designvariablene) Der er vist et korrelations loadingsplot af x og y variablene. Proteinpletter, der er refereret til i teksten, er markeret med en større skrift og indrammet med en sort kant. Se figur 3 for identiteten af pletterne. Designvariablene er markeret med en større skrift og indrammet med en stiplet kant. Cirklerne repræsenterer hhv. 50 % og 100 % forklaret varians. Principal komponent 1 1.0 0.5 0-0.5-1.0 P C2C 2 3 M 2603 2601 2609 1 507 3 1 1 1 2503 6801 261 5 4605 5 261 2 63 01 27086702 6701 502 6808 508 261 1 2703 81 03 4603 7502 4601 4704 3 54707 91 01 2806 1 1 1 2 4503 4408 1 02 4308 2408 8602 3 803 4702 1 207 9405 24033 1 09 4405 2202 4706 3 12406 3 4402 7803 851 23 08 4205 5507 4705 3 60523 1 571 0 0 5509 8404 7509 3402 2705 3 3 04 43 5 7 5 3 7705 2402 07 4407 4004 3 208 31 201 1 05 4306 4409 5801 6601 8005 83 09 8703 0d 8809 4502 4701 7-3 0 C 1 1 5807 211 502 05 23 7806 3202 3 3 3 1 2005 3403 07 5 1 1604 1 01 3 02 3602 41 04 4606 5402 7506 681 7503 1 6206 771 1 705 81 4 1 505 2502 3 1 53 082607 41 3 21 051 5708 61 6605 63 046704 703 9406 7 61 02 7 3 2505 20231 05 3 21 3 6708 81 08 43 03 31 02 7701 71 1 1 09 1 401 603 3 5504 71 63 3006 41 1 21 4 7 503 1 708 2206 61 11 51 1 1 208 509 5 1 7703 1 23 3 407 405 5201 61 06 61 05 8163 06 83 0205 83 0508 581 0 6205 761 06 1 4d 01 0 7 7 7405 6504 1 7 1 0 7302 2605 2209 2808 5608 7601 541 6006 1 6402 1 2M5404 2207 3 7706 81 1 0 21 1 206 506 1 201 1 702 3 1 1 03 1 3 04 23 09 2606 3 409 51 06 61 03 6608 6204 6401 5503 5601 7204 7207 81 05 851 8204 0 73 43 02 51 1 51 0 21 09 232305 03 6603 6505 7 703 7501 8803 8601 8201 02 3 207530931 3 304 06 64053 406 4608 1 5014806 6309 84087804 83 07 73 706 5 8802 1 21 1 212 02004 1 307 8501 7702 1 403 3 204 5408 7508561 0 51 01 2706 6001 7607 7608 1 404 5706 5709 73 205 06 303-20 C 3 02 7604 6604 7 7 81 04 5609 201 21 03 303 3 003 53 5502 720271 086406 21 02 1 1 04 3 206 51 05 5303761 7603 2 7807 21 08 1541 30 1 203 3 3 7606 5803 1 204 1 2604 17205 1 1 6606 7404 1 01 7708 5002 8405 1 21 3 3 41 2 Correlation Loadings (x and Y) 7407 71 02 717 1 04 7d7 d 515 1 04 6M 8702 P C 1-1.0-0.5 0 0.5 1.0 Principal komponent 1 48 12 måneder sker flere markante ændringer i proteinstrukturen uafhængig af frysetemperaturen. Om hastigheden, hvormed disse proteinændringer indtræder, afhænger af frysetemperaturen, kan vi ikke sige noget om ud fra dette forsøg. Ved brug af den multivariate dataanalyse blev det muligt for os at udpege nogle af de proteiner, der ændrede sig mest under fryselagringsforløbet. Samtidig bekræftede analyserne at: 1) Opbevaring på frost i mere end seks måneder giver den største ændring i proteinmønsteret i torskemusklen, 2) De proteiner, der ændrer sig mest, er de strukturelle proteiner i muskelfilamenterne og 3) Det er både proteiner fra de tynde og tykke filamenter, der bliver nedbrudt. Med andre ord vil frysning i mere end seks måneder ændre muskelstrukturen og dermed spisekvaliteten. Udviklingsmuligheder I dag baserer mange virksomheder en stor del af deres produktion af fiskeprodukter på frosne råvarer, hvor kvaliteten af råvaren naturligvis vil afhænge af såvel frostperioden som opbevaringstemperaturen. Derfor er identifikationen af markørproteiner særdeles interessant, da det på længere sigt kan føre til udviklingen af et værktøj, som forarbejdningsindustrien kan bruge til hurtigt at vurdere kvaliteten af de råvarer, de køber. På kort sigt er der imidlertid behov for yderligere analyser ikke bare af de proteiner og enzymer, der ændrer sig under fryselagring, men også de proteiner der ændrer sig under kølelagring, opdræt og stress, og som også har betydning for spisekvaliteten. En stor del af vores spisefisk er ferske. Det er derfor også yderst relevant at undersøge mulige markørproteiner for ferske fisk både

