Påvisning af carbapenemaseproducerende bakterier ved hjælp af Carba NP test

Påvisning af carbapenemaseproducerende bakterier ved hjælp af Carba NP test Modul 14 Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen VIA University College Campus Nord Forår 2014 Udarbejdet af: Sara Thorhauge Christensen Studienummer: 155898 Afdeling: K-Vejleder: I-Vejleder: Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital Erica Bracher Jørgensen, Klinisk underviser på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital Turi Neubauer Cand. scient., Ph.D. Lektor, Bioanalytikeruddannelsen VIA University College Campus Nord Antal anslag: 62.795

Forord Bachelorprojektets praktiske del er udarbejdet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital i samarbejde med Peter Ehlert Jensen. Projektet er rette mod de ledende bioanalytikere på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital, da projektet undersøger mulighederne for implementering af Carba NP testen til hurtig detektion af carbapenemresistente bakterier. Jeg vil gerne sige tak til personalet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital, for at være imødekommende og behjælpelige. En særlig tak til itansvarlige bioanalytiker Freddy Iversen for at hjælpe os med indsamling af data. Tak til University College Nordjylland for lån af ph-meter, og ligeledes en tak til Klinisk Biokemisk Afdeling Aalborg Universitetshospital, for at stille utensiler og ph-meter til rådlighed. Til sidst en tak til Dorte Thorhauge Christensen for at give sig tid til at læse korrektur på projektet, samt en tak til Kamilla Nygaard Jensen for at hjælpe med at holde motivationen oppe undervejs. Underskrift. 2

Resume Baggrund: Carbapenemresistente bakterier er et globalt stigende problem. For at sikre hurtig isolation og behandling til smittede patienter, er det vigtigt, at de carbapenemresistente bakterier hurtigt bliver detekteret. Carba NP testen er en hurtigtest, som skaber mulighed for hurtig detektion af carbapenemresistente bakterier. Gennem dette projekt ønskes der derfor at fremstille en Carba NP test, og undersøge mulighederne for implementering af denne på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital. Metode: Carba NP testen bygger på en in vitro hydrolyse af carbapenem. Til projektet blev der medtaget 33 bakteriestammer, hvoraf 19 bakteriestammer var carbapenemaseproducerende stammer. Der blev afprøvet 3 forskellige ph-indikatorer, Phenol rød, Bromothymol blåt og Neutral rød for at undersøge, hvilken indikatore der gav bedst resultater. Efter den bedste ph-indikator var blevet udvalgt, blev testen foretaget med tilsat EDTA og tazobactam, som virker inhiberende, og derved hjælper med at differentiere de forskellige enzymklasser. Resultater/konklusion: Phenol rød blev valgt som den bedste ph-indikator og blev brugt til det videre arbejde. Det var muligt at opnå en sensitivitet på op til 89 %, samt en specificitet på 100 %. Ved inhibering med EDTA og tazobactam, var det muligt at differentiere mellem de enkelte enzymklasser ved 100 % af alle detekterede carbapenamser. 3

Indhold Forord... 2 Resume... 3 Introduktion... 5 Problembaggrund... 5 Problemformulering... 7 Målformuleringer... 7 Teori... 8 Betal-laktam-antibiotika... 8 Carbapenem resistens... 8 Bestemmelse af carbapenemaseproducerende bakterier... 10 Analytisk princip for Carba NP testen... 10 Måleprincip... 11 Materialer og metode... 12 Materialer... 12 Reagenser... 12 Utensilier og apparaturer... 13 Bakterieindsamling... 13 Metode... 14 Udgangspunkt for Carba NP test... 14 Praktisk udførelse... 14 Databehandling... 18 Vurdering af centrale artikler... 18 Resultater... 19 Screening/oversigt... 19 Carba NP test uden inhibitor, til bestemmelse af ph-indikator... 21 A1: Med Phenol rød... 21 A2: Med Phenol rød... 22 B1: Med Bromothymol blåt... 23 B2: Med Bromothymol blåt... 24 C1: Med Neutral rød... 24 Carba NP test med inhibitor... 26 D1:Med Phenol rød og inhibitorer... 26 D2: Med Phenol rød og inhibitorer... 27 4

D3: Med Phenol rød og inhibitorer... 29 Forlænget lyseringstid... 30 Opsamling... 31 Diskussion... 32 Valg af ph-indikator... 32 Kontaminering... 34 Carba NP testens udfald... 35 Usikkerheder forbundet med projektarbejdet... 36 Mulighed for implementering på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital... 37 Konklusion... 38 Perspektivering... 38 Referencer... 40 Bilag... 42 Introduktion Problembaggrund Carbepenemresistente bakterier har været kendt i Europa siden begyndelsen af 1990 (1). Senest i år 2013 er prævalensen i Europa ifølge en rapport fra Europen Center for Disease Prevention and Control (ECDC) fordelt, så lande som Grækenland og Italien ligger øverst på den epidemiologiske skala med et 5-tal som svarer til en epidemisk situation. Danmark ligger nederst med et 1-tal, da der her kun er set sporadisk forekomst i forskellige dele af landet. (2) Det første tilfælde af carbapenemresistente bakterier i Danmark blev fundet i 2008. Resistensformen er detekteret i forskellige bakterierarter, deriblandt familien Enterobacteriacea samt Pseudomonas aeruginosa og Acinetobacter baumannii. Indtil nu er der ikke nogen indberettelsespligt i Danmark, ved fund af carbapenemresistente bakterier, og det er derfor svært at kende den præcise udbredelse. Det man ved, er at der fra 2008 til 2011 blev indberettet 15 tilfælde af carbapenemresistente Enterobacteriacea. I 2012 blev der indberettet et udbrud af carbapenemresistente A. baumannii i hovedestadsomrtådet på 20 tilfælde, og der er løbende blevet indberettet tilfælde af carbapenemresistente P. aeruginosa rundt om i landet. (3) 5

