Eukaryote mrna Processering

Eukaryote mrna Processering Splicing Capping Poly-adenylering Post-transkriptionel regulering af genexpression Simpel prokaryotisk gen-ekspression Alt RNA bliver syntetiseret af en enkelt RNA-polymerase mrna translateres under transkriptionen mrna et har præcis samme sekvens som DNA et mrna et er ofte polycistronisk Kompliceret gen-ekspression i eukaryoter Kompleks kromatinstruktur Gener er ofte afbrudte af ikkekodende sekvenser, kaldet introns. Tre klasser af RNA polymeraser syntetiser tre klasser af mrna. Transkription og translation er adskilt mrna syntesen forgår i to trin: pre-mrna (indh. exons/intons ) mrna (kodende, cappet og polyadenyleret) mrna et er monocistronisk. Eukaryote mrna Processering Splicing Capping Poly-adenylering Post-transkriptionel regulering af genexpression 1

Splicing Den proces, hvor ikke-kodende RNA fjernes fra det primære transkript R-looping forsøg viser, at genomisk DNA indeholder introns Exon Kodende sekvens af et eukaryot gen Intron Ikke-kodende sekvens, der afbryder den kodende sekvens af et eukaryot gen Fig 14.1 Bliver introns transkriberet? Simplificeret mekanisme for pre-mrna splicing Ja introns bliver transkriberet Fig 14.3 Fig 14.2 2

Splicing Signals Splicing processen Konsensus-sekvenser Alle introns i pre-mrna starter og slutter på samme måde: exon/gu-intron-ag/exon Splicing signalet er mere komplekst end som så: 5 AG/GUAAGU-intron-YNCURAC-Y n AG/G-3 A: forgrenings-punktet branchpoint (BP) Fig 14.4 Påvisning af forskellige splice intermediater Signal at the Branch Branchpoint konsensus sekvenser spiller en vigtig rolle sammen med konsensus sekvenserne i 5 - og 3 - enderne af introns Gær sekvens er altid: UACUAAC Højere eukaryote konsensus sekvens variere mere Det forgrenede (branched) nukleotid er det sidste A i denne sekvens 10 % polyacrylamid gel Fig. 14.5 Fig 14.8 3

Spliceosomer the spliceosome Splicing finder sted på en partikel kaldet et splisosom Gær spliceosomer and mammale spliceosomer har sedimentation koefficienter på 40S and 60S Spliceosomer indenholder premrna Sammen med snrnps og protein splicing faktorer Disse genkender splicing signalerne og styrer splicing processen Fig 14.9 Spliceosomet består af pre-mrna og 5 snrnps: U1, U2, U4, U5 og U6 Fig 14.27 Snurps alias små nukleare ribonucleoproteiner alias snrnps består af små nukleare RNA molekyler (snrna) koblet til proteiner (ca. 145 ialt; 7 Sm proteiner, som findes i alle snrnps og en masse, der vil være specifikke for hver enkelt snrnp) Metoder til påvisning af RNAinteraktioner RNase protection assay Cross linking med f.eks. 4-thioU Introduktion af mutations i gær Det er snrna, der genkender konsensusområderne dvs snrna erne vil være komplementærer til de forskellige konsensus-sekvenser i exons og introns 4

RNase protection the spliceosome Commitment complex Fig 14.11, 12, 13 Spliceosomet består af pre-mrna og 5 snrnps: U1, U2, U4, U5 og U6 Fig 14.27 Initiering af kommitment komplexet Yeast two hybrid screening Tre facts: Branchpoint Bridging Protein (BBP) og en anden faktor binder til pre-mrna et og initierer binding af de 5 snrnp A) Transcriptions-aktivatorer har typisk et DNA-bindende domæne og et transkriptions-aktiverende domæne B) De to domæner er aktive hver for sig; dvs. BD kan selv binde til DNA og AD kan selv interagere med basal komplexet. C) Rapporter-genet indeholder enhancer, promotor og rapporter-gen Fig 14.36 Fig 14.34 5

Yeast two hybrid med GAL4 og lacz systemet Alternativ splicing Splicing af det samme pre-mrna på to eller flere måder, - giver ophav til to eller flere mrnas, - producerer to eller flere protein produkter Fig 14.35 Hvordan styres alternativ splicing Alternative splicing is controlled by the binding of trans-acting protein factors to cis-acting sequences within the pre-mrna leading to differential use of splice sites. Many such sequences have been identified and are grouped as either enhancer or suppressor elements (for a review on splicing regulatory elements, see Ladd and Cooper 2002). These elements are generally short (8-10 nucleotides long) and are even less conserved than those present at exon-intron junctions. Control of alternative splice site recognition is mediated by members of the SR (serine rich) protein family of splicing factors which bind to the splicing enhancer and inhibitor elements. The interactions of these proteins with the pre-mrna substrate and with snrnp proteins have been intensively studied. Their role in regulating splice site selection is believed to occur in two (perhaps non-exclusive) modes arginine-serine (RS) domain dependent and RS domain independent (Cartegni et al., 2002) (see the animation below). Hvilken betydning har alternativ splicing? Efter sekventeringen af det humane genom skønnes det, at der findes mellem 30.000 og 40.000 gener. Fra ESTs (Expressed Sequence Tags) har man skønnet, at der er mellem 100.000-150.000 gener Denne store forskel på reel gen-sekvens og mrna niveauet kan til dels - forklares med alternativ splicing. http://www.exonhit.com/alternativesplicing/pages/rna_processing/3/index.html 6

En sidste bemærkning om splicing Nogle introns kan splice sig selv ud - uden hjælp fra protein Eukaryote mrna Processering Splicing Capping Poly-adenylering Post-transkriptionel regulering af gen-expression Capping Tagging af 5 enden af RNA med en struktur kaldet cap egentlig et blokerende nukleotid cap: en methyleret guanosin bundet gennem a 5-5 tri-fosfat binding til 5 enden af mrna, pre-mrna eller snrna The Cell by Cooper et al. 7

In vitro transkription + cap syntese: [ 32 P]-nucleotider ±[ 3 H]S adenosyl methionin (AdoMet) Papirskormatografi: - Mononukleotider (-2) - Methyleret CAP (-5) Cap strukturen Cap strukturen Mærkning med [β,γ- 32 P]ATP men ikke med [γ- 32 P]ATP -β-fosfat, men ikke γ-fosfat, sidder i cappen -cappen sidder i 5 enden af RNA et β-fosfat kan ikke fjernes med alkalisk fosfatase -β-fosfatet er blokeret Fig 15.1 Fig 2.9+2.10 Cap strukturen Reoviral cap structure (cap1) Blokking agent fjernes med fosfodiesterase skær både α og β fosfat frigivet et produkt Xp fosfomonoesterase X tilbage Fig 15.2 Fig 15.3 8

cap syntesen Cap funktioner 1. Øger RNA ets stabilitet 2. Øger translabiliteten af mrna et 3. Øger transport af mrna et fra kernen til cytoplasmaet 4. Øger effektiviteten af mrna-splicing CAPPING forekommer inden pre-mrna er er 30 nt. langt Fig 15.4 Stabilitet Cappen beskytter mod RNaser: 5 -specifikke Trifosfat-bindinger er ikke substrat Forsøg I: m 7 GpppG m (grøn) GpppG (blå) ikke cappet (rød) Cap stimulerer translationen af mrna cap binding protein dirigerer ribosomerne på mrna ingen cap= ingen CBP-interaktion = dårlig translation Table 15.1 Synergism between Poly(A) and cap during translation of a luciferase mrna in Tobacco Protoplasts mrna Uncapped Luciferase mrna Half-life (min) Luciferase Activity (light units/mg protein) Relative Effect of poly(a) on Activity Relative Effect of Cap on Activity Glycerol gradient centrifugation Poly(A) - 31 2,941 1 1 Poly(A) + 44 4,480 1.5 1 Capped Poly(A) - 53 62,595 1 21 Poly(A) + 100 1,333,917 21 297 Fig 15.6 9

transport af mrna et fra kernen til cytoplasma snrna U1 transkriberes af RNA polymerase II m 7 G og sendt ud i cytoplasma snrna U6 transkriberes af RNA polymerase III - capning (trifosfat i 5 enden) og den bliver i cellekernen U1 snrnaet syntetiseres i kernen, og processeres med m7cap og polya halen. Eksporters ud i cytosolet, hvor cappen bliver tri-methyleret og Sm proteiner binder til specifikke RNA sekvenser. Dette kompleks transporteres derefter tilbage i kernen, hvor snurp U1 er involveret i splicing processen. Capping af U1 snrna et er nødvendig for dets transport ud i cytoplasma Oocyte U1 genet under kontrol af humant RNA poliii U6 promotor WT og mutanter, med deletioner protein-interaktions områder. Injection i oocyter + [α 32 P]GTP + 5S rrna genet + α-amanitin (RNA polii inhibitor) RNA poliii -cap RNA polii +cap Cap kort methyleret guanosin bundet til 5 enden af RNA et via en 5-5 tri-fosfat binding funktioner: 1. Øger RNA ets stabilitet 2. Øger mrna ets translations-evne 3. Øger transport af mrna et fra kernen til cytoplasmaet 4. Øger effektiviteten af mrna-splicing (kommer senere) Fig 15.7 10

Eukaryote mrna Processering Splicing Capping Poly-adenylering Post-transkriptionel regulering af gen-expression Poly-adenylering Påsætning af AMP på 3 enden af et RNA molekyle Poly(A) halen 3 struktur, der består af en række AMP er - ca. 200 A-molekyler i 3 enden af et typisk eukaryotisk mrna Gennemsnitligt længde på 250 nukleotider Karakterisering af Poly(A) For at isolerer poly(a) halen, skæres mrna molekyler med RNase A og RNAse T1 dette efterlader de lange stræk af poly(a) RNase A skærer efter C og U RNase T1 skærer efter G Oprensning af radioaktivt mærket pre-mrna: Blå: kerne-poly(a) Rød: cytoplasma-poly(a) + RNase Gel-elektroforese Scintillations-tælling Fig 15.7 11

Poly(A) halen sidder på 3 enden af hnrna og mrna Hvor kommer poly(a) fra? Gener indeholder ikke lange poly(t) sekvenser, som kan kode for en poly(a) hale Actinomycin D hæmmer DNA transkription, men ikke polyadenylering poly(a)-halen sættes på post-transkriptionelt, af poly(a) polymerase (PAP) Fig 15.8 Poly(A) har samme funktioner som cappen! Poly(A) stabiliserer mrna i Xenopus leavis oocytter 1. Øger RNA ets stabilitet 2. Øger mrna ets translations-evne 3. Øger transport af mrna et fra kernen til cytoplasmaet 4. Øger effektiviteten af mrna-splicing globin mrna injektion i oocytter: Poly(A) + (grøn) Poly(A) - (rød) Fig 15.9 12

Beviser for at poly-adenylering øger translation af mrna et Tilsætttes et overskud af poly(a) til in vitro reaktion inhiberes translationen af cappet og polyadenyleret mrna. Poly(A) øger translationen Poly(A)-binding protein I (PABI) binder til Poly(A)-halen under translationen og booster translationseffektiviteten Effekt af polyadenylering på translationen af mrna i kanin retikulocyt extrakt Hvordan øger poly(a) halen translationen? Poly(A) + mrna er bedre til at danne polysomer end poly(a) - mrna Poly(A) øger translationen af både cappet og ikke cappet mrna Hvad er det lige et polysom er? et mrna med flere bundne ribosomer, der translaterer det samtidig Fig 15.10 13

Effekt af polyadenylering på rekruttering af mrna til polysomer Take home message Poly(A) halen øger både levetiden og translations-evnen af mrna hvad der lige er vigtigst afhænger af hvilket system man bruger. Mærk poly(a) + med 32 P og poly(a) - med 3 H! Inkuber i retikulocyt extraktet. Oprens polysomer - sucrosegradient ultracentrifugering Pil er monosome peak disomer, trisomer ect. til venstre Mekanismen bag poly-adenylering Bevis på at transkriptionen fortsætter forbi poly(a)-halen DMSO stimulation af erythroleukemia celler i nærværelse af [ 32 P]UTP Høj ekspression af globin pre-mrna (RUN on RNA). Hybridisering til DNA fragmenter A til F Fig 15.13 Fig 15.14 14

Polyadenylerings-signaler Hvordan ved RNA-processeringsmaskineriet at nu skal der poly-adenyleres? Polyadenylerings-konsensus-sekvens i mammale cellers DNA: AATAAA 20-30 bp inden polyadnylerings-sitet i RNA finder man AAUAAA ca. 20 nt up-strøms for poly(a) halen Forsøg der viser, at AAUAAA sekvensen er vigtig for skæringsprocessen af polyadenyleringen? S1 Mapping 1. Deletion af nukleotider mellem AATAAA og polyadenulerings sitet Deletioner flytter polyadenylerings-sitet længere downsteam med ca. samme det antal nukleotider som er deleteret 2. Bruge S1 analyse til at undersøge effekten af at indsætte flere AAUAAA sekvenser i RNA ets 3 ende Fig 5.27 15

S1 analyse af AAUAAA s funktion konsensus sekvensen Mutant SV40 virus (1471) med 2 AAUAAA sites, 240 nucleotider fra hinanden proben giver 680 bp bånd hvis 1. AAUAAA benyttes og 920 bp bånd hvis 2. AAUAAA benyttes AAUAAA i pre-rna et er nødvendig for polyadenylering Fig 15.15 Fig 15.16 AAUAAA er bare ikke nok Polyadenylerings-signalet Effektiv mammalian polyadenylerings signal består af et AAUAAA motiv ca. 20 nucleotider up-strøms et poly(a) site i premrna, efterfulgt af et GU-rigt motiv 23-24 nukleotider senere, og derefter et U-rigt motiv Variationer i disse sekvenser resulterer i forskellige polyadenylerings-effektiviteter U-rich 16

Polyadenylering = to processer CPSF binder til AAUAAA-motivet i pre-mrna Polyadenylering består egentlig af to processer: Kløvning Polyadenylering Et protein er fælles for begge processer: Cleavage and polyadenylation specificity factor CPSF gele mobility shift assay SDS Page of cross linked protiens Fig 15.22 Pre-mRNA skæring CPSF binder til AAUAAA Cleavage stimulating factor (CstF) binder til G/U regionen Cleavage factor I og II (CFI og CFII) Poly(A) polymerasen (PAP) RNA polii s involvering i skæringen af transkriptet Og så selvfølgelig lige RNA polymerase II 32 P mærket adeno-virus L3 pre-mrna inkuberet med CPSF, CstF, CFI-II og PAP og enten RNA pol IIA eller IIO Fig 15.17 17

CTD (carboxy-terminal domæne) er involveret i skæringen af det primære transkript Model af pre-cleavage komplex et CTD-GST fusionsprotein Glutathion affinitets kromotografi Fosforylering in vitro Fig 15.18 Fig 15.19 Påsætning af poly(a) halen Polyadenylerings-signalet er egentlig skæringssignalet initiering elongering Polyadenyleringsprocessen må have et andet signal Fig 15.26 18

AAUAAA er signalet for påsætning af poly(a)-halen Små syntetiske oligonukleotider, der indeholder AAUAAA sekvensen bliver polyadenyleret in vitro Polyadenylering af model RNA-substrater Både poly(a) polymerase og CPSF er nødvendig for poly-adenylering (CPSF) Optimale længde mellem AAUAAA og 3 - enden af RNA et er 8 nucleotider Fig 15.20 Polyadenyleringen foregår i to faser: initiering og elongering Fase 1 (initiering): Afhængig af AAUAAA sekvensen og binding af CPSF Påsætning af ca. 10 A er 58 nt + SV 40 Late RNA 58 nt SV 40 Late RNA Fase 2 (elongering): Uafhængig af AAUAAA sekvensen og CPSF ( AAGAAA+40A blev polyadenyleret) Påsætning af A er til fuldlængden af poly(a) halen er nået 32 P mærket RNA, in vitro polyadenylering med HELA celle kerne ekstrakt Fig 15.21 19

Elongeringsprocessen I elongeringsprocessen indgår PAP og polya binding protein-ii (PABII) PABII kan stimulerer polyadenylering af et model substrat lige som CPSF men det binder til poly(a) halen og ikke AAUAAA L3 pre: substrat RNA L3 preδ: substrat RNA med AAGAAA L3 pre + oligo A: substrat RNA + oligo A på 3 enden L3 preδ +oligo A: substrat RNA med AAGAAA + do Fig 15.24 Model for polyadenyleringen Poly(A) turn-over Poly(A) bliver nedbrudt i cytoplasma RNaser nedbryder poly(a) halen mens poly(a) polymeraser genopbygger poly(a) halen. Når poly(a) halen er væk, nedbrydes RNA et Fig 15.19 20

Polyadenylering kort Eukaryotiske mrna og pre-mrna har en kæde af AMP på ca. 250 nukleotider siddende på deres 3 ende. Polyadenyleringsprocessen forgår i to trin: skæring og polyadenylering Syntesen af polya halen forgår i to faser: Initiering (PAP, CPSF, AAUAAA) Elongering (PAP, PABII, min. 10 A er) CPSF & AAUAAA forstærker elongerings-processen Poly(A) halen nedbrydes i cytosolet. Koordination af de tre processering-begivenheder Cappen er essentiel for splicing af den første intron Poly(A) halen er essentiel for splicing af en sidste intron Capping, polyadenylering og splicing proteinerne associerer alle med CTD under transkriptionen mrna processering foregår cotranskriptionelt Poly(A) halen har samme funktioner som 5 cappen Cappens effekt på splicing In vitro transkription af δ-crystallin genet fra kylling +/- cap-analoger i tilstedeværelse af med 32 P rntp Derefter inkubation med kerne ekstrakt for at undersøge splicingsprocessen Fig 15.29 Et cap-bindende komplex (CBC) er involveret i dannelse af det første spliceosome Fig 15.30 21

Poly(A) halens effekt på splicing af det sidste intron Capping starter når mrna et er ca. 30 nt langt Polyadenyleringen sker mens RNA strengen stadig bliver syntetiseret Splicing starter under transcriptionen Capping og Polyadenylering stimulerer splicing af hhv. første og sidste Intron Associering mellem RNA poli s CTD og mrna processeings-proteinerne Fig 15.31 Binding af capping proteinet Guanylyl Transferase til CTD P Søjle med GST koblet til div. CTD former Hældt HeLa celle-ekstrakt på søjlen for at lave affinitetskromatografi. Testet eluatet med [ 32 P]GTP (GMP binder covalent til guanylyl transferasen: E+ GTP E-pG + PPi) Hvordan koordineres interaktionerne mellem CTD og de forskellige processerings-proteiner? De tre hovedklasser af processerings-proteinerne kommer og går afhængig af CTD s fosforyleringstilstand Fig 15.32 22

Chromatin Immunoprecipitering eller ChIP DNA-binding proteins cross-linkes til DNA med formaldehyde in vivo. Isolering af kromatinet. Skær DNA sammen med div. bundne proteiner i små fragmenter Bind antistoffer, der er specifikke for det DNA-bindende protein og isoler komplekset ved fældning med sekundære antistoffer bundet til sephadex kugler. Cross-linkingen reverteres for at frigive DNA et og derefter nedbryde proteinerne Brug PCR til at amplificere DNAspecifikke sekvenser for at se, om de er blevet fældet med antistoffet. Immunoprecipiteret kromatin med antistoffer rejst mod capping og polyadenylerings proteiner for derved at fange kromatin, der bliver transkriberet af RNA polymerase og samtidig binder disse proteiner Gyanylyl transferase Poly(A) faktori RNA polii subunit Fig 13.29, p 384 Fig 15.34 ChIP analyse af fosforyleringsmønsteret af CTD under forskellige stadier af transkriptionen Hypotese om RNA-processering organiseret af CTD CTD indeholder Repeated heptadpeptides med konsensus sekvensen: Y-S-P-T-S-P-S Manglende/lidt fosforylering Interaktion i promotor region Høj fosforylering Interaktion længere ned i CDS Fig 15.35 Fig 15.36 23

Transkriptions-terminering er tæt koblet til polyadenylering Transcriptions-termineringen er koblet til mrna 3 -ende processeringen pgcyc1: wt pgcyc1-512: polyadenylerings sekvens Assay for expressions-niveau (northern blot) Nuclear Run-On analyse Fig 15.37 Nuclear run-on analyse Transkriptions-terminering er tæt koblet til polyadenylering pgcyc1: wt pgcyc1-512: polyadenylerings sekvens Assay for expressions-niveau (northern blot) Nuclear Run On analyse pgcyc1-512 terminerer ikke korrekt Fig 5.32 p 120 Fig 15.40 24

Termineringsmekanismen 1. Regionen downstream fra poly(a) sitet er essentielt for terminering 2. Skæring af transkriptet flere steder downstream for poly(a) sitet er nødvendig for terminering 3. Denne skæring foregår co-transkriptionelt og sandsynligvis inden skæring ved poly(a) sitet Hvad ved vi nu: mrna processering finder sted under transkriptionen: Capping-processen starter når mrna er ca. 30 nucleotider langt Poly-adenylering startes af skæring ved polyadenylerings-sitet på et mrna molekyle, der stadigvæk syntetiseres. Splicing starter under transkriptionen. Capping og poly-adenylering stimulerer splicning af hhv. den første og sidste intron. Terminering af transcriptionen er afhængig af et intakt poly(a) site og proteinerne der er involveret i skæring. Fig 15.40 Eukaryote mrna Processering http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/lifecyclemrna_fla.html Splicing Capping Poly-adenylering Post-transkriptionel regulering af gen-expression 25

Prolactin regulerer primært casein genet på det post-transcriptionelle niveau Gen-ekspresions niveauet kan let kontrolleres via mrna stabilitet. Eksempel: cassein mrna Kontrol af stabiliteten af et mrna molekyle? Eksempel: Iron Response-Element Post-transkriptionel Silencing/RNA interference sirna Prolactin øger kun transkriptionen af casein genet 2-3 gange, mens koncentrationen casein-proteinet stiger meget mere Table 16.1 Species of RNA rrna poly(a) + RNA (short lived) poly(a) + RNA (long lived) Casein mrna Effect of Prolaction on Half-life of Casein mrna RNA half-life (h) -prolactin + prolactin > 790 >790 3.3 12.8 29 39 1.1 28.5 Table 16.1 Stabiliteten af transferrin receptor mrna et Jern homeostase i mammale celler styres af to proteiner transferrin receptoren og ferritin Transferrin receptoren (TfR) er et membran protein, der transporterer jern bundet til transferrin ind i cellen Ferritin er et cytoplasmatisk protein, der binder Fe og opbevarer det, til dårlige tider Fe mangel: TfR Ferritin Fe overskud: TfR Ferritin Post transkriptionel regulering: Translations-hastigheden af ferritin mrna stabiliteten af TfR TfR mrna et halveringstid ændres 26

Påvisning af Iron Response Elementer Sammenligning af fem stem-loop strukturer i TfR 3 UTR og IRE i 5 UTR af ferritin mrna et S1 analyse viser 678 nt downstream i 3 UTR indeholder Fe-response elementet Deleteres disse nucleotider bliver mrnaet super ustabilt Fig 16.21 Fig 16.22 EMSA assay til påvisning af IRE bindende proteiner i TfR s 3 UTR Lane 1: no competitor Lane 2: TfR mrna competitor Lane 3: ferritin mrna competitor Lane 4: β-globin mrna competitor Fe regulerer mrna stabiliteten: + Fe ustabilt TfR-RNA Hypotese: Proteiner binder til IRE i 3 UTR for at stabilisere mrna et Så mrna må i sig selv være ustabilt Og IRE binding proteins må binde ved lav [Fe] Viser sig at der i 3 enden er indeholder en RAPID TURNOVER DETERMINANT. 32 P mærket transkript, der svarer til 3 UTR med de 5 IRE Fig 16.23 27

rapid turn-over determinant? Syntetisk element uden A, E og central loop + Hemin + Desferrioxamine (Fe chelator) mrna niveau: Northern blot analyse Protein niveau: immunoprecipitering TRS-3: regulation + højt niveau af TfR protein TRS-4: lav regulation + lavt niveau af TfR protein Fig 16.24 Fig 16.25 Opsummering: IRE A og E, og det centrale loop kan ændres uden der sker noget med Fe-respons. Fjernes alle IRE er er TfR konstitutivt stabilt. Fe s effekt på stabiliteten af wt og mutant TfR mrnas Fig 26.31 28

Destabiliserings-model af TfR mrna et http://www.dr.dk/nyheder/udland/2006/10/02/113936.htm http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/ Fig 16.27 Postranskriptionel Gen Silencing eller RNA Interference (RNAi) Injektion i en celle af ds-rna kan blokere ekspressionen af et gen Repression af gen-transkription eller nedbrydning af mrna et??? C elegans ovarium injiceret med antisense (c) eller ds (d) mrna til mex-3 In situ hybridisering Fig 16.35 29

En nuclease nedbryder trigger dsrna til små stykker (ca. 25 bp) RNAi model ds-rna bliver skåret i småstykker (sirnas) af nucleasen Dicer Derefter dannes et RISC (RNA-induced silencing Complex) der sørger for at strengene bliver separerede De små RNA stykker binder til target mrnaet. Nucelaser nedbryder hybriderne Fig 16.31+32 Amplificering af sirna sirna bliver amplificeret under RNAi når antisense sirnas hybridiserer til target mrna et og primer syntesen af fuldlængde antisense RNA med RNA-dependent RNA polymerase. Det nye ds RNA blive choppet op til nye små sirna er af Dicer Fig 16.40 30