FISK & HAV 2006 nr. 61 mht. A kølelagringstid og -temperatur. På baggrund af de ovenfor nævnte og potentielle markørproteiner for fryselagring vil det være oplagt at undersøge, om det er muligt at udvikle immunoassays eller enzymassays dvs. relativt hurtige og brugervenlige metoder, der kan indikere råvarens kvalitet. B Forkortelser anvendt i artiklen: DPLSR: Discriminant partial least squares regression; GADPH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease; LC; liquid chromatography; MAP: modificeret atmosfære pakning; MCL: myosin light chain; MHC: myosin heavy chain; PCA: principial component analysis; TIM: triose-phosphate isomerase Figurerne 1, 2, 3, 4a, 4b og 5 er venligst gengivet med tilladelse efter: Changes in cod muscle proteins during frozen storage revealed by proteome analysis and multivariate data analysis, Inger V. H. Kjærsgård, Mette R. Nørrelykke and Flemming Jessen, Proteomics 2006, 6, 1606-1618 Litteratur: Changes in cod muscle proteins during frozen storage revealed by proteome analysis and multivariate data analysis. Inger V. H. Kjærsgård, Mette R. Nørrelykke and Flemming Jessen. Proteomics 2006, 6: 1606 1618. 49

Boks 1 Eukaryote celler Skitsen giver et overblik over, hvordan alle eukaryote celler (celler med kerner) er opbygget. Bakterier og svampe har en anden opbygning i cellen. Hver eneste celle i en eukaryot organisme har det samme genome. Dvs. at DNA et i cellekernen er identisk i f.eks. vores hud-, øjen- og muskelceller. Det, der bestemmer celletypen, er, hvilke gener fra DNA et der bliver oversat (transcriberet) til mrna, der så igen bliver oversat (translateret) til proteiner. En celle De tre grundmolekyler i cellen og de informationer, de giver: DNA: Vores arvemateriale, som er ens fra top til tå, består af fire baser (adenine, guanine, cytosine, thymine), der sættes sammen efter hinanden. DNA et er dobbeltstrenget, og de to DNA-strenge binder sammen nærmest som en lynlås. mrna: transcriberet fra DNA Er mellemleddet mellem DNA et og proteinerne. Fortæller hvilke gener, der er tændt og slukket for. Som DNA et består det af fire baser (adenine, guanine, cytosine, uracil). mrna sekvensen er en enkeltstrenget kopi af DNA sekvensen. Protein: translateret fra mrna Udfører opgaver som enzymkatalyse, transport og lagring af f.eks. ilt, koordinering af bevægelse, immunforsvar, kontrol af vækst og opbygning af struktur. Proteiner består af 20 aminosyrer og kan desuden være modificerede på forskellige måder (f.eks. glykosyleret og fosforyleret). Hvilke proteiner er udtrykt? Ydre faktorer som stress, miljø og udvikling kan regulere hvilke proteiner, der udtrykkes i cellerne. Det sker både ved at påvirke det mrna, der bliver transcriberet, og de proteiner, der bliver translateret. Når vi spiser sker der f.eks. en kraftig ændring i sammensætningen af de fordøjelsesenzymer, som er i vores spyt. En celle Genomet DNA DNA Transkribtomet: mrna transkriberet fra genomet mrna Protein Proteomet: Proteiner udtrykt fra genomet 50 Stress, miljø & udvikling

FISK & HAV 2006 nr. 61 Filamenterne A glider ind og ud imellem hinanden, B når musklen arbejder. De tykke filamenter består primært af proteinet myosin heavy chain (MHC) og af tre myosin light chains (MLC 1, 2 og 3). Udover et ATP (adenine triphosphate) og to MLC bindingssteder har MHC et aktin bindingssted. De tynde filamenter består primært af aktin, samt tropomyosin og troponin. Derved dannes der et netværk af tynde og tykke filamenter, der udgør basisstrukturen i muskler. De nævnte proteiner, der er byggestene i disse tykke og tynde filamenter, refereres ofte til som de myofibrilære proteiner. Boks 2 Muskelvæv Fibrene i en muskelcelle er opbygget af tynde og tykke proteinfilamenter Hvad sker der i musklen? Tynde filamenter Tykke filamenter Tynde filamenter Tropomyosin Troponin Actin Troponin Tykke filamenter Myosin Myosin Myosin hovedet Myosin hovedet Hængsel området Hængsel området Haleregionen, to heliske proteiner Haleregionen, to heliske proteiner Tilpasset fra General Biology Laboratory Exercises 51

Boks 3 Proteom-analysen Skitsen giver et overblik over de forskellige trin i proteomanalysen Proteomanalyse giver et øjebliksbillede af de proteiner, der er i et bestemt væv eller en bestemt celletype på det tidspunkt, hvor prøven bliver taget. 1 2 1D: Ladning 3 2D: Størrelse Massespektrometri 6 Multivariantdataanalyse 5 4 Gelanalyse 1 Fiskemusklens proteiner opløses. De kan evt. opdeles i forskellige fraktioner, inden de analyseres. 2 Proteinerne adskilles først efter deres ladning (pi). 3 Proteinerne adskilles derpå efter deres størrelse (kda). Dette sker i, hvad der kaldes en 2-dimensionel gel (2D-gel), da proteinerne på den er adskilt i to retninger efter ladning og efter størrelse. 4 Proteinerne i gelen farves og proteinerne analyseres med et specielt billedbehandlingsprogram. 5 Multivariat dataanalyse kan anvendes for at uddrage størst mulig information fra gelerne. Da der ofte ses flere tusinde proteiner på en gel, er det ret komplekse data at arbejde med. 6 Proteiner af interesse kan identificeres med massespektrometri Saturerede proteinpletter: Protein der er til stede i så høj koncentration, at sølvfarvningen bliver mættet, dvs. den ligger udenfor det lineære område, derfor er det ikke muligt at kvantificere proteinmængden. Pletnumre: De enkelte proteinpletter i 2D-gel billedet bliver tildelt et pletnummer af billedbehandlingsprogrammet. Nummereringen angiver lokaliteten i gelen, der starter med nr. 1 i nederste venstre hjørne. Numrene stiger op gennem gelen, og når toppen af gelen er nået, fortsætter programmet nedefra. Derfor kan en proteinplet godt have nummer 10.000, selvom der kun er 500 pletter på gelen. 52

FISK & HAV 2006 nr. 61 A B B C A B C 6 6 6 14 14 14 1 12 51 51 1 12 51 51 1 12 30 30 30 30 30 30 Relativ intensitet 51 51 Boks 4 Dataanalyse af 2D-gel data. Klassisk statistikanalyse: Når gelerne bliver scannet kan de sammenlignes i specielle 2D-gel databehandlingsprogrammer. Her bliver de pletter der, på tværs af de forskellige geler er de samme, passet sammen, og man kan derved sammenligne intensiteten i pletterne fra forskellige geler/ prøver, som det her er skitseret for prøve A, B, C. 1 6 12 14 30 51 Protein plet nummer Ved at lave klassisk statistisk dataanalyse på proteinplet-intensiterne vil man kunne se, hvordan proteinsammensætningen varierer, og om ændringer fra en lagringsbetingelse til en anden giver signifikante ændringer. I det forsøg, der er beskrevet her, er der i alt analyseret på 504 proteinpletter, og det er umuligt at se, om der er en sammenhæng mellem hvilke proteinpletter, der stiger, og hvilke der falder i intensitet. Multivariat dataanalyse: I datasæt med store mængder data, som dem der fås fra 2D-geler, giver det god mening at analysere på alle målte proteinpletter på en gang. Dette kan gøres med multivariat dataanalyse, hvor man både kan reducere støjen, og få fokus på de proteinpletter, der ændrer sig markant under lagringsforløbet. Principial komponent analyse (PCA) udføres på en matrice, der kaldes X- matricen. Denne matrice indeholder informationen af de observerede data såsom proteinpletnummer og proteinpletintensitet, samt prøvenavn. Forskellene i proteinpletintensiteterne afspejler den enkelte prøves proteinsammensætning og giver dermed en slags fingeraftryk af prøven. 53