I september 2012 udkom Norman et. al. med en artikel, som beskrev Carba NP testen. Carba NP testen, som både har en høj sensitivitet og specificitet, påviser tilstedeværelsen af enzymet carbapenemase, som produceres af carbapenemresistente bakterier. Testen bygger på en in vitro hydrolyse af carbapenem. (4) I december 2012 udkom en ny artikel af Norman et. al.. Her blev det beskrevet, hvorledes det forgående analyseprincip kunne videreudvikles, og vha. inhibitore gøre det muligt at gruppere de forskellige carbapenemaser. (5) Ved fund af carbapenemresistente bakterier på Aalborg Universitetshospital, følges retningslinjerne for isolation af patienter på enestue, for at mindske risiko for spredning på hospitalet. (Bilag 1) For at sikre en hurtig isolation er det vigtigt at detektionen af carbapenemresistente bakterier forekommer hurtigt. I den forbindelse valgte Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital (KMA AUH) pr. 1. august 2013 at indføre Rapid CARB Screen kit i deres daglige rutine. Rapid CARB Screen kit bygger på samme analyseprincip som Carba NP testen, men er et færdigpakket kit. (Bilag 2). Rapid CARB Screen kit blev valideret ud fra et forsøg, foretaget internt på afdelingen, her testede man et antal carbapenemase-producerende bakteriestammer samt et antal negative kontrolstammer. Ifølge fabrikanten er et farveomslag fra rød til orange/gul indikation på en positiv reaktion. Men på KMA AUH oplevede man, at der både ved positive og negative bakteriestammer forekom farveskift til orange. Rapid CARB Screen kit viste altså ved valideringsforsøget at have en lav specificitet, da der blev detekteret falsk-positive bakteriestammer. KMA AUH valgte på trods af problematikken at indføre Rapid CARB Screen kit, dog med den ændring i aflæsningsproceduren, at kun et farveskift til gul kunne blive betragtet som en positiv reaktion. En sådan ændring i aflæsningsproceduren afhjalp problematikken med specificiteten, men kunne til gengæld betyde fald i sensitiviteten. Det er vanskeligt at regulere og optimere det færdige Rapid CARB Screen kit, og det er derfor oplagt at undersøge muligheden for implementering af Carba NP testen på KMA AUH. Carba NP testen vil skabe muligheder for at finregulere de forskellige anvendte reagenser, og på den måde sikre den bedst mulige sensitivitet og specificitet. Samtidig kan brugen af inhibitore hjælpe til, at patienten hurtigt opstartes på den korrekte behandling. 6

Problemformulering Hvorledes kan vi designe en Carba NP test som kan detektere og differentiere de enkelte carbapenemase enzymgrupper hos bakterier, og hvilke muligheder samt konsekvenser vil det have for Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital (KMA AUH), at implementere denne test? Målformuleringer For at designe en Carba NP test som kan detektere og differentiere de enkelte carbapenemase enzymgrupper hos bakterier vil vi: Anvende Carba NP metoden fra `Rapid detecktion og carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae, hvor vi sammenligner phindikatorerne, Phenol rød, Neutral rød og Bromthymol blåt. På baggrund af den diagnostiske sensitivitet og specificitet, vælge den mest optimale ph-indikator. Anvende den udvidede Carba NP metode fra `Rapid Identification of Carbapenemase Types in Enterobacteriaceae and Pseudomonas spp. by Using a Biochemical Test hvor vi undersøger enzym inhibitorerne tazobactam og EDTA. Vurderer den udvidede Carba NP testens diagnostiske sensitivitet og specificitet. 7

Teori Betal-laktam-antibiotika Beta-laktam-antibiotika er den største og vigtigste gruppe af antibiotika. Denne gruppe virker ved at angribe bakteriens cellevæg. Cellevægen er fra et toksikologisk synspunkt et ideelt angrebspunkt hos bakterier, da humane celler ikke har en cellevæg, og værtscellerne vil derfor ikke blive angrebet under behandlingen. Fælles for denne gruppe af antibiotika er, at de alle i deres kemiske grundstruktur indeholder en beta-laktam-ring med en inkuberet beta-laktam-binding, som ses på figur 1. Normalt er der bundet en ekstra ringstruktur til betalaktam-ringen, og ud fra denne ring kan de forskellige beta-laktam-antibiotika klassificeres. Beta-laktam-antibiotika opdeles normalt i følgende grupper: Penicilliner, cefalosporiner, carbapenemer og monobaktamer. (6) Figur 1. Beta-laktam-ring med beta-laktam-binding (7) Beta-laktam-anibiotika virker ved at binde sig kovalent til proteiner i cellemembranen, og derved hæmme proteinernes funktion, disse proteiner går under betegnelsen PBP, som står for pencillin bindende protein. De hæmmede proteiner er normalt involveret i sidste trin i produktionen af peptidoglykan i cellevægen, og er derfor essentielle for bakteriecellen. Gram negative bakterier har kun et tyndt peptidoglykan lag i deres cellevæg Ødelægges dette lag gennem proteinhæmning, vil bakterien lysere pga. af bakteriens høje osmotiske tryk. (6) Der kan være flere årsager til, at bakterier udvikler resistens mod beta-laktama-antibiotikaer. De fire hoved årsager er; Beta-laktamaser, ændring af PBP, reduceret pentration og effluks. (6) Carbapenem resistens Carbapenemer (figur 2) er den nyeste gruppe blandt beta-laktamer, og er den gruppe af betalaktamer, som har det bredeste spektrum til antimikrobiel behandling. Carbapenemer er derfor ofte den type af antibiotika, der anvendes, når en bakterie har udviklet resistens mod 8

de resterende beta-laktamer. Imidlertid er der også tilfælde af carbapenemresistens. Carbapenemresistens skyldes bakteriens evne til at producere carbapenemase. Carbapenemaser er enzymer, der hydrolysere beta-laktam-ringen hvorved den antimikrobielle effekt ophører. (6) Figur 2. Carabapenem (8) Carbapenemase gruppering På baggrund af primær sekventering kan carbapenemaser opdeles i 3 klasser: A, B og D. Klasse A og D er enzymer med serin som en del af det aktive-site. Disse klasser af carbapenemaser virker derfor ved at danne en kovalent binding mellem serin i det aktivesite og en acyl gruppe. Klasse B carbapenemaser er metallo-beta-laktamaser (MBL er), da disse kræver zink for aktivering. Katalyseringen med metallo-beta-laktamaser foregår her ikke vha. en kovalent binding som ved serin beta-laktamaserne. I stedet angriber enzymet direkte hydroxid ionet, og denne reaktion stabiliseres af zink i det aktive-site. (9) Alle klasse A carbapenemaser har evnen til at hydrolyserer en bred gruppe af beta-laktamer, her iblandt carbapenemer, cephalosporiner og pencilliner. Samtidig er det muligt at inhibere alle klasse A carbapenemaser med både clavulan syre og tazobactam. (10) Klasse B carbapenemaser kan katalysere hydrolysen af alle beta-laktamer, med undtagelse af monobactamer. MBL er inhiberes af EDTA, da EDTA binder til zink og danner et metalkompleks. (9) Klasse D carbapenemaser, hører under en broget gruppe af klasse D beta-laktamaser, som har forskellige egenskaber. Nogle i denne klasse har et smalt spektrum, og er kun i stand til at hydrolysere penicilliner, mens andre har et bedre spektrum. Klasse D carbapenemaser består af subgruppen Oxa-48, som er i stand til at hydrolysere carbapenemer, og har den 9

højeste hydrolyseringsrate af alle oxa-enzymer. Fælles for klasse D beta-lakameser er, at de hverken er mulige at inhibere med clavulan syre, tazobactam eller EDTA. (10) Bestemmelse af carbapenemaseproducerende bakterier EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) har opsat en række retningslinjer omkring metoder for screening og konfirmering af carbapenemaseproducerende bakterier. Screening kan foretages vha. MIC eller tabletdiffusion, mens konfirmeringen kan foregå på flere forskellige måder. EUCAST anbefaler, at konfirmeringen af carbapenemresistens bliver fortaget vha. kombinationstabletter, da denne metode er vel-valideret. Kombinationstablet-metoden, bygger på tabletdiffusion, hvor meropenem bliver anvendt, tilsat forskellige inhibitore, der skelner de forskellige klasser af carbapenemaseproducerende bakterier fra hinanden, samt skelner mellem carbapebemaseproducerende og ikke-carbapenemaseproducerende bakterier. Ulempen ved denne metode er, at det tager 18 timer at få et svar, da bakterierne skal vokse natten over. Alternativt nævner EUCAST MALDI-TOF analyse og Carba NP test som begge bygger på hydrolyse af carbapenem, sidst er det muligt at detektere carbapenemaseproducerende bakterier vha. genotypist bestemmelse via PCR. (11) På KMA AUH benyttes tabletdiffusion til screening for carbapenemaseproducerende bakterier. Enterobacteriaceae screenes ved hjælp af ertapenem. Hvis der konstateres nedsat følsomhed for ertapenem, undersøges bakteriestammen yderligere med imipenem og meropenem. Ps. Auruginosa screenes direkte med imipenem og meropenem. Er følsomheden nedsat til en eller begge af disse antibiotika, er bakteriestammen under mistanke for at være carbapenemaseproducerende. Til konfirmering og nærmere bestemmelse af bakteriens resistens form, anvender afdelingen kombinationstabletter. (Bilag 3) Analytisk princip for Carba NP testen I dette projekt undersøges mulighederne for implementering af Carba NP testen på KMA AUH, da denne, som skrevet ovenfor, er et hurtigt alternativ til kombinationstabeletterne. Princippet bag Carba NP testen er bygget op omkring en in vitro hydrolyse af beta-laktamringen i carbapenem. De mistænkte bakterier lyseres, for at firgøre den mulige tilstedeværende carbapenamse. Carbapenem, her i form af imipenem, tilsættes til de lyserede bakterier. Er der 10

carbapenemase tilstede, vil carbapenemase katalysere hydrolysen af beta-laktam-ringen i carbapenem, som det ses i figur 3. OH-gruppen bundet til serin er i stand til at bryde dobbeltbindengen til oxygen. Dette efterlader oxygen med en fri elektron. For at stabilisere molekylet brydes beta-laktam-ringen, og der dannes en ny dobbeltbinding til oxygen. En OH-gruppe fra H2O erstatter enzymet og efterlader H + frit i opløsningen. Frigivelsen af H + fører til en forsuring, som vil kunne detekteres. (4,5) Figur 3. Hydrolyse af carbapenem. (12) Måleprincip De forsurede forhold, som opstår ved tilstedeværelsen af carbapenemase, kan detekteres ved at registrere et fald i ph-værdien. Faldet i ph-værdien registres vha. en ph-indikator. I Carba NP testen bliver Phenol rød anvendt som ph-indikator. Phenol rød har et ph-område der går fra 6,5 8,0, og et fald i ph-værdien, vil her kunne ses som et farveskift fra rød til orange/gul. For at undersøge muligheden for brug af andre ph-indikatorer, vil der i dette projekt også blive forsøgt brug af Bromothymol blåt og Neutral rød. Bromothymol blåt har et ph-interval på 5,8-7,6, og her vil et fald i ph-værdien registreres som et farveskift fra blå til gul. Neutral rød har et ph-interval på 6,8-8,0, et fald i ph-værdien vil blive registreret ved farveskift fra gul til rød. (13) 11

Materialer og metode Materialer Reagenser R/H-sætninger S/P-sætninger Tris HCl lyseringsbuffer B-PER Bacterial Protein Exstraction, Thermo Scientific Tienam Merch Sharp and dohme. AG Luzern Tazobactam Sigma Aldrich K-EDTA H319 P305/351/338 Bie og Berntsen 1M NaOH R34 S26, S37/39, S45 ZnSO4 R36, R50/53 S26, S60 Phenol rød Applichem, prod. nr. A0680 Bromothymol blåt Applichem, prod. nr. A2340 Neutral rød Applichem, prod. nr. A0683 Ertapenem Rosco Diagnostica A/S Imipenem Rosco Diagnostica A/S Meropenem Rosco Diagnostica A/S Oversigt 1. oversigt over de anvendte reagenser (13,14) 12

Utensilier og apparaturer ph-meter Metrohm University College Nordjylland (UCN) Meterlab PHM 200 lab ph meter, Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) Analyse vægt Sartorius BP61 Centrifuge Eppendorf centrifuge 5417C Vortexer Whirlimixer Fisons Magnet omrøre Variomag mono McFarland standard Prolab diagnostica Fin pipette Varmeskab, ved 37 C Bæreglas Målekolbe Eppendorfrør Eppendorf 1,5 ml AG Mikrotitterbrønd Nunc TM Müller Hinton agar plader SSI Diagnostica Oversigt 2. Oversigt over de anvendte utensilier og apparaturer Bakterieindsamling Der er på Aalborg Universitetshospital kun fundet 19 carbapenemaseproducerende bakteriestammer, dette satte derfor en naturlig begrænsning for hvor mange positive bakteriestammer, det var muligt at medtage i projektet. De positive bakterier blev fordelt som følger: Enterobacteriaceae (n = 12), Ps. Auruginosa (n = 1), C. freundii (n = 3), Ac. Baumanii (n = 2) og en enkelt med ukendt art, mens de forskellige carbepenemaser var fordelt på følgende måde: Klasse A: KPC (n = 3), klasse B: NDM (n = 9), VIM (n = 2), VIN (n = 2) og klasse D: oxa-48 (n = 3). Ud over de 19 positive bakteriestammer, blev der yderligere medtaget 14 negative bakteriestammer, altså bakteriestammer uden carbapenemaseproduktion. De negative bakteriestammer havde alle det tilfælles, at de havde været under mistanke for carbapenemase produktion. Mistanken for carbapenemase produktion var opstået på baggrund af KMA AUH s screenings program. De negative bakteriestammer var fordelt på følgende måde: Enterobacteriaceae (n = 9) og Ps. Auruginosa (n = 5). 13

Da alle bakteriestammerne havde været nedfrosset imellem den oprindelige identifikation og dette projekt, kunne det føre til fejlkilder i form af ombytning og fejlregistrering. For at være sikker på at kende de korrekte zonestørrelser i forbindelse med screening, blev alle bakteriestammer, som var medtaget i projektet, screenet med ertapenem, meropenem og imipenem. I tabel 1 i resultatsafsnittet ses en oversigt over alle medtagede bakteriestammer. Her ses både alt kendt information om de enkelte stammer, samt de målte zonestørrelser for screeningen med ertapenem, meropenem og imipenem. Metode Udgangspunkt for Carba NP test Carba NP testen bygger på en in vitro hydrolyse af carbapenem i dette tilfælde imipenem. Det grundlæggende analyseprincip er beskrevet i Norman et.al artikel fra september 2012. Her blev en 10 µl podenål med bakteriekoloni opslemmet i 200 µl Tris-HCl lyserings buffer, blandingen blev vortexet 1 minut og inkuberet i 30 minutter ved rumtemperatur, hvorefter den blev centrifugeret i 5 minutter ved 10.000 * g. 30 µl af supernatanten blev efterfølgende mixet med testreagenset i en mikrotiterbrønd og hensat til inkubering i 2 timer ved 37 C. Et farveskift fra rød til gul/orange efter de 2 timers inkubationstid, er tegn på en positiv reaktion. Test reagenset var en blanding af Phenol rød 0,5 wt%/vl%, 16,6 ml demineraliseret vand, 0,1 mm ZnSO4, 3 mg/ml imipenem samt 1M NaOH til regulering af ph. ph-værdien blev tilpasset til en ph 7,8. En negativkontrol blev blandet. Den negative kontrol består af de samme ingredienser som testreagenset, forskellen er, at der her ikke er tilsat imipenem. Hvis der ikke er noget imipenem tilstede, vil carbapenemase ikke have nogen beta-laktam-ring at hydrolysere, og der bør derfor aldrig kunne observeres en reaktion i den negative kontrol. I Norman et.al artikel fra december 2012, gik de et skridt videre, og udvidede Carba NP testen, ved at medtage inhibitorne tazabotam og EDTA, for at skelne enzymklasserne A, B og D fra hinanden. Her var der altså tale om fire forskellige testreagenser; en negativkontrol, et testreagens med imipenem (3 mg/ml), et testreagens med imipenem (3 mg/ml) + tazobactam (4 mg/ml) og et testreagens med imipenem (3 mg/ml) + EDTA (0,003 M). Praktisk udførelse I et forsøg på at implementere Carba NP testen på KMA AUH, blev der foretaget en række mindre justeringer ved udførelsen. Bakteriemængden under lyseringen blev standardiseret til en McFarland 4+. For at gøre det nemmere at vurdere en McFarland 4+, blev mængden 14

af Tris-HCl lyseringsbuffer sat op fra 200 µl til 400 µl. Centrifugehastigheden blev nedsat fra 10.000 g til 3000 rpm, da dette er den hastighed, som normalt anvendes på afdelingen, og det derfor vil gøre det nemmere at udføre i den daglige rutine. Mængden af tilsat NaOH blev forsøgt standardiseret til en fast volumen. For at undersøge mulighederne for et mere klart farveomslag, blev der testet tre forskellige ph-indikatore, Phenol rød, som anvendt i den oprindelige Carba NP test, Bromothymol blåt og Neutral rød. For at undersøge phværdiens betydning for ph-indikatorens farveomslag, samt ph-optimum for carbapenemase, blev flere forskellige ph-værdier testet. Til sidst anvendes tienam i stedet for rent imipenem, da dette er billigere i indkøb. Tienam er et blandigsprodukt, bestående af imipenem og cilastatin derfor blev der tilsat dobbelt så meget tienam til testreagenset i forhold til rent imipenem. (15) Selv om der blev testet forskellige ph-indikatore, samt ph-værdier, var den overordnede procedure for hver udført test den sammen. For hver test blev der opslemmet bakterier til en McFarland 4+ i 400 µl Tris-HCl lyseringsbuffer, og vortexet 1 minut. Opslemningen blev hensat til lysering i 30 minutter ved rumtemperatur, og efterfølgende centrifugeret i 5 minutter ved 3000 rpm. I hver mikrotitterbrønd blev der afpipiteret 30 µl supernatant, som blev blandet med 100 µl kontrol- eller testreagens. Mikrotitterbrøndene blev hensat til inkubering i 2 timer ved 37 C. Farveudviklingen blev observeret efter hver halve time. Et hvert farveomslag er lig med et fald i ph-værdien, et fald i ph-værdien indikerer at der er sket en hydrolysering af carbapenem, hvilket er tegn på tilstedeværelsen af carbapenemase. Derfor anses et hvert farveomslag som en positiv reaktion. Overordnede opskrift til Carba NP test uden inhibitor 4 ml ph-indikator o Phenol rød (0,5 wt%/vl%) o Neutral rød (0,5 wt%/vl%) o Bromothymol blåt (0,1 wt%/vl%) 29,48 ml deminiraliseret H2O 3,73 ml 1 mm ZnSO4 1 M NaOH blev tildryppet til den rette ph-værdi Blandingen blev delt i to portioner med 18,6 ml i hver. Den ene portion blev anvendt til kontrol, i den anden blev der tilsat tienam. 6 mg/ml tienam o 0,1116 g til den samlede volumen på 18,6 ml 15

Phenol rød Navn Dato Ekstra A1 26-03-2014 Carba NP test uden inhibitor A2 27-03-2014 Carba NP test unde inhibitor kommentarer Sat til opbevaring ved køleskabstemperatur ph-værdi NaOH ph-meter 8,0-8,08 53 µl UCN 7,74 7,06 (efter 1,5 uge opbevaring på køl) 51 µl UCN KBA (efter 1,5 uge opbevaring på køl) Oversigt 3. Oversigt overtestreagenser for Carba NP test uden inhibitor med Phenol rød som ph-indikator Bromothymol blåt Navn Dato Ekstra B1 B2 27-03-2014 Carba NP test uden inhibitor 31-03-2014 Carba NP test uden kommentar Farve: Lys grøn Farve Mørk grøn ph-værdi NaOH ph-meter 7,48 7 µl UCN 7,46 11 µl KBA inhibitor Oversigt 4. Oversigt over testreagenser for Carba NP test uden inhibitor med Bromothymol blåt som phindikator Neutral rød Navn Dato Ekstra C1 31-03-2014 Carba NP test uden inhibitor kommentar ph-værdi NaOH ph-meter 7,59 25 µl KBA Oversigt 5. Oversigt over testreagenset for Carba NP test uden inhibitor med Neutral rød som ph-indikator Overordnede opskrift til Carba NP test med inhibitor Blanding af kontrol, tianam, tianam + tazobactam 4 ml Phenol rød (0,5 wt%/vl%) 29,48 ml deminiraliseret H2O 3,73 ml 1 mm ZnSO4 1 M NaOH blev tildryppet til den rette ph-værdi Blandingen blev delt i to portioner med 18,6 ml i hver. Den ene portion blev anvendt til kontrol, i den anden blev der tilsat tienam. 6 mg/ml tienam o 0,1116 g til den samlede volumen på 18,6 ml De 18,6 ml med tienam deles igen i to portioner med 9,3 ml i hver. Til den ene portion tilsættes Tazobactam 4 mg/ml tazobactam o 0,0372 g til 9,3 ml 16

Blanding med Tianam + EDTA 4 ml Phenol rød (0,5 wt%/vl%) 29,48 ml deminiraliseret H2O 3,73 ml 1 mm ZnSO4 1 M NaOH blev tildryppet til den rette ph-værdi 18,6 ml udtages og tilsættes EDTA + tienam 11,17 ml 0,01 M EDTA (opløst på laboratoriet) + 0,1116 g tienam Eller 0,186 ml 0,6 M K-EDTA (Købt på opløst form) + 0,1116 g tienam Blanding med Tienam og Tazobactam Navn Dato Ekstra D1 03-04-2014 Carba NP test med inhibitor D2 08-04-2014 Carba NP test med inhibitor D3 10-04-2014 Carba NP test med inhibitor kommentarer Stammer gendyrket fra de oprindelige blodplader ½ times ekstra inkuberingstid i varmen phværdmeter NaOH ph- 7,11 51 µl KBA 7,41 51 µl KBA 7,17 51-52 µl KBA Oversigt 6. Oversigt over testreagenser for Carba NP test, kontrol, tianam og tianam + tazobactam, med Phenol rød som ph-indikator Blanding med Tienam og 0,6 M K-EDTA Navn Dato Ekstra D1 03-04-2014 Carba NP test med inhibitor D2 08-04-2014 Carba NP test med inhibitor D3 10-04-2014 Carba NP test med inhibitor kommentar Stammer gendyrket fra de oprindelige blodplader ½ times ekstra inkuberingstid i varmen ph-værdi NaOH ph-meter 7,22 135 µl KBA 7,2 142 µl KBA 7,12 110 µl KBA Oversigt 7. Oversigt over testreagenser for Carba NP test, tianam + 0,6 M K-EDTA, med Phenol rød som ph-indikator 17

Blanding med Tienam og 0,01 M EDTA Navn Dato Ekatra D1 03-04-2014 Carba NP test med inhibitor kommentar ph, NaOH, NaOH ph-meter ph meter 7,18 10 µl KBA Oversigt 8. Oversigt over testreagenset for Carba NP test, tianam + 0,01 M EDTA, med Phenol rød som phindikator Forlænget lyseringstid Efter store problemer med reproducerbarheden ved forsøg D1, ønskede vi at undersøge om en forlænget lyseringstid kunne have en positiv effekt. Til dette forsøg blev der kun medtaget bakteriestammer, som tidligere havde vist et farveomslag. Grunden til at forsøget kun blev kørt på en gruppe af udvalgte bakterier, skyldes, at der kun var begrænsede mængder tilbage af det testreagens, som blev anvendt til forsøg D1. For at være sikre på at lyseringstiden var den eneste faktor som blev ændret, var det ønskværdigt at anvende det samme testreagens, og derfor kunne kun et mindre antal bakteriestammer medtages. For at afgøre om lyseringstiden havde en afgørende betydning for udfaldet, og om dette kunne have en betydning for reproducerbarheden, blev lyseringstiden sat op fra 30 minutter til 60 minutter. Databehandling Til at vurdere resultaterne udregnes den diagnostiske sensitivitet og specificitet for hver udført test. Som gylden standard for den sande værdi benyttes analyseresultaterne fra Statens Serum Institut, hvor der er foretaget en Fuld Genom PCR for hver af de medtagede bakteriestammer. Vurdering af centrale artikler De to centrale artikler af Norman et.al. (4,5) bygger begge på valid referencedata. Alle medtagede bakteriestammer i begge studier, er forud for studiet blevet sekventeret vha. af PCR. PCR, er på nuværende tidspunkt den mest valide metode til bestemmelse af carbapenemaseproduktion hos bakterier, og er derfor oplagt at anvende som gylden standard. I begge studier, er prøverne blevet blindet før aflæsning, hvilket betyder at bias holdes lav, da de blindede prøver sænker mængden af fejlaflæsninger. Bakteriestammerne er ikke tilfældigt udvalgt, men er udvalgt på baggrund af referenceoplysningerne. Det er for begge studier en fordel at bakterierne er udvalgt, da det sikre, at analyserne bliver testet under relevante forhold. Begge artikler har flere citationer, hvilket er tegn på at forskere, som arbejder inden for samme felt, har fundet artiklerne troværdige. Ud for disse overvejelser vurderede vi, at begge artikler var valide nok, til at ligge grundlag for dette projekt. 18

Resultater Screening/oversigt Tabel 1 viser de målte zonestørrelser ved screening med ertapenem, imipenem og meropenem, holdt op mod alt kendt viden om de medtagede bakteriestammer. Blind nr. Bakterie art Resistens form Prøvetype Zonestørrelse til ertapenem (mm) Zonestørrelse til imipenem (mm) Zonestørrelse til meropenem (mm) 1 MBL (VIN- E. coli 4) Perineum 18 17 20 2 OXA 48 + E. coli TEM 14 17 20 3 DHA-1 + K. pneu imp 21 29 32 4 KPC- K. pneu 3+SHV+TE M 20 19 17 5 ESBL E. coli VEB-1 32 32 35 6 CTX-M (ESBL) + 18 22 24 OXA 48 7 ESBL E. coli TEM-52 33 31 36 8 Ps. MBL aeruginosa (VIM) Væv 9 9 9 9 Reduceret cellevægspe rmeabilitet i Ps. Auruginos a kombinatio n med hyperprodu ktion af kromosomal Apm C Urin 9 18 16 10 K. pneumoni ae 11 Kl. pneumoni ae (sendt sammen med kendt C. freundii (se ovenfor)) KPC Blod 9 9 9 MBL (NDM) Sårpodnin g 9 9 9 19

12 Ps. Auruginos a Porintab Tracheal 9 9 18 13 E. coli CMY-2 25 29 34 14 NDM- K.pneu 1+CTX-M- 15+CMY-2 9 11 9 15 CTX-Mgr.1 E. coli 26 27 31 16 MBL C. freundii (NDM) Urin 9 13 9 17 CTX-15, K. pneu SHV- 32+imp 9 24 15 18 VIM- E. coli 1+CTX-M- GR.1 TEM 16 16 18 19 Ac. MBL Baumanii (NDM) Blod 9 9 9 20 MBL E. Coli (VIM-4) Urin 19 17 22 21 Ps. Auruginos Porintab Urin 9 11 19 22 23 24 25 a Ps. Aeruginos a P. aeruginosa E. coli Kl. oxytoca 26 K. pneumoni ae Carbapene mase (MBL, KPC, OXA- 48) negativ Carbapene mase (MBL, KPC, OXA- 48) negativ ESBL CTX-M grp. 1 + reduceret permeabilite t ESBL CTX-M grp. 1 + TEM + reduceret permeabilite t Tracheal 9 12 15 Blod 9 13 17 Drænsekre t Praksisuri n 9 24 11 13 21 20 KPC 9 9 9 20

27 MBL Bloddyrkn C. freundii (NDM) ing 9 16 9 28 MBL C. freundii (NDM) Urin 9 18 9 29 K. pneu WT 28 29 27 30 Ac. MBL Baumanii (NDM) Blod 9 9 9 31 Kl. MBL pneumoni (NDM) ae Svælg 9 9 9 32 E.coli 33 K. pneumoni ae MBL (NDM-4) OXA-48 Perineum 9 9 9 Trachealse kret 9 13 9 Tabel 1. Oversigt over de 33 bakteriestammes resistensform, samt zonestørrelse til ertapenem, imipenem og meropenem. Brydepunkter: Imipenem (entrobakterier) 22 mm, Imipenem (pseudomonas) 20 mm, Meropenem (entrobakterier) 22 mm, Meropenem (pseudomonas) 24, Ertapenem < 25. Carba NP test uden inhibitor, til bestemmelse af ph-indikator A1: Med Phenol rød Billede 1. A1 med Phenol rød, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 1-11 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ses i prøve nr. 1, 4, 10 og 11. Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Billede 2. A1 med Phenol rød, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 12-22 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ses i prøve nr. 14, 16, 18 og 20 Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Billede 3. A1 med Phenol rød, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 23-33 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ses i prøve nr. 26, 27, 28, 31 og 32. Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. 21

I forsøg A1 ses en positiv reaktion i 13 brønde. De positive reaktioner er fordelt over brønd 1, 4, 10, 11, 14, 18, 20, 26, 27, 28, 31 og 32, og differentierer fra gul til mørk orange. Sensitivitet Specificitet A1 68% 100% Tabel 2. A1 med Phenol rød, efter inkubation i 2 timer. Skemaet viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet. Der blev kun observeret 13 positive omslag ud af 19 positive prøver, hvilket giver en sensitivitet på 68 % (tabel 2). En sensitivitet på 68 % betyder at 32 % af de carbapenemase producerende bakterier ikke blev opdaget ved brug af denne test. Specificiteten er på 100 %, da der ikke blev observeret nogle falsk positive prøver (tabel 2). A2: Med Phenol rød Billede 4. A2 med Phenol rød, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 1-11 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 1, 4, 10 og 11 Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Billede 5. A2 med Phenol rød, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 12-22 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 14, 16, 18, 19 og 20. Alle positive reaktioner er markeret med sort firkant. Billede 6. A2 med Phenol rød, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 23-33 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 26, 27, 28, 30, 31 og 32. Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Sensitivitet Specificitet A2 79% 100% Tabel 3. A2 med Phenol rød, efter inkubation i 2 timer. Skemaet viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet. Som det ses på billede 4-6, blev der i forsøg A2 fundet 15 positive. De positive prøver havde et farveskifte fra gul til mørk orange. Et fund på 15 positive prøver ud af 19 mulige betyder at 22

sensitiviteten i forsøg A2 er på 79 %, mens specificiteten er på 100 %, da der ikke var nogen tilfælde af falsk-positive prøver, dette ses i tabel 3. B1: Med Bromothymol blåt Billede 7. B1 med Bromothymol blåt, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 1-11 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 1, 4, 10 og 1. Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Billede 8. B1 med Bromothymol blåt, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 12-22 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 14, 16, 18, 19 og 20. Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Billede 9. B1 med Bromothymol blåt, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 23-33 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 26, 27, 28, 30, 31 og 32. Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Det er meget svært at skelne farverne på billede 7-9. Det var nemmere at se farverne i virkeligheden, men også her var farverne svære at skelne. Fordelen ved Bromothymol blåt som indikator, er at der ikke er nogle farve nuancer at tage højdefor. En gul farve er lig med et positivt resultat, mens en grøn farve var lig med et negativ resultat. Der forekom altså ikke nogen farver ind i mellem. Sensitivitet Specificitet B1 79% 100% Tabel 4. B1 med Bromothymol blåt, efter inkubation i 2 timer. Skemaet viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet. Som det ses på billede 7-9, er der fundet 15 positive ud af 19 positive prøver, hvilket betyder, at forsøg B1 har en sensitivitet svarende til sensitiviteten ved forsøg A2 på 79 %. Der er heller ikke her fundet nogle falsk-positive prøver, så der ses igen en specificitet på 100 %, som det ses i tabel 4. 23

B2: Med Bromothymol blåt Billede 10. B2 med Bromothymol blåt, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 1-11 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 11. Den positive reaktion er markeret med en sort firkant. Billede 11. B2 med Bromothymol blåt, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 12-22 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 14, 16 og 18. Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Billede 12. B2 med Bromothymol blåt, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 23-33 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 26, 27, 28, 31 og 32. Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Sensitivitet Specificitet B2 47% 100% Tabel 5. B2 med Bromothymol blåt, efter inkubation i 2 timer. Skemaet viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet. Som det ses på billede 10-12, blev der i forsøg B2 kun fundet 9 positive prøver. Et fund på 9 positive prøver ud af 19 mulige, giver en sensitivitet på 47 %. Da der heller ikke her er fundet nogle falskpositive prøver, forbliver specificiteten på 100 %, dette ses i tabel 5. C1: Med Neutral rød Billede 13. C1 med Neutral rød, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 1-11 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Her ses ingen positive prøver 24

Billede 14. C1 med Neutral rød, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 12-22 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Her ses ingen positive prøver Billede 15. C1 med Neutral rød, efter inkubation i 2 timer. Bakteriestamme 23-33 fra venstre mod højre. Øverste række indeholder tienam, anden række er den negative kontrol. Positivt udslag ved prøve nr. 32. Den positive reaktion er markeret med en sort firkant. Sensitivitet Specificitet C1 5% 100% Tabel 6. C1 med Neutral rød, efter inkubation i 2 timer. Skemaet viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet. På billede 13-15 ses der kun en positiv reaktion i prøve nr. 32, hvor der ses et farveomslag fra orange til violet. En enkelt positiv reaktion ud af 19 mulige betyder, som det ses i tabel 6, at forsøg C1 har en sensitivitet på 5 %. Specificiteten er fortsat 100 %, da der ikke er fundet nogle falsk-positive prøver. 25

Carba NP test med inhibitor Ud fra de ovenstående forsøg, blev forholdene til den udvide Carba NP test med inhibitor bestemt. Forsøg A2 blev udvalgt som det mest succesfulde forsøg, med en evne til at påvise 15 ud af 19 positive prøver. ph-indikator og ph forhold blev derfor tilpasset forholdene i forsøg A2. D1:Med Phenol rød og inhibitorer Billede 16. D1 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2 timer. Bakterie stammerne 1-11 fra venstre mod højre. Fra top: tienam, tienam + tazobactam, tienam + EDTA, negativ kontrol. Positivt udslag ses ved nr. 4(KPC). Den positive reaktion er markeret med en sort firkant. Billede 17. D1 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2 timer. Bakterie stammerne 12-22 fra venstre mod højre. Fra top: tienam, tienam + tazobactam, tienam + EDTA, negativ kontrol. Positive udslag ses ved nr. 14(MBL) og 18(MBL). De positive reaktioner er markeret med en sort firkant. 26

Billede 18. D1 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2 timer. Bakterie stammerne 23-33 fra venstre mod højre. Fra top: tienam, tienam + tazobactam, tienam + EDTA, negativ kontrol. Positive udslag ses ved nr. 26(KPC), 27(MBL), 28(MBL), 31(MBL) og 32(MBL). Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Sensitivitet Specificitet D1 42 % 100% Tabel 7. D1 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2 timer. Skemaet viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet. På billede 16-18 ses det, at der ved forsøg D1 kun var 8 positive prøver ud af 19 mulige. Som det ses i tabel 7 betyder dette en sensitivitet på 42 %, samtidig med en specificitet på 100 % da der ikke er nogle tilfælde af falsk-positive prøver. Det ses samtidig på billede 16-18 at inhibitorene virkede efter hensigten. Et farveskift i brønden med imipenem samt brønden med imipenem + tazobactam indikerer at bakterien producerer MBL. Et farve omslag i brønden med imipenem samt brønden med EDTA indikerer at bakterien Producerer KPC. Til sidst indikerer et farveomslag, i både brønden med imipenem, brønden med imipenem + tazobactam og brønden med imipenem + EDTA, at bakterien producerer OXA-48. Ved alle 8 positive prøver virkede inhibitorene efter hensigten, og påviste tilstedeværelsen af det korrekte enzym (se tabel 1). D2: Med Phenol rød og inhibitorer For at forbedre sensitiviteten set i forsøg D1, blev bakteriestammerne til forsøg D2 gendyrket fra de oprindelige blodplader, før testen blev foretaget. Dette skyldes en mistanke om, at den lave sensitivitet i D1, var knyttet til en mulig kontaminering af Müller-Hinton pladerne. 27

Billede 19. D2 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2 timer. Bakterie stammerne 1-11 fra venstre mod højre. Fra top: tienam, tienam + tazobactam, tienam + EDTA, negativ kontrol. Positivt udslag ses ved nr. 1(MBL), 4(KPC), 10(KPC) og 11(MBL). Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Billede 20. D2 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2 timer. Bakterie stammerne 12-22 fra venstre mod højre. Fra top: tienam, tienam + tazobactam, tienam + EDTA, negativ kontrol. Positivt udslag ses ved nr. 14(MBL), 16(MBL), 18(MBL), 19(MBL)og 20(MBL). Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Billede 21. D2 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2 timer. Bakterie stammerne 23-33, fra venstre mod højre. Fra top: tienam, tienam + tazobactam, tienam + EDTA, negativ kontrol. Positivt udslag ses ved 26(KPC), 27(MBL), 28(MBL), 30(MBL), 31(MBL) og 32(MBL). Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Sensitivitet Specificitet D2 79 % 100% Tabel 8. D2 med Phenol rød og inhibitorer. Skemaet viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet. 28

Det havde en positiv effekt at gendyrke bakteriestammerne fra de oprindelige blodplader. Som det ses på billede 19-21, blev det efter gendyrkningen igen muligt at detekterer 15 ud af 19 positive prøver, hvilket betyder at sensitiviteten igen kunne bestemmes til 79 %. Samtidig viser billederne, at inhibitorene, ligesom ved forsøg D1, fungerer efter hensigten og påviser de korrekte enzymklasser. D3: Med Phenol rød og inhibitorer Ved forsøg D3 blev testen igen gennemført på bakteriestammer dyrket fra de oprindelige blodplader. Billede 22. D3 med phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2½ time. Bakteriestamme 1 til 11 fra venstre mod højre. Fra top: Tienam, tienam + tazobactam, tienam + EDTA, kontrol. Positivt udslag ses ved nr. 1(MBL), 2(OXA-48), 4(KPC), 8(MBL), 10(KPC) og 11(MBL). Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Billede 23. D3 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2½ time. Bakteriestamme 12 til 22 fra venstre mod højre. Fra top: Tienam, tienam + tazobactam, tienam + EDTA, kontrol. Positivt udslag ses ved nr. 14(MBL), 16(MBL), 18(MBL), 19(MBL) og 20(MBL). Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. 29

Billede 24. D3 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2½ time. Bakteriestamme 23-33 fra venstre mod højre. Fra top: Tienam, tienam + tazobactam, tienam + EDTA, kontrol. Positivt udslag ses ved nr. 26(KPC), 27(MBL), 28(MBL), 20(MBL), 31(MBL) og 32(MBL). Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. Sensitivitet Specificitet D3 89 % 100% Tabel 9. D3 med Phenol rød og inhibitorer, efter inkubation i 2½ tme. Skemaet viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet. På billede 22-24 ses 17 positive prøver. 17 positive prøver ud af 19 mulige betyder, som det ses i tabel 9, at sensitiviteten ved forsøg D3 er 89 %. Der er fortsat en specificitet på 100 %, da der ikke er fundet nogle falsk-negative prøver. Ved at sammenligne billede 22-24 med tabel 1, ses det, at inhibitorene differentierer de forskellige enzymklasser korrekt. Forlænget lyseringstid Billede 25. Forlænget lyseringstid. Prøve nr. 1, 4, 10, 11, 14, 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 30, 31 og 32 fra venstre mod højre. Prøverne har inkuberet i 2 timer. Positivt udslag ses ved prøve nr. 1, 11,14, 16, 18, 26, 27, 28, 31 og 32. Alle positive reaktioner er markeret med en sort firkant. På billede 25 ses en positiv reaktion ved prøve 1, 11, 14, 16, 18, 26, 27, 28, 31 og 32. Ved at sammenligne resultaterne med tabel 1, ses det at inhibitoren virker efter hensigten, ved at differentiere de forskellige enzymgrupper korrekt, i alle prøver med et positivt resultat. 30

Opsamling Blin Positiv/negativ A1 A2 B1 B2 C1 D1 D2 D3 d nr. (MBL/KPC/OX A-48) 1 Positiv (MBL, VIN) Pos. Pos. Pos. Neg. Neg. Neg. Pos. (MBL) Pos. (MBL) 2 Positiv (OXA-48) Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Pos. (OXA- 48) 3 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 4 Positiv (KPC) Pos. Pos. Pos. Neg. Neg. Pos. (KPC) Pos. (KPC) Pos. (KPC) 5 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 6 Positiv Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. (OXA-48) 7 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 8 Positiv (MBL, VIM) Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Pos. (MBL) 9 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 10 Positiv (KPC) Pos. Pos. Pos. Neg. Neg. Neg. Pos. (KPC) Pos. (KPC) 11 Positiv (MBL, NDM) Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Neg. Pos. (MBL) Pos. (MBL) 12 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 13 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 14 Positiv (MBL, NDM) Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Pos. *(MBL) Pos. *(MBL) Pos. *(MBL) 15 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 16 Positiv (MBL, NDM) Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Pos. (MBL) Pos. (MBL) Pos. (MBL) 17 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 18 Positiv (MBL, VIM) Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Neg. Pos. *(MBL) Pos. *(MBL) 19 Positiv (MBL, NDM) Neg. Pos. Pos. Neg. Neg. Neg. Pos. (MBL) Pos. (MBL) 20 Positiv (MBL, VIM) Pos. Pos. Pos. Neg. Neg. Neg. Pos. (MBL) Pos. (MBL) 21 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 22 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 23 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 24 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 25 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 26 Positiv (KPC) Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Pos. (KPC) Pos. (KPC) Pos. (KPC) 27 Positiv (MBL, NDM) Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Pos. (MBL) Pos. (MBL) Pos. (MBL) 28 Positiv (MBL, NDM) Pos. Pos. Pos. Pos. Neg. Pos. (MBL) Pos. (MBL) Pos. (MBL) 29 Negativ Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. 31

30 Positiv (MBL, NDM) 31 Positiv (MBL, NDM) 32 Positiv (MBL, NDM) 33 Positiv (OXA-48) Neg. Pos. Pos. Neg. Neg. Neg. Pos. (MBL) Pos. (MBL) Pos. Pos. Pos. Neg. Pos. Pos. Pos. Pos. (MBL) (MBL) (MBL) Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. Pos. (MBL) (MBL) (MBL) Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Neg. Tabel 11. Oversigts tabel over de opnåede resultater, sammenlignet med den gyldne standard. *Alle enzymer i klasse B, er blevet aflæst som MBL. Sandt-positive prøver er markeret med gul, sandt-negative prøver er markeret med rød og falsk-negative prøver er markeret med blå. Diskussion Inspiration til dette projekt opstod ud fra den problematik, KMA AUH oplevede omkring hurtig diagnostik af carbapenemresistente bakterier. Projektet blev derfor foretaget med henblik på at undersøge mulighederne for at designe en Carba NP test, som ville være mulig at implementere, som en dele af rutinearbejdet på afdelingen. Der var kun mulighed for at medtage 19 carbapenemase positive bakterier i projektet. 19 positive prøver er et tyndt statistisk grundlag at drage konklusioner fra. Denne baggrund er vigtig at have for øje i den følgende vurdering af projektets udfald. Valg af ph-indikator De forskellige ph-indikatore blev medtaget i projektet for at undersøge, om man ved brug af en anden ph-indikator end Phenol rød kunne se mere tydelige resultater. Neutral rød blev hurtig udelukket som indikator. Som det ses i tabel 6 blev sensitivitet ved Neutral rød bestemt til 5 %, hvilket viser, at testen ikke virkede under brug af Neutral rød som ph-indikator. Årsagen til at Neutral rød blev udvalgt som en mulig kandidat for Carba NP testen skyldes, at Neutral røds ph-interval ligger meget tæt på Phenol røds ph-interval. Forskellen mellem de to er, at Neutral røds interval går fra 6,8-8,0, mens Phenol røds går fra 6,5-8,0, det vil derfor kræve et større fald i ph-værdien, før der vil ses et farveomslag ved Phenol rød i forhold til Neutral rød. Der var derfor mulighed for, at der ville ske et hurtigere og mere tydeligt farveomslag med Neutral rød som ph-indikator. Derudover var farveomslaget for Neutral rød et skift fra gul til rød ved fald i ph-værdien, mens det for Phenol rød gik fra rød til gul. Denne forskel kunne også vise sig at have betydning for det visuelle resultat. Som skrevet ovenfor, var der desværre ingen af disse mulige positive effekter, der kom til udtryk ved at benytte Neutral rød frem for Phenol rød. En sensitivitet på 5 % svare til, at testen med Neutral rød som indikator slet ikke havde nogen evne til at identificere carbapenemase. 32

Bromothymol blåt blev valgt pga. ph-intervallet på 5,8-7,6, og pga. farveskifte fra grønt til gul ved fald i ph-værdien. Der var en forventning om, at det lave ph-interval kunne forbedre sensitiviteten, da det ville kræve et mindre fald i ph-værdien at skabe et farveskifte. Dette ville dog samtidig også skabe risiko for et fald i specificiteten. I december 2013 udgav Pires et.al en artikel, som beskrev Blue Carba testen en test, som byggede på samme analyseprincip som Carba NP testen, men hvor Bromothymol blåt blev brugt som phindikator i stedet for Phenol rød. Artiklen beskrev en sensitivitet og specificitet på 100 %, hvilket underbyggede vores forventning til brugen af Bromotnymol blåt som indikator. Pires et.al regulerede ph-værdien i testreagenset til ph 7 med argumentationen, at carbapenemers ph-optimum ligger omkring ph 7.(16) Erfaringerne draget ved Pires et.al Blue Carba test blev inddraget i overvejelserne til dette projekt. Derfor blev ph-værdien ved forsøg B1 forsøgt reguleret tæt på ph 7, og endte på ph 7,48. Som det ses i tabel 4, havde det lave ph-interval ikke nogen indvirkning på fald i specificiteten, men specificiteten på 100 % levede i stedet op til Blue Carba testen. Sensitiviteten på 79 % levede ikke op til sensitiviteten ved Blue Carba testen, hvor sensitiviteten var 100 %. Til gengæld var sensitiviteten ved forsøg B1 tilsvarende sensitiviteten oplevet ved forsøg A2, hvor Phenol rød var brugt som ph-indikator (tabel 3). Spørgsmålet, som opstod efter Bromothymol blåt var afprøvet som ph-indikator med en ph-værdi på 7,48, var farveforskellen oplevet mellem resultaterne for Blue Carba testen og resultaterne opnået i dette projekt. Ifølge Blue Carba testen ville testens udgangspunkt have en mørkeblå farve ved ph 7, mens der i dette projekt blev oplevet en lysegrøn farve ved ph 7,48. Der er altså en uoverensstemmelse mellem farveoplevelserne fra dette projekt og Blue Carba testen, hvilket kan skabe tvivl om metoden anvendt i Blue Carba testen. (16) Fordelen ved brug af Bromothymol blåt som ph-indikator er, som det ses på billede 7-12, at en positiv reaktion ses som en gul farve, mens en negativ reaktion ses som en grøn farve. Der er ingen nuancer inden for den positive reaktion, hvilket kan være en fordel for aflæsningen. Til gengæld ligger den gule og grønne farve meget tæt op af hinanden, hvilket betyder, at det, på trods af et klart omslag, kan være svært at skelne positiv fra negativ. Phenol rød viste sig i sidste enden som den bedste ph-indikator. Udfordringen ved brug af Phenol rød, var de forskellige farve-nuancer, der kunne ses ved en positiv reaktion (se billede 1-6 og 16-24), men samtidig var farverne ved Phenol rød klare og nemmere at aflæse. Derfor blev Phenol rød valgt som ph-indikator til de videre inhibitor forsøg. 33