Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier

Transkript

1 Metoder til detektion og identifikation af ESβL producerende bakterier Forfatter: Christina Mejdahl Nielsen, født den Projektgruppe: Rosa Helena Sinivuori, født den Jeanette Olsen, født den Bachelorprojektperiode: Den Uddannelsesinstitution: Bioanalytikeruddannelsen, Professionshøjskolen Metropol, København Fag: Mikrobiologi Vejledere: Charlotte Birk Olsen, Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Næstved Sygehus Charlotte Kragh Klausen, Bioanalytikeruddannelsen København

2 Christina Mejdahl Nielsen Billederne illustreret på forsiden er: - Billede øverst i venstre hjørne er fra [24] Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier - Billedet nederst i venstre hjørne er fra [19] - Billedet øverst i højre hjørne er fra - Billedet nederst højre hjørne er fra orm=9&lang=en Forord Dette er et bachelorprojekt, hvor den praktiske del er udarbejdet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Næstved Sygehus. Denne undersøgelse er delvis rettet mod bioanalytikeren i det mikrobiologiske laboratorium til at optimere deres arbejde i detektion og identifikation af ESβL producerende bakterier. Derudover er undersøgelsen rettet mod patienterne, som er inficeret med ESβL producerende bakterier, da der bestræbes at finde metoder med højere diagnostisk sensitivitet og specificitet, der vil kunne implementeres i det mikrobiologiske laboratorium. Jeg vil gerne sige en særlig tak til alle der hjulpet med til dette projekt: Søren Mattern Søes fra Oxoid for at være behjælpelig med svar på spørgsmål og ikke mindst for Brilliance TM ESβL Agar pladerne, Henrik Hasman og Lisbeth Andersen fra DTU Food samt Linda Schjerlund fra Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Hvidovre Hospital for med kort varsel at kunne levere molekylærbiologisktestet stammer, Helle Morgenstjerne, Allan Panslev og Tina Alsing fra biomérieux for information, venlighed og hjælpsomhed for de problemer vi er stødt på undervejs. En stor tak skylder jeg bachelorprojektgruppen på Hvidovre Hospital for at måtte anvende deres data som reference. Til sidst, men ikke mindst, vil jeg gerne takke begge vores to vejledere Charlotte Birk Olsen og Charlotte Kragh Klausen samt personalet på Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Næstved Sygehus, for at være imødekommende og hjælpsomme under bachelorperioden. Forfatterens navn og underskrift: Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, Professionshøjskolen Metropol, København 1 af 48

3 Christina Mejdahl Nielsen Resumé Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier ESβL producerende Enterobacteriaceae er i dag et stigende problem over hele verden. ESβL udbrud er svære at kontrollere og giver epidemiske spredninger, som med stor sandsynlighed skyldes smitte fra patient til patient. På grund af den stigende prævalens er det vigtigt at finde en screeningsmetode samt en konfirmatorisk test med høj diagnostisk sensitivitet og specificitet. Disse metoder skal sørge for at detektere og identificere ESβL producerende bakterier hurtigt og præcis, så der er mulighed for at nedsætte patientens dødelighed. Metoder Flere firmaer lancerer deres bud på detektionen af ESβL producerende bakterier, hertil har vi fundet 4 metoder: To screeningsmetoder; ChromID ESβL agar og Brilliance ESβL Agar, og to konfirmatoriske tests; Cica-Beta-Test samt VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort. Resultater Vi fandt den diagnostiske sensitivitet og specificitet for ChromID ESβL agar til 85,0 % og 70,0 %, mens den for Brilliance ESβL Agar var 87,0 % og 67,5 %. Derudover fandt vi Cica-Beta-Test til at have en diagnostisk sensitivitet og specificitet på henholdsvis 83,0 % og 92,5 %, samt VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort til at have en på 100 % og 11,4 %. Konklusion Brilliance ESβL Agar og ChromID ESβL agar havde næsten den samme diagnostiske sensitivitet, men da Brilliance ESβL Agar koster mindre, foreslår jeg, at denne screeningsplade implementeres på KMA, Næstved Sygehus. Cica-Beta-Test viser høj specificitet, og derfor mener jeg, metoden godt kan anvendes i laboratoriet på KMA, Næstved Sygehus. Cica-Beta-Test ville kunne anvendes ved udbrud på Næstved Sygehus, og jeg foreslår, at metoden anvendes i tilfælde, hvor lægerne mener, at det er nødvendigt. Ud fra vores undersøgelse kan vi ikke konkludere på, hvordan VITEK 2 AST-GN27 ESβL kortet og VITEK 2 Compact apparatet fungerede, da den diagnostiske sensitivitet og specificitet ikke var valid eller pålidelig. 2 af 48

4 Christina Mejdahl Nielsen Indholdsfortegnelse Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier FORORD... 1 RESUMÉ... 2 INDHOLDSFORTEGNELSE... 3 FORKORTELSER... 5 INTRODUKTION... 6 METODERNE NÆSTVED SYGEHUS ANVENDER I DAG... 6 FORMÅL... 7 MÅL... 8 PROBLEMFORMULERING... 8 TEORI... 8 BETALAKTAMANTIBIOTIKA... 8 BETALAKTAMASER... 9 EXTENDED-SPECTRUM BETA-LACTAMASES (ESβL) ANALYSEPRINCIP FOR CHROMID ESβL AGAR (BIOMÉRIEUX) ANALYSEPRINCIP FOR BRILLIANCE TM ESβL AGAR (OXOID) GLYKOSIDASER ANALYSEPRINCIP FOR CICA-BETA-TEST (MAST GROUP) ANALYSEPRINCIP FOR VITEK 2 COMPACT OG AST-GN27 ESβL KORT (BIOMÉRIEUX) METODEVALG OG AFGRÆNSNINGER VALG AF BAKTERIEPOPULATION VIDEN OM BAKTERIEPOPULATION METODEVALG METODEAFGRÆNSNINGER MATERIALER BAKTERIEPOPULATION STAMMER METODER CEFPODOXIM DETEKTION AF ESβL PRODUCERENDE BAKTERIER IDENTIFIKATION MED VITEK 2 ESβL IDENTIFIKATION MED CICA-BETA-TEST STATISTISK BEREGNING RESULTATVURDERING RESULTATVURDERING AF CHROMID ESβL AGAR OG BRILLIANCE ESβL AGAR: RESULTATVURDERING AF VITEK 2 ESβL AST-GN27 KORT: RESULTATVURDERING FOR CICA-BETA-TEST (CBT-1+CBT-ESβL): af 48

5 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier RESULTATER DISKUSSION SCREENINGSMETODERNE CHROMID ESβL AGAR FRA BIOMÉRIEUX BRILLIANCE ESβL AGAR FRA OXOID SAMLEDE DISKUSSION AF CHROMID ESβL AGAR OG BRILLIANCE ESβL AGAR SCREENINGSMETODERNE VED DEN NYE NOMENKLATUR DE KONFIRMATORISKE TESTS CICA-BETA-TEST FRA MAST GROUP VITEK 2 AST-GN27 ESβL KORT FRA BIOMÉRIEUX GENERELT FOR VORES PROJEKT KONKLUSION PERSPEKTIVERING REFERENCER FIGURER BILAG Konfirmatorisk test beskrevet mere uddybende. 2. Eksempel på svar printet ud fra VITEK 2 Compact. 3. Detaljeret informationer om alle de brugte stammer. 4. Fuldt detaljeret fremgangsmåde. 5. Alle resultater for Cefpodoxim zonen samt resultater for ChromID ESβL agar (biomérieux) og Brilliance TM ESβL Agar (Oxoid). 6. Alle resultater for CICA-BETA-TEST (MAST Group). 7. Alle resultater for VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort (biomérieux). 8. Resultaterne på VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort hentet fra Hvidovre Hospital. 9. Beregninger af diagnostisk sensitivitet og specificitet. 10. Slideshow fra Oxoid reference: Søren Mattern Søes, Oxoid, tlf Oversigt over alle falske positive for alle fire metoder. 12. Oversigt over alle falsk negative resultater for alle 4 metoder. 13. Artikel (kilde 16 i litteraturlisten): Extended spektrum Beta-lactamase (ESβL) en ny trussel. 14. Billeder af pladerne overblik over de forskellig farvede kolonier vi har observeret. 15. Indlægsseddel for Vitek2 AST-GN27. Gram negativt Resistenskort. biomeriéux. 16. Instruktionsmanual for biomeriéux VITEK 2 COMPACT apparat. 17. Indlægsseddel for biomeriéux ChromID TM ESβL agar Selektivt kromogent medium til screening for Extended Spektrum β -laktamase producerende enterobakterier (ESβL). 18. Indlægsseddel for biomeriéux ID indole TDA (ID-TDA) Påvisning af indoldannelse og TDA. 4 af 48