Tabel X-matrice Plet 1 Plet 6 Plet 12 Plet 14 Plet.. Prøve A 1* 3 11 14 Prøve B 1 3 11 4 Prøve C 10 3 11 14......... * Disse tal svarer til den pletintensitet, der er vist i figuren ovenover. Når PCA beregningen er udført, får man et overblik over relationerne eller grupperingerne mellem prøverne. Efter PCA bliver data repræsenteret som en matrix af systematisk variation og støj. X-matrice med observerede data Datastruktur Støj = + 54 I X-matricen er data repræsenteret i et n-dimensionalt rum med lige så mange dimensioner som der som der er variable (n). Formålet med PCA er at beskrive de observerede data med nogle få principal komponenter (PC1, PC2,.), hvor den største variation i datasættet beskrives langs PC1, den næststørste langs PC2 osv. Herved er det relativt nemt at vurdere, hvad der er den største variation i et datasæt. Resultaterne vises typisk grafisk i et scoreplot og et loadingplot. Scoreplottet viser, om der er grupperinger mellem de forskellige prøver (her lagringsbetingelserne), og loadingsplottet viser, hvilke variable (her proteinpletter) der beskriver variationen mellem prøverne. Discriminant partial least squares regression (DPLSR) En udbygning af den multivariante dataanalyse metode PCA er discriminant partial least squeare regression (DPLSR), hvor information om forsøgsopsættet tages med i beregningerne. Man kan f.eks. bestemme hvor mange af x-variablene (proteinpletterne), der korrelerer med fryselagringstiden. X-matricen en den samme som for PCA beregningerne, mens Y-matricen (en designmatrice) indeholder information om forsøgsdesignet, dvs. ydre faktorer som f.eks. lagringsbetingelserne, (frysetemperatur, fryselagringstid, kølelagringstid). I designmatricen bruges kun værdierne 0 og 1: Man regner derfor ikke på de aktuelle værdier som fryselagringstiden på 3, 6 eller 12 måneder, men på om en prøve har haft de givne lagringsbetingelser, prøve A: har f.eks. været frosset i 3 mdr. ved -30 ºC.

FISK & HAV 2006 nr. 61 A FLT 3 mdr. FLT 6 mdr. FLT 12 mdr. B FT -30 ºC Prøve A 1 0 0 1 Prøve B 0 1 0 1 Prøve C 0 0 1 0....... 1. Separation af proteiner, 2D-GE Tabel Y-matrice: Boks 5 Massespektrometri Skitse af massespektrometri af proteiner adskilt ved 2D-gel elektroforese. 2. In-gel trypsin fordøjelse 3. Peptid separation ved væskekromatografi 4. Massespektrometrisk analyse af peptid K C S G N A E S V m /z Resultat af databasesøgning LOCUS NP_660293 199 aa linear PRI 23. juni 2005 DEFINITION ribonuclease, RNase A family, 11 (non-active) (Homo sapiens) 5. Identifikation af protein vha. peptid med aminosyresekvens VSEANGSCK 1: Efter 2D-gel elektroforese skæres de pletter ud, man gerne vil kende identiteten af. 2: Proteinerne fordøjes med en protease oftest trypsin. 3: Peptiderne separeres med væskekromatografi. 4: Man får data om massen på de enkelte peptider. 5: Ved yderligere analyser kan man få aminosyresekvensen på peptidet. 55

Proteinet identificeres ved at søge i sekvensdatabaser på nettet. Man kan bruge både peptidmasserne og peptidsekvenserne til at søge med. Søgning i databaserne med peptidmasser: Det er nemmest og hurtigst at bruge peptidmasserne til at søge i databaserne, men det kræver at sekvensen for det protein, man gerne vil identificere, er i databaserne. Typisk er proteinsekvenser omkring 80-90 % identiske fra en art til en anden. Derfor er det svært at bruge peptidmasserne til at identificere proteiner på tværs af arter, da substitutionen af en aminosyre ofte ændrer peptidmasserne markant. Søgning i databaserne med peptidsekvenser: Da aminosyresubstitutioner i en peptidsekvens nemt kan identificeres, kan et protein identificeres ved at sammenligne peptidsekvenserne fra en proteinplet med proteiner i databaserne. Ved at bruge peptidsekvenser kan man identificere proteiner på tværs af arter. Med i overvejelserne til proteinidentifikationer hører også en vurdering af, om de eksperimentelle og teoretiske pi og MW værdier stemmer overens. Hvis disse er meget forskellige, er det identificerede protein typisk et fragment af fuldlængde proteinet. 56