6 Christina Mejdahl Nielsen Forkortelser Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Forkortelse Navn AES Advanced Expert System ATCC American Type Culture Collection CBT-1 Cica-Beta-Test 1 CBT-AmpC Cica-Beta-Test C CBT-ESβL Cica-Beta-Test CVA CBT-substrat Cica-Beta-Test substrat C. freundii Citrobacter freundii DNA Deoxyribonukleinsyre E. cloacae Enterobacter cloacae E. coli Escherichia coli EDTA Etylen-diamin-tetra-eddikesyre ESβL Extended-spectrum beta-lactamase FN Falsk negative FP Falsk positive HH Hvidovre Hospital KESC Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter KMA Klinisk Mikrobiologisk afdeling K. oxytoca Klebsiella oxytoca K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae MβL Metallobetalaktamaser MIC Mindst hæmmende koncentration M. morganii Morganella morganii NaCl Natriumklorid/saltvand NFS Nykøbing Falster Sygehus NS Næstved Sygehus P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa PBP Penicillinbindende proteiner PCR Polymerase chainreaction P. mirabilis Proteus mirabilis Proteeae Proteus, Providencia og Morganella RH Regionshospitalet Herning S. bareilly Salmonella bareilly S. maltophilia Stenotrophomonas maltophilia SN Sandt negative SP Sandt positive SS Slagelse Sygehus 5 af 48

7 Christina Mejdahl Nielsen Introduktion Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Extended-spectrum beta-lactamase (ESβL) producerende bakterier blev i Europa første gang omtalt i starten af 1980 erne, kort tid efter indførelse af tredje generations cefalosporiner [4, 5, 10, 18, 26]. I dag er ESβL producerende Enterobacteriaceae et velkendt og stigende problem over hele verden og er især årsag til nosokomielle infektioner [4, 8, 9, 14]. ESβL udbrud er svære at kontrollere og giver epidemiske spredninger, som med stor sandsynlighed skyldes smitte fra patient til patient [4, 10, 14]. Den ESβL producerende bakterie indeholder bakterielle enzymer (betalaktamaser), som er i stand til at hydrolysere og nedbryde betalaktamringen i penicilliner, cefalosporiner, monobaktamet aztreonem samt nogle typer af carbapenemer [1, 2, 10, 13, 15, 16, 22, 26]. Udover enzymernes evne til at udvikle resistens, forårsager disse også problemer i forhold til de plasmider, som ESβL-generne sidder på. Disse plasmider bærer i de fleste tilfælde også på gener, som er co-resistente over for aminoglycosider og fluorokinoloner, hvilket vil sige, at behandlingsmulighederne er begrænsede [1, 8, 15, 16, 26]. Det betyder, at det er vigtigt at finde metoder, der er hurtige og præcise til at detektere og identificere ESβL producerende bakterier [5]. ESβL detektionstiden tager i dag minimum 48 timer [11]. Ved sepsis med enten Escherichia coli (E. coli) eller Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), hvor en ESβL produktion ikke forekommer, vil dødeligheden være omkring 20 % [1, 3, 14]. Ved sepsis med en ESβL producerende bakterie, vil patienten i løbet af de nævnte 48 timer kunne ses i klinisk bedring, da betalaktamaserne endnu ikke har nedbrudt antibiotikummet. Efter få dage vil betalaktamaserne have hydrolyseret betalaktamantibiotikummet, og behandlingen er hermed inaktiv [16]. Denne forkerte behandling og på grund af detektionstiden gør, at dødeligheden stiger med faktor 2-3, hvilket vil sige % [1, 3, 14]. Metoderne Næstved Sygehus anvender i dag Den screeningsmetode, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling (KMA), Næstved Sygehus, i dag anvender til at detektere en mulig ESβL producerende bakterie, er diskdiffusionsmetoden, hvor der udføres en primær resistensbestemmelse. Cefpodoximdiskens hæmningszone fungerer som screeningen på resistenspladen. Findes en nedsat hæmningszone 1 for cefpodoxim, udføres en konfirmatorisk test. 1 24mm for E. coli, K. pneumoniae og Klebsiella oxytoca (K. oxytoca), 29mm for Proteus mirabilis (P. mirabilis) og 19mm for Citrobacter species [31] 6 af 48

8 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier I forbindelse med screeningsmetoden kan der ske en række fejl. Da screeningen foregår i forbindelse med den primære resistensbestemmelse, kan det forekomme, at der på pladen ligger en ESβL producerende bakterie i blanding med andre bakterier. Her kan det være nødvendigt at lave en yderligere isolering til dagen efter. Dette bevirker, at detektionstiden bliver længere. Tilmed kan der i andre tilfælde optræde en sparsom mængde af ESβL producerende bakterier i prøvematerialet. Dette ses ved patienter med en bærertilstand, hvor den ESβL producerende bakterie ikke har forårsaget infektionen. Her kan det risikeres, at den ESβL producerende bakterie trods totaltspredningen ikke ligger ved cefpodoximdisken og måske ikke detekteres, da bakterien ikke ses i cefpodoxims hæmningszone 2. Forskellige firmaer er begyndt at fremstille screeningsplader indeholdende cefpodoxim til at detektere de hyppigst forekommende ESβL producerende bakterier [5, 9, 22 og bilag 17]. Den konfirmatoriske test, KMA, Næstved Sygehus, anvender, er: Cefalosporin/clavulansyre kombinationsdisk på iso-sensitest agar [4]. Her bruges fire antibiotikadisks: Ceftazidim ± clavulansyre og cefotaxim ± clavulansyre, som lægges på en totalspredt iso-sensitest plade uden blod. Ved en hæmningszonedifference på 5mm mellem to antibiotika ved tilstedeværelse af clavulansyre er en ESβL produktion påvist [4, 15] (se bilag 1 for uddybning). Ved den konfirmatoriske test kan der også forekomme fejl. Der kan være tvivl ved aflæsning af hæmningszonestørrelse. Her skal vurderes, om væksten på iso-sensitest pladen uden blod er semikonfluerende, og ved tvivl skal videre test udføres. I nogle tilfælde vil en ny udsåning være nødvendig. Alt dette er med til at forsinke detektionstiden yderligere. Ifølge Overlæge Ole Heltberg, KMA, Næstved Sygehus, ses desuden flere nylige fund af ESβL producerende stammer 3 at have en difference på 3-4mm. Her fejler den nuværende konfirmatoriske test. Der tænkes på at ændre retningslinjerne eller eventuelt finde bedre alternativer. I forbindelse med screeningsmetoden vil vi gerne teste biomérieuxs ChromID ESβL agar og Oxoids Brilliance ESβL Agar. Med hensyn til den konfirmatoriske test vil vi gerne afprøve to metoder: biomérieuxs VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort og MAST Groups Cica- Beta-Test. Formål Vi undersøger disse metoder for at finde hurtigere og bedre detetktionsmetoder, hvor også flere ESβL producerende bakterier findes. Hvis patientens ESβL producerende bakterie 2 Charlotte Birk Olsen, Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Næstved Sygehus. 3 Formentligt er det fra samme klon. 7 af 48

9 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier detekteres og identificeres hurtigere, er der mulighed for at nedsætte dødeligheden. Ydermere vil en mere præcis metode finde flere tilfælde af bakterier, der producerer ESβL, hvilket samtidigt også gør, at der reddes flere liv. Mål Målet med vores bachelorprojekt er at undersøge de fire nævnte metoder med henblik på detektion af ESβL producerende bakterier. Vi vil finde metodernes diagnostiske sensitivitet og specificitet. Udover dette vil der i projektet blive diskuteret detektionstiden og økonomien, da disse to aspekter også er væsentlige. Ud fra resultaterne fra vores forsøg vurderes metoderne, med henblik på en mulig implementering på KMA, Næstved Sygehus. Problemformulering Hvilke af analysemetoderne: ChromID ESβL agar (biomérieux), Brilliance ESβL Agar (Oxoid), Cica-Beta-Test (MAST Group) samt VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort (biomérieux) har den højeste diagnostiske sensitivitet og specificitet og vil kunne anvendes i det mikrobiologiske laboratorium til detektion og identifikation af ESβL producerende bakterier? Teori Betalaktamantibiotika Antibakterielle midler, som går ind og skader bakteriens cellevæg uden at skade den humane celle, er nogle af de vigtigste og mest brugte midler [33]. Blandt disse midler er den største og vigtigste gruppe betalaktamantibiotika, som inddeles i penicilliner, cefalosporiner, monobaktamer og carbapenemer, som fælles for alle har en betalaktamring med en betalaktambinding i deres kemiske struktur (se figur 1). Figur 1: Her ses betalaktamringen (rød cirkel) og betalaktambindingen (blå firkant) [33]. 8 af 48

10 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Alt efter de kemiske sidegrupper ændres virkningsmekanismen i de forskellige midler f.eks. at være smalspektret til at være bredspektret [33]. Bakteriers cellemembran indeholder peptidoglycan. Betalaktamantibiotika går ind og hæmmer cellemembranens enzymer (proteinstoffer), der er med til at opbygge peptidoglycanet. Hæmningen sker ved, at betalaktamantibiotikummet binder sig ved hjælp af kovalente bindinger til proteinstofferne. Disse bindinger kaldes penicillinbindende proteiner (PBP). De Gram-negative bakterier, som Enterobacteriaceae hører til, har kun et tyndt peptidoglycanlag (1-2 lag). Peptidoglycanlaget ødelægges, fordi laget ikke kan klare det høje osmotiske tryk inde i bakterien. Dette kaldes bakteriolyse [33]. Penicilliner er opdelt i tre grupper: 1) Smalspektrede betalaktamasefølsomme penicilliner, 2) smalspektrede betalaktamaseresistente penicilliner og 3) penicilliner med udvidet spektrum [33]. ESβL producerende bakterier er resistente over for de fleste penicilliner, dog viser resistensbestemmelser, at mecillinam tilhørende gruppe 3) oftest er følsomme. Hertil vælges mecillinam frem for andet [34]. Cefalosporiner er inddelt i generationer (1.-4.), som er baseret på, hvornår de er fremstillet, men også på deres antibakterielle aktivitet, hvor en stigning af generationen gør at antibiobikummet har et større spektrum og derved virker på flere forskellige arter af bakterier. 3. og 4. generation har en god aktivitet på Enterobacteriaceae og Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Fra 3. generation kan nævnes cefpodoxim, cefotaxim og ceftazidime og fra 4. generation findes cefepime og cefpirome [20, 33]. Monobaktamer har deres effekt på betalaktamaser, som dannes af aerobe Gram-negative bakterier. Under monobaktamerne findes kun aztreonam, som er i klinisk brug [33]. Carbapenemer er det af alle betalaktamantibiotika, der har det bredeste spektrum og derved den største effektivitet. De virker både på aerobe og anaerobe Gram-positive og Gramnegative bakterier dog med få undtagelser. Blandt carbapenemer er meropenem, som er mest aktive mod Gram-negative bakterier, og imipenem, som foretrækkes i brug ved Gram-positive bakterier [20, 33]. Betalaktamaser Betalaktamaser er bakterielle enzymer, som er i stand til at hydrolysere og nedbryde betalaktamringen i betalaktamantibiotika. Hidtil er der rapporteret 533 betalaktamaser [1, 2, 9 af 48

11 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 16, 20, 22]. Bakterier kan udover kromosomer også indeholde to andre former for deoxyribonukleinsyre (DNA): Plasmider og transposoner [20, 27]. Der findes flere forskellige måder at inddele betalaktamaser. I Amblers klassifikationssystem inddeles betalaktamaserne i fire grupper; A, B, C og D [2, 4, 8, 20]. Klassificeringen sker molekylært på baggrund af deres ligheder i aminosyresekvensen [20]. Klasse A: Klasse B: Klasse C: Gruppe D: Den består af de klassiske ESβL. Vi har beskæftiget os mest med denne gruppe, da den er hyppigst forekommende og derved det største problem. Gruppen vil blive uddybet nærmere i næste afsnit. Denne gruppe er metallobetalaktamaserne (MβL) og skal bruge zink eller et andet tungmetal for at blive katalyseret. Disse ses hyppigst hos Legionella og Stenotrophomonas maltophilia (S. maltophilia). Alle MβL hæmmes af etylendiamin-tetra-eddikesyre (EDTA), mens nogle MβL også hæmmes af aztreonam. MβL er resistente overfor penicilliner, cefalosporiner og carbapenemer. Størstedelen af MβL er kromosomalt kodet og er oftest af typerne VIM og IMP [2, 20]. Gruppen består af AmpC og er typisk kromosomalt kodet, men kan også være plasmidmedieret [15, 20]. AmpC producerende bakteriers resistensmønster minder om de ESβL producerende bakteriers, men AmpC hæmmes ikke af clavulansyre, sulbactam eller tazobactam men i stedet af kloxacillin og borsyre [6, 7]. AmpC produktion ses i bakterier som Citrobacter freundii (C. freundii) og Enterobacter cloacae (E. cloacae) og viser følsomhed overfor 4. generations cefalosporinet cefepime, som også bruges til screening. Blandt AmpC findes for eksempel generne CMY, FOX, ACT og ACC [4, 20]. I nogle tilfælde udtrykker ESβL producerende bakterier også AmpC. Findes en AmpC producerende bakterie til at være cefepime resistent 4, kunne det godt tyde på, at der også var en ESβL produktion [15]. Den sidste gruppe består af oxacillin hydrolyserende betalaktamaser (OXA) og PSE. Denne gruppe hæmmes ligesom ESβL af clavulansyre bare i en mindre grad og derudover hæmmes OXA af natriumklorid (NaCl). OXA produktion ses i bakterier som Acinetobacter species, P. aeruginosa og Enterobacteriaceae [20]. 4 Breakpoint er 27 mm. 10 af 48

12 Christina Mejdahl Nielsen Tabel 1: Amblers klassifikationssystem Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Klassificering β-laktamaser Inhibitorer Klasse A ESβL Clavulansyre, sulbactam og tazobactam. Klasse B MβL EDTA Klasse C AmpC Kloxacillin og borsyre Klasse D OXA- og PSE gruppen Clavulansyre og NaCl (skema udarbejdet i samarbejde med Rosa Sinivuori og Jeanette Olsen) Der er blevet fremlagt en ny forståelse for inddelingen af betalaktamaser. Giske C.G. et al. (2009) har lavet nye opdelinger med henblik på at forenkle klassifikationerne og gøre det mere overskueligt, så sundhedspersonalet kan bidrage til en større indsats mod spredningen af betalaktamaser. Det har været svært for mikrobiologerne på KMA, Næstved Sygehus, at formidle nye fund som f.eks. AmpC producerende bakterier til sundhedspersonalet, da der er mange ting, de skal kunne overskue. Proceduren ved fund af AmpC producerende bakterier på KMA, Næstved Sygehus, har, ifølge overlæge Ole Heltberg, været simpel: Laboratoriet har svaret, at der ikke er fundet nogen ESβL producerende bakterier og har herefter indtastet resistensmekanismerne i systemet. På sådanne svar vil der ikke blive ført samme slags interventioner 5, som der gøres ved fund af en ESβL producerende bakterie, hvilket ikke er optimalt og på baggrund af dette kan den nye forståelse give forbedringer [29]. Inddelingen for den nye forståelse er som følgende (se tabel 2 næste side): De klassiske ESβL, som hører til Amblers klassifikationssystem klasse A, hedder nu ESβL A. Denne gruppe hæmmes af clavulansyre. ESβL 6 M er anden gruppe, som herunder inddeles i ESβL M-C, som er plasmidmedierede AmpC enzymerne, og ESβL M-D, som er OXA-ESβL. Disse hører til Amblers klassifikationssystem klasse C og D og hæmmes af kloxacillin og borsyre. Den sidste gruppe er ESβL CARBA og er givet, når en bakterie er i stand til at hydrolysere mindst et carbapenem. ESβL CARBA inddeles i tre undergrupper: 1) ESβL CARBA-A, 2) ESβL CARBA-D og 3) ESβL CARBA-D. ESβL CARBA-A består af blandt andet KPC 7 og GES typerne og hæmmes af borsyre, mens ESβL CARBA-D er metallobetalaktamaser blandt andet af typerne VIM og IMP, og disse hæmmes af EDTA. Den sidste undergruppe er ESβL CARBA-D og består af OXAcarbapenemaser. Disse findes ved fænotypisk eller genotypisk bestemmelse [29]. I vores resultater bruger vi forståelsen af Amblers klassifikationssystem, men der bliver i diskussionen inddraget den nye forståelse, beskrevet af Giske C.G. et al. (2009), da dette måske ændrer på nogle ting ved vores projekt. 5 Isolering, øget hygiejne osv. 6 ESβL miscellaneous oversat diverse ESβL 7 Klebsiella pneumonia klasse A carbapenemase 11 af 48

13 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Tabel 2: Klassificering af ny nomenklatur Klassificering β-laktamaser Inhibitorer ESβL A ESβL Clavulansyre, sulbactam og tazobactam. ESβL M : ESβL M-C Plasmidmedieret AmpC Kloxacillin og borsyre ESβL M-D OXA-ESβL Kloxacillin og borsyre ESβL CARBA OXA- og PSE gruppen Clavulansyre (dog i mindre grad end ESβL A ) og NaCl ESβL CARBA-A ESβL carpenenemaser Borsyre ESβL CARBA-B MβL EDTA ESβL CARBA-D OXA-carbapenemases Findes ved fænotipisk og/eller genotyipisk bestemmelse (skema udarbejdet i samarbejde med Rosa Sinivuori og Jeanette Olsen) Extended-Spectrum Beta-Lactamases (ESβL) Den ESβL producerende bakterie indeholder bakterielle betalaktamaser, som er i stand til at hydrolysere og nedbryde betalaktamringen af de fleste betalaktamantibiotika [1, 2, 13, 15, 16, 22, 26]. ESβL tilhører klasse A i Amblers klassifikationssystem og findes af gentyperne: SHV, TEM, CTX-M, OXA og PER [4, 9, 20, 26]. De første fund beskrevet var hovedsagelig K. pneumoniae i forbindelse med nosokomiel infektioner og var af generne TEM-1, TEM-2 og SHV-1 [8, 26]. Nu findes ESβL producerende bakterier hyppigst ved E. coli med en betydelig stigning af gener med CTX-M enzymerne og er ikke kun nosokomiel, men også samfundserhvervet. Fælles for alle ESβL producerende bakterier er, at de inhiberes af clavulansyre, sulbactam og tazobactam 8 [2, 8, 10, 13, 15, 20, 26]. ESβL-generne sidder oftest på plasmider. Disse er årsagen til, at der let videreføres resistens imellem bakterierne. Tilmed har plasmiderne oftest også andre gener med resistens over for aminoglycosider og fluorokinoloner siddende, og dette begrænser behandlingsmulighederne [1, 8, 15, 16, 26, 34]. I de fleste tilfælde virker carbapenemer, men ved udbredt anvendelse af carbapenemer vil prævalensen af MβL og carbapenemaser resistente end ESβL, hvilket vil sige, at der slet ikke er muligheder for behandling [15, 16]. Også i de gener, som er ansvarlige for betalaktamdannelsen, sker der oftest mutationer. Disse går videre til de næste generationer og gør, at generne i høj grad kan ændre betalaktamasens virkningsspektrum [14, 27]. ESβL produktion findes hovedsagelig i Enterobacteriaceae, men ses også hos andre bakterier. Det kan f.eks. være P. aeruginosa og Acinetobacter species [8, 9 stige. Disse frygtes at være mere 8 Dog med undtagelse af inhibitor-resistent TEM (IRT) 9 Betalaktamaser, der spalter carbapenemer 12 af 48

14 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 12]. Ydermere ses en stigning i ESβL producerende bakterier, som også udtrykker en AmpC produktion [13, 15]. Analyseprincip for ChromID ESβL agar (biomérieux) ChromID ESβL agar giver en direkte farveidentifikation af de hyppigst forekomne ESβL producerende bakterier. Pladen er et selektivt indikativt kromogent medium, der er beregnet til screeningsmetode for ESβL producerende bakterier (se bilag 17). Det selektive i pladen er, at pladen er tilsat forskellige antibiotika, herunder cefpodoxim, som gør, at ESβL producerende bakterier vokser frem på pladen, mens andre bakterier inhiberes [18 og bilag 17]. Cefpodoxim fungerer som screeningsmarkør for ESβL, da de fleste ESβL producerende bakterier er resistente over for cefpodoxim [9]. Chrompladen giver samtidigt et indikativt resultat, da to kromogene substrater og et naturligt substrat er tilsat i pladen og bevirker, at bakterierne vokser frem med forskellige farvede kolonier alt afhængig af bakterieart. Vi ved ikke præcist, hvad substraterne består af, da dette er en fabrikshemmelighed. E. coli kolonier bliver lyserød eller bourgognefarvet. Farveudviklingen for E. coli sker, fordi disse bakterier danner glukuronidase. Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter (KESC) kolonier bliver grønne, brunlig grønne eller blåfarvet, men skal den pågældende mikroorganisme bestemmes på artsniveau, kræves yderligere tests. KESC-gruppens farve skyldes, at disse bakterier danner glukosidase. Proteeae (Proteus, Providencia og Morganella) giver kolonierne en mørkebrun til lysebrun farve. Stammerne får denne farve, da de udtrykker deaminase [18 og bilag 17]. Figur 2: Set fra venstre:1) E. coli, der kun producerer glukuronidase (bordeaux kolonier), 2) KESC-gruppen, som producerer galaktosidase (grønne kolonier), 3) P. mirabilis, som udtrykker deaminase (brune kolonier) og 4) E. coli, som ikke producerer glukuronidase (farveløse kolonier) Egne billeder taget i laboratoriet. (se større billeder i bilag 14) 13 af 48

15 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier På pladen kan alle typer prøver anvendes: Rektale podepinde, urin, respiratoriske sekreter etc. De kan inokuleres direkte på agaren (se bilag 17) Efter tilsætning af inokulum inkuberes pladerne med agarsiden opad ved 35 C i atmosfærisk luft i timer, og herefter aflæses deres farve. Hvis der ikke er nogen vækst på pladen efter første inkubering, tolkes dette som et negativt resultat, og pladen inkuberes yderligere i timer for at øge detektionsfølsomheden (se bilag 17). Pladen har nogle begrænsninger, som der skal tage højde for: E. coli-stammer, som ikke producerer glukuronidase, og Proteus mirabilis (P. mirabilis), som kun udtrykker lav ESβL produktion, kan vokse frem på pladen med farveløse kolonier. Ved fund af farveløse kolonier, skal der udføres en oxidasetest. Hvis oxidasetesten på de farveløse kolonier er negativ, skal denne bakterie mistænkes for at indeholde en mulig ESβL produktion. Nogle Pseudomonas-stammer kan ligne Proteeae, idet de kan vokse frem som brune i deres pigmentering. Hertil bruges igen oxidasetesten til adskillelse. En positiv oxidasetest er Pseudomonas, mens en negativ oxidasetest er Proteeae. Ved positivt resultat sker en blå reaktion (se bilag 17). Udover oxidasetesten skal indoltesten også bruges. Indoltesten udføres på alle fund af kolonier, der er lyserød til bourgognefarvet. Dette skyldes, at andre bakterier end E. coli, som for eksempel C. freundii, E. cloacae og Salmonella sp. også kan danne disse lyserøde eller bourgognefarvede kolonier. Ved en positiv indoltest er fundet af E. coli bekræftet, mens der ved en negativ indoltest er yderligere identifikation påkrævet (se bilag 17). Ved påvisning af indol udnyttes tryptofan, som pladen indeholder, og reagenset ID indole TDA (ID-TDA) R1. Bakterier, som har tryptofanase i sig, vil være i stand til at nedbryde tryptofanet og frigøre indol. Ved en positiv indoldannelse vil der ske en blåfarvning (se bilag 18). På mediet kan der også vokse andre ikke-esβl producerende bakterier. Andre multiresistente mikroorganismer kan også vokse som typiske kolonier på mediet. Videre identifikation af disse bakterier skal udføres (se bilag 17). Analyseprincip for Brilliance TM ESβL Agar (Oxoid) Brilliance TM ESβL Agar er også et selektivt indikativt kromogent medium til screening for ESβL. Brilliance TM ESβL Agar pladen differentierer mellem de hyppigst forekommende 14 af 48

16 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier ESβL producerende bakterier og fungerer på samme måde som ChromID ESβL agar. Princippet er det samme: Pladen indeholder også cefpodoxim og andre almindelige antibakterielle stoffer, som inhiberer ikke-esβl producerende bakterier. De andre antibakterielle stoffer er en fabrikshemmelig, så vi ved ikke, hvilke disse er. Pladen indeholder også to kromogener, som er specifikt rettet imod enzymerne galaktosidase og glukuronidase [22]. Farvereaktionerne er lidt anderledes end på ChromID ESβL agar. E. coli, der både producerer glukuronidase og galaktosidase, giver blåfarvede kolonier. E. coli, der kun producerer glukuronidase, giver pink kolonier. KESC producerer galaktosidase, hvilket fremkalder grønne kolonier på Brilliance TM ESβL Agar [22]. Proteeae vokser med brunlige kolonier. Til farvereaktionen anvendes ikke nogle af de kromogene substrater, men i stedet udnyttes det faktum, at bakterierne er i stand til at deaminere tryptohan [22] (se figur 3 nedenfor). Ved Salmonella, Acinetobacter og forskellige bakterier med andre resistensmekanismer kan der vokse farveløse kolonier frem på mediet. Fund af farveløse kolonier er muligvis klinisk signifikans på bakterien, og denne bør undersøges yderligere [22]. Figur 3: Set fra venstre:1) E. coli, der producerer glukuronidase og galaktosidase (blå kolonier), 2) E. coli, der kun producerer glukuronidase (pink kolonier), 3) KESC-gruppen, som producerer galaktosidase (grønne kolonier), 4) P. mirabilis, som deaminere tryptophan (brune kolonier) og 5) P. aeruginosa (farveløse kolonier) 11. Der kan anvendes alle typer prøver direkte på pladen: Screening prøver, fækale prøve, isolerede kolonier eller flydende suspension som for eksempel urin [23]. Efter tilsætning af inokulum inkuberes pladerne med agarsiden opad ved 35 C i atmosfærisk luft i timer, og herefter aflæses deres farve. Hvis der ikke er nogen vækst på pladen efter første døgn, tolkes dette som et negativt resultat, og pladen inkuberes ydereligere i timer [22, 23]. Ved blå og lyserøde kolonier bruges RapID Spot Indoleddikesyre test, som kan bekræfte E. coli identifikationer [23]. 11 Billede 1), 2), 3) og 5) ses i bilag 11. Billede 5) Eget billede taget i laboratoriet (se større af alle i bilag 14) 15 af 48

17 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Prøver, der indeholder fækalt materiale eller blod, kan medføre misfarvninger på mediet. Misfarvningen skal ikke forveksles med en ægte chromogenreaktion, hvor farvede kolonier er synlige [23]. Figur 4: Misfarvning af agar (se bilag 10) Glykosidaser Mange bakterier indeholder glykosidaser, som er hydrolytiske enzymer, der spalter glykosid [30]. F.eks. producerer 96 % E. coli glukuronidase, mens 89 % E. coli og 98 % af K. pneumoniae producerer enzymet galaktosidase [17]. I ChromID ESβL agar og Brilliance TM ESβL Agar er glykosidaserne de syntetiske kromogene substrater. Begge chromplader indeholder enzymerne glukuronidase og galaktosidase, som vil frembringe farvede kolonier, hvis bakterien producerer nogle af de enzymer. K. pneumoniaes indhold af galaktosidase betyder, at bakterien er i stand til at danne glukosidase, som spalter glykosidbindingen i laktose. Et kemisk fremstillet stof bruges ved påvisning galaktosidase og indeholder samme glukosidbinding som laktose [30]. Analyseprincip for Cica-Beta-Test (MAST Group) Cica-Beta-Test er en test, der ved en farvereaktion direkte kan påvise ESβL, hyperproducerende AmpC enzymer og MβL [19]. Cica-Beta-Test består af 4 plastik strips, men da vi har taget detektionen af MβL ud af vores forsøg (se senere afsnittet metodeafgrænsninger ), bruger vi 3 af 4 plastik strips. Disse er: 1) Cica-Beta-Test 1 (CBT-1), som bruges til detektion af ESβL og MβL. 2) Cica-Beta-Test CVA (CBT-ESβL), som bruges til konfirmation af ESβL. 3) Cica-Beta-Test C (CBT-AmpC), som bruges til detektion af AmpC. De 3 strips har hver især et filter i enden indeholdende forskellige stoffer. CBT-1 indeholder ingen inhibitorer, mens CBT-ESβL indeholder clavulansyre, der inhiberer ESβL og CBT- AmpC indeholder Benzo-thiophene-2-boronicsyre, som inhiberer AmpC enzymer [11]. For at få en farvereaktion tilsættes Cica-Beta-Test substrat (CBT-substrat) på hvert filter. CBTsubstrat indeholder det sammensatte HMRZ-86 [19]. 16 af 48

18 Christina Mejdahl Nielsen Figur 5: Her ses HMRZ-molekylet Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier HMRZ-86 er en kromogenisk cefalosporin, hvor en carboxy-propyloxyimino gruppe fæstnes til sidekæde på position 7 (se rød cirkel på figur 5). Denne gruppe beskytter betalaktamringen fra en række betalaktamaser, men ikke ESβL eller MβL. En hydrolysering af enzymernes betalaktamring ændrer bølge-længden absorberet af den konjugerede dobbeltbinding på position 3 (se blå cirkel på figur 5), hvilket gør, at der sker en farvereaktion af gul til rød (se billede til højre) [28]. Testen udføres i et flow, hvilket vil sige at: Figur 6: To teststrips; Én uden reaktion (gul) og én med reaktion (rød) [19] CBT-1 + frisk kolonimateriale = Gul Testen stoppes her, for der er ingen ESβL produce- = Rød rende bakterie. Vi har dog lavet CBT-1 og CBT- ESβL samtidigt. CBT-ESβL + frisk kolonimateriale = Gul En ESβL produktion er påvist. = Rød CBT-AmpC + frisk kolonimateriale = Gul En AmpC produktion er påvist. = Rød CBT-MβL har vi ikke med CBT-MβL + frisk kolonimateriale = Gul En MβL produktion er påvist. = Rød Multipel β-laktamase producerende bakterier. Begrænsningerne for Cica-Beta-Test er, at testen skal udføres på renkultur, og at alle fire strips skal laves, da nogle bakterier kan udtrykke multiple resistensmekanismer [19]. 17 af 48

19 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Analyseprincip for VITEK 2 Compact og AST-GN27 ESβL kort (biomérieux) Som konfirmatorisk test findes blandt andet det automatiserede VITEK 2 Compact system. Systemet analyserer på kort indeholdende brønde med forskellige antimikrobielle stoffer. Alt efter hvad, der ønskes at undersøge 12, vælges forskellige kort til enten identifikation eller resistensbestemmelse (se bilag 15). VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort er et nyt resistensbestemmelseskort, der lige er kommet på markedet og er specielt lanceret med henblik på ESβL producerende bakterier. Kortet består af 19 brønde, som skal vurderes med henblik på at være et muligt alternativ til andre konfirmatoriske test. Brøndene indeholdende antimikrobielle stoffer bestemmer sensitiviteten for klinisk signifikant aerobe Gram-negative bakterier in vitro. Stofferne i brøndene er: 1) Positiv kontrol, 2) Amikacin, 3) Amoxicillin med Clavulansyre, 4) Ampicillin, 5) Cefazolin, 6) Cefepime, 7) Cefotaxim, 8) Cefoxitin, 9) Ceftazidim, 10) Ciprofloxacin, 11) Figur 7: VITEK 2 AST- GN27 ESβL kort. ESβL 13, 12) Gentamicin, 13) Imipenem, 14) Nitrofurantoin, 15) Norfloxacin, 16) Piperacillin, 17) Piperacillin med Tazobactam, 18) Tetracyclin og 19) Trimethoprim med Sulfamethoxazol (se bilag 15). Figur 8: VITEK 2 Compact apparatet I VITEK 2 Compact systemet anvendes der synligt lys til direkte måling af organismetilvæksten. Dette kaldes transmittansoptik. Inden væksten i brønden er begyndt, tages en nul lysaflæsning. Herefter måles hver 15. minut hver brønds organismetilvækst, og der måles på, hvor meget lys, der passerer gennem brønden (se bilag 16). Dette er turbedimetrisk måling. Kortets princip bygger på mindst hæmmende koncentration (MIC) bestemmelse (se bilag 16). VITEK 2 Compact systemet har udover en guideline med MIC-værdier, som tolker, om bakterien er følsom, intermedier følsom eller resistent, også et Advanced Expert System (AES). Dette system har en stor vidensdatabase med forventede MIC-fordelinger. 12 Gram-negative, Gram-positive, stave, kokker eller lignende. 13 ESβL brønden indeholder 6 forskellige antibiotika: Cefepime med og uden Clavulansyre, Cefotaxim med og uden Clavulansyre og Ceftazidim med og uden Clavulansyre. 18 af 48

20 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Ifølge Tina Alsing, produktspecialist fra biomérieux, er VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort specielt egnet til ESβL producerende bakterier, da kortet indeholder to forskellige tests: 1. test består af en ESβL-test, som indeholder 3 forskellige cefalosporiner 14, som testes med og uden clavulansyre. Her vurderer VITEK 2 Compact systemet om der er en væsentlig vækstforskel i antibiotika med og uden clavulansyre. 2. test består af de øvrige cefalosporiner 15, hvor VITEK 2 Compact systemet ser specielt på disses MIC-værdier. I løbet af 6-13 timer 16 laver AES en samlede vurdering ud fra begge tests. Resultaterne for ESβL-test samt hver brønd findes under Susceptibility Information, mens det endelige svar findes på printet under AES findings og Phenotype (se bilag 2, der viser et eksempel for et svar printet ud fra VITEK 2 Compact). Ved fund af en positiv ESβL stamme vil alle penicilliner, cefalosporiner og aztreonam uanset resistensmekanisme skulle svares ud som resistente [15 og bilag 15]. Derudover kan det ved et negativt ESβL resultat ikke udelukke tilstedeværelsen af en ESβL produktion, da bakterien kan være maskeret, hvis bakterien både er AmpC og ESβL. En maskering gør, at den ESβL producerende bakterie ikke detekteres (se bilag 15). Metodevalg og afgrænsninger Valg af bakteriepopulation Vi har i vores valg af stammer ledt efter molekylærbiologisktestet materiale, både til den positive og den negative population. Det betyder, at vi ikke har medtaget kontroller, da vi ved, hvad er positivt og negativt. Den positive population består af 100 ESβL producerende stammer: Heraf 51 E. coli, 48 K. pneumoniae og 1 P. mirabilis. De positive stammer er af de hyppigst forekommende typer: CTX-M, SHV og TEM (se bilag 3). I den positive population er der også medtaget 2 E. coli stammer, som både er ESβL og AmpC positive, da nogle af firmaerne (se bilag 15) advarer om, at der ved en produktion af både AmpC og ESβL kan forekomme en maskering og kan give et falsk negativt resultater. 14 Cefepime, Cefotaxim og Ceftazidim generation: Cefazolin, 2. generation: Cefoxitin, 3. generation: Cefotaxim og Ceftazidim, og 4. generation: Cefepime. 16 Gennemsnitsdetektionstiden er 7,5 timer. 19 af 48

21 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Den negative population består af 40 stammer, som er nøje udvalgt til projektet. Disse er: K. pneumonieae, E. coli og Enterobacter species, K. oxytoca, Pseudomonas species, C. freundii, Salmonella species, Hafnia alvei og Morganella morganii (M. morganii). Stammerne er valgt for at se, hvilke problemstillinger det kan give. Heriblandt har vi medtaget 20 AmpC positive bakterier, da ESβL og AmpC godt kan ligne hinanden, og AmpC positive bakterier måske kan falde ud som ESβL positive. Derudover har vi fundet 20 bakteriestammer med udvidede resistensmekanismer i forhold til arten og bakteriearter, som ifølge videnskabelige artikler og analysemetodernes forskrifter kan give falsk positive svar [5, 9]. Ved den sidstnævnte gruppe har det ikke været muligt, at alle var molekylærbiologisktestet. Viden om bakteriepopulation For at give et overblik vil næste afsnit handle om de valgte stammer og hvad vi ved om dem (For oversigt af følgende afsnit se bilag 3). Bakterier, som er molekylærbiologisktestet for ESβL, er stammerne nr , og , mens de bakterier, som er molekylærbiologisktestet for AmpC, er stammerne nr. 1-26, 70 og Bakteriestammerne, som er fundet positive for enten ESβL eller AmpC ud fra deres følsomhed overfor cefepime 17, er nr og Var cefepime resistent ( 26mm) kunne det godt være, at der også var en ESβL produktion og omvendt var cefepime sensitiv ( 27mm) kunne der være en AmpC produktion tilstede. Til sidst skal nævnes de stammer, som er blevet fænotypisk testet på enten Hvidovre Hospital 18 eller Næstved Sygehus 19. Disse er nr , , og Metodevalg Vi har valgt at teste ChromID ESβL agar, for at finde ud af om pladen kan bruges som screeningsplade for ESβL producerende bakterier. Pladen kan måske gå ind og erstatte screeningsmetoden, der anvendes i dag, og har den fordel, at pladen indeholder cefpodoxim, hvilket giver mulighed for at selektere en produktion af ESβL. Ydermere kan screeningspladen måske fange bakterier, som patienten har i kronisk bæretilstand (se bilag 17 Data fra Regionshospitalet i Herning, bachelorgruppe med ESβL-projekt (jan-2007) og data fra Næstved Sygehus, bachelorgruppe med AmpC-projekt (jan-2009). 18 På Hvidovre Hospital laves en konfirmatorisk for både ESβL og AmpC med henholdsvis cefpodoxim og cefepime. 19 På Næstved Sygehus laves en konfirmatorisk for ESβL med cefpodoxim. 20 af 48

22 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 17). Kan screeningspladen ikke gå ind og erstatte, kunne den være et supplement til at detektere flere ESβL producerende bakterier. Da vi gerne ville have noget at sammenligne ChromID ESβL agar med, fandt vi ud af, at Oxoid lige havde lanceret en tilsvarende screeningsplade, så derfor fandt vi Brilliance TM ESβL Agar interessant at tage med i vores bachelorprojekt. Cica-Beta-Test vidste vi ikke noget om, men KMA, Næstved Sygehus, var meget interesseret i at få testen undersøgt på grund af dens detektionstid. Cica-Beta-Test tager kun mellem 2-15 minutter og med en så kort detektionstid, ville patienten hurtigt kunne komme i den rigtige behandling og derved sænke dødeligheden. Så med ønske fra afdelingen blev testen taget med i vores projekt. VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort havde vi på forhånd hørt positivt om, og vi fandt kortet interessant, da det køres på VITEK Compact, som er et automatiseret apparat, hvilket gør, at de menneskelige fejl minimeres. Ydermere har vi valgt at se på alle bakteriestammernes følsomhed overfor cefpodoxim, som er et 3. generations cefalosporin. Til vurdering af hæmningszone, farve på kolonier, vækst og reaktioner har vi været blindet for de faktiske stammer, så disse ikke kunne have nogen indflydelse på resultaterne. Valg af statistik er baseret på udregning af metodernes diagnostiske sensitivitet og specificitet. Da ESβL producerende bakterier, som nævnt tidligere, er farlig fordi behandlingsmulighederne er så begrænset, vil en screeningsmetode kræve, at sensitiviteten er meget høj. Det gælder om at finde alle sandt positive, så en hurtig behandling kan sættes ind. Den konfirmatoriske test skal efter screeningsmetodens fund have en god diagnostisk specificitet, da denne skal udelukke bakterier, som ikke indeholder en ESβL producerende bakterie. Metodeafgrænsninger Oxoids Brilliance TM ESβL Agar plade er først blevet lanceret den 1.april 2009, og vi er de første, der afprøver pladerne, i Danmark. Da pladen er så ny på markedet, betyder det også, at de publicerede artikler er begrænset. Derfor er det eneste vi kan forholde os til den medfølgende brochure og indlægssedlen samt to studier; et fra Oxoid og et fra MOSAR [21, 22, 23, 24]. VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort blev lanceret ved årsskiftet, og der er derfor ikke nogle publiceret artikler for dette kort. Ifølge Tina Alsing, produktspecialist fra biomérieux, er 21 af 48

23 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier AST-GN27 en opdatering af AST-N041, så denne vil bruges i diskussionen. Tilmed har nogle kort en ESβL-test, og disse kort kan bruges til at sammenligne AST-GN27 korts ESβL-test med deres. Hertil bruger vi AST-N045. Cica-Beta-Test har mulighed for at teste for ESβL, hyperproducerende AmpC enzymer og metallobetalackamaser (MβL) [19]. På grund af vores projekts fokus og økonomien har vi valgt at tage detektionen af MβL ud af forsøget. Ydermere er der ved Cica-Beta-Test kun blevet undersøgt for AmpC med CBT-AmpC på de stammer, hvor reaktionen blev rød i CBT- 1 og rød i CBT-ESβL, da budgettet ikke var til, at vi testede CBT-AmpC på alle stammerne. AmpC producerende bakterier er ikke en del af vores problemformulering, så derfor fravælger vi at regne en diagnostisk sensitivitet og specificitet, hvor CBT-AmpC er medtaget. Ud fra Cica-Beta-Tests afgrænsninger bliver vi nødt til at regne den diagnostiske sensitivitet og specificitet udelukkende ud fra detektionen af de ESβL producerende bakterier og ikke de tre andre muligheder; AmpC, MβL og multiple betalaktamaser. Materialer I det følgende afsnit findes tabeller over anvendt apparatur og reagenser. Yderligere gives en oversigt over, hvor vi har vores bakteriepopulation fra samt tabeller med, hvordan de er kategoriseret i forhold til ESβL og AmpC producerende bakterier. Apparatur Producent Lot. nr. Udløbsdato VITEK 2 Compact biomérieux Densichek biomérieux IDK ChromID ESβL agar biomérieux VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort biomérieux Cica-beta-test 1 (CBT-1) MAST Group 8S Cica-beta-test CVA (CBT-ESβL) MAST Group 8P Cica-beta-test C (CBT-AmpC) MAST Group 8R Brilliance ESβL Agar Oxoid Cefpodoxim disks (10µg) Oxoid Reagensglas Iso-sensitest uden blod SSI % blodplade SSI Reagenser Producent Lot. nr. Udløbsdato 0,45 % NaCl AirLife G Oxidase reagens SSI ID indole TDA (ID-TDA) R1 biomérieux af 48

24 Christina Mejdahl Nielsen Bakteriepopulation Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier I dette bachelorprojekt er der blevet anvendt 140 stammer fra Nykøbing Falster Sygehus (13), Hvidovre Hospital (66), DTU Food 20 (21), Universitetshospitalet Nord-Norge (5) [32], Regionshospitalet Herning 21 (8), Slagelse Sygehus (4), Næstved Sygehus (9), American Type Culture Collection (ATCC) stammer (2) samt QC stammer fra Quality Assurance Laboratory i London (12). Se bilag 3 for rådata om stammerne. Tabel 3: Fordelingen af stammer, som er ESβL positive og AmpC negative Stammer QC ATCC DTU HH RH NFS NS SS Food E. coli K. pneumoniae P. mirabilis HH = Hvidovre Hospital NS = Næstved Sygehus RH = Regionshospitalet Herning SS = Slagelse Sygehus NFS = Nykøbing Falster Sygehus Tabel 4: Fordelingen af stammer, som er ESβL negative og AmpC negative Stammer ATCC QC Hvidovre Hospital Næstved Sygehus E. coli K. pneumoniae C. freundii P. aeruginosa S. typhimurium S. enteritidis Pseudomonas species Tabel 5: Fordelingen af stammer, som er ESβL positive og AmpC positive Stammer Regionshospitalet Herning E. coli 2 Tabel 6: Fordelingen af stammer, som er ESβL negativ og AmpC positiv Stammer Universitetshospitalet i Nord-Norge [32] DTU Food Regionshospitalet Herning Hvidovre Hospital E. coli K. pneumoniae Enterobacter species K. oxytoca Hafnia alvei Morganella morganii S. heidelberg S. bareilly C. freundii Henrik Hasman, Seniorforsker, DTU Fødevareinstituttet, Afdeling for Mikrobiologi og Risikovurdering. 21 Helga Schumacher, Overlæge på Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Regionshospitalet Herning. 23 af 48

25 Christina Mejdahl Nielsen Metoder Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier I afsnittet beskrives, hvordan metoderne er blevet udført. Se bilag 4 for den detaljeret fremgangsmåde. Her står udførligt, hvad vi har gjort. Cefpodoxim Kolonimateriale fra frisk inkuberet 5 % blodagarplade opslemmes i 0,45 % NaCl til en McFarland på cirka 0,5. 1µl bakteriesuspension inokuleres på en iso-sensitest plade uden blod med en totrinsspredning, hvorefter en cefpodoximdisk placeres mellem 1. og 2. strøg. Pladen inkuberes 35 C under aerobe forhold og hæmningszonestørrelsen aflæses dagen efter. Detektion af ESβL producerende bakterier Kolonimateriale fra frisk inkuberet iso-sensitest plade uden blod opslemmes i 0,45 % NaCl til en McFarland ± 0,5. 1µl bakteriesuspension inokuleres på henholdsvis ChromID ESβL agar (biomérieux) og Brilliance ESβL Agar (Oxoid). Pladerne inkuberes med bunden op ad i 35 C under aerobe forhold og aflæses efter 24 timer og 48 timer. For hver af de to medier blev farven på kolonierne noteret, og på baggrund af producenternes vejledning kunne bakteriearten bestemmes. Tabel 7: Farveidentifikation på chrompladerne. Organisme ChromID ESβL agar Brilliance ESβL Agar E. coli Pink, bordeaux Blå, pink KESC gruppe Grøn, brunlig grøn, blå Grøn Proteeae Mørke brun- lysebrun Lysebrune, mørkebrun omkreds Identifikation med VITEK 2 ESβL Frisk inkuberet kolonimateriale opslemmes i 0,45 % NaCl til en McFarland 0,5-0,63 (se bilag 16). Bakteriesuspensionen placeres med et VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort i VITEK 2 Compact apparatur. Prøven analyseres, og et resultat opnås efter 6-13 timer. Det endelige svar, på om den undersøgte bakterie er ESβL producerende, findes under AES findings på svarudskriftet. 24 af 48

26 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Identifikation med Cica-Beta-Test Ved udførelse af Cica-Beta-Test tilsættes substrat til alle teststrips. Fra en iso-sensitest plade uden blod tages frisk inkuberet prøvemateriale fra kanten af cefpodoxims hæmningszone, og påføres på hver teststrips. Resultatet af farvereaktionen observeres indenfor 2-15 minutter. Tabel 8: Skema over farvereaktionerne for Cica-Beta-Test. Identifikation Reaktion i Reaktion i Reaktion i CBT-1 CBT-ESβL CBT-AmpC Klassiske β-laktamaser * ESβL AmpC * udføres ikke, fordi flowchartet ikke fører hen til denne. Dog er CBT-1 og CBT-ESβL udført samtidigt. * Statistisk beregning Ud fra hver af de 4 metoder beregnes den diagnostiske sensitivitet samt den diagnostiske specificitet. Resultatvurdering I dette bachelorprojekt vil resultaterne blive vurderet ifølge Amblers klassifikationssystem. Her vil klasse A defineres som positiv ESβL producerende, mens klasse C, som indeholder AmpC enzymet, defineres som negativ. Resultatvurdering af ChromID ESβL agar og Brilliance ESβL Agar: SN - De ikke-esβl producerende bakterier, som ikke er vokset frem på pladen, vurderes som sandt negative. - De ikke-esβl producerende bakterier, som vokser frem, men ved supplerende test ifølge producentens forskrift, udelukkes som værende ESβL producerende, er derfor også sandt negative. Specielt for ChromID ESβL agar: - Ved fund af farveløse kolonier, der er oxidase positive, frikendes de som værende ESβL producerende og vurderes som sandt negative. 25 af 48

27 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier SP - ESβL producerende bakterier, som er vokset frem med farvede kolonier, der stemmer overens med producenternes protokol, vurderes som sandt positive. Specielt for ChromID ESβL agar: - Ved fund af farveløse kolonier, der er oxidase negative, hvor der er tilstedeværelse af en ESβL produktion, vurderes disse som sandt positive. Specielt for Brilliance ESβL Agar: - Visse ESβL producerende E. coli er vokset frem med grønne kolonier. Disse vurderes dog alligevel som sandt positive, da de trods forkert farve har indikeret en ESβL produktion FP - Falsk positive resultater er de bakterier, der ikke er ESβL producerende, men som alligevel er vokset frem på pladen. FN - Falsk negative resultater er de ESβL producerende bakterier, som ikke er vokset frem på pladen. Resultatvurdering af VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort: SP - Sandt positive er de bakteriestammer, der har en ESβL produktion, og som er fundet positive af VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort. SN - Sandt negative er de bakteriestammer, der ikke har en ESβL produktion, og som er fundet negativ af VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort. FP - Bakterier, som ikke er ESβL producerende, men som er fundet positive ved VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort, benævnes falsk positive. FN - I dette forsøg forekommer der ingen falsk negative resultater. Resultatvurdering for Cica-Beta-Test (CBT-1+CBT-ESβL): SP - En farvereaktion, hvor henholdsvis CBT-1 og CBT-ESβL er rød og gul, ved tilstedeværelse af en ESβL producerende bakterie, vurderes som sandt positiv. SN - En farvereaktion, hvor henholdsvis CBT-1 og CBT-ESβL er rød og rød, ved tilstedeværelse af en ikke-esβl producerende bakterie, vurderes som sandt negativt. 26 af 48

28 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier - De stammer hvor der ikke ses en ESβL produktion og hvor både CBT-1 og CBT-ESβL forbliver gul, vurderes disse som sandt negative. FP - Falsk positive resultater er de ikke-esβl producerende bakterier, som har givet en reaktion af rød og gul i henholdsvis CBT-1 og CBT-ESβL. FN - Falsk negative resultater er de ESβL producerende bakterier som er faldet negativt ud i CBT-1 og CBT-ESβL ved en farve reaktion af gul i begge. - Ved en rød farvereaktion i både CBT-1 og CBT-ESβL, hvor der er en ESβL producerende bakterie tilstede, vurderes disse som falsk negative. Resultater Tabel 9 viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet for screeningsmetoderne samt de konfirmatoriske test. ChromID ESβL agar har en sensitivitet på 85,0 % samt en specificitet på 75,0 %, mens Brilliance ESβL Agar har en sensitivitet på 87 % samt en specificitet på 67,5 %. VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort har en sensitivitet på 100 % samt en specificitet på 11,4 % og Cica-Beta-Test har en sensitivitet på 83 % samt en specificitet på 92,5 %. Resultaternes rådata ses i bilag 5, 6 og 7. Udregningerne set i tabel 9 nedenfor, mens rådata for disse findes i bilag 9. Tabel 9: Metodernes diagnostiske sensitivitet og specificitet. ESβL Screening Konfirmatorisk ESβL test Diagnostisk sensitivitet Diagnostisk specificitet ChromID ESβL agar (24 og 48 timer) Brilliance ESβL Agar (24 og 48 timer) VITEK 2 AST- GN27 ESβL kort Cica-Beta-Test (CBT-1+CBT- ESβL) 85,0 % 87,0 % 100 % 83,0 % 75,0 % 67,5 % 11,4 % 92,5 % 27 af 48

29 Christina Mejdahl Nielsen Diskussion Screeningsmetoderne Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier I det følgende afsnit vil chrompladerne hver især blive kommenteret og til slut gives en samlede opsummering. Hver gang der nævnes eller kommenteres et resultat ved enten ChromID ESβL agar eller Brilliance ESβL Agar henvises til bilag 5. For begge screeningsmetoder ses alle falsk positive resultater i bilag 11 og alle falsk negative resultater i bilag 12. ChromID ESβL agar fra biomérieux Ud af de 100 ESβL producerende bakterier identificerede ChromID ESβL agar 85 rigtigt, og det gav chrompladen en diagnostisk sensitivitet på 85,0 %. ChromID ESβL agar identificerede tilmed 30 ud af 40 negative stammer korrekt, hvilket gav den en diagnostiske specificitet på 75,0 %. Réglier-Poupet H. et al. (2008) fandt en diagnostisk sensitivitet til 88 % og 94 %, mens den diagnostiske specificitet var 94,5 % og 90,5 %, og begge var for henholdsvis 24 og 48 timers inkubering. Dette studie viste, at inkuberingstiden kunne gøre en forskel på detektionsfølsomheden. I vores studie havde vi den samme detektionsfølsomhed efter 24 og 48 timer. Sensitiviteten, for vores forsøg i forhold til deres, er nogenlunde den samme, hvis der ses på resultaterne efter 24 timer, men specificiteten for Réglier-Poupet H. et al. er næsten 20 % højere end vores forsøg, og det er en stor forskel. I Réglier-Poupet H. et al. studiet undersøgte de 765 prøver bestående af fæces prøver, urinprøver og lungevæsker, og alle disse var molekylærbiologisktestet 22. De fandt, at stammer var positive for ESβL produktion, mens 733 stammer var negative. De vortex et materialet ned i 1 ml 0,9 % NaCl, men de målte ikke en McFarland værdi på opløsningerne. Herefter tog de 100µl fra bakteriesuspensionen og tilsat på ChromID ESβL agar, dog blev urinprøverne direkte tilsat pladen med 50µl [9]. Grunden til, at Réglier-Poupet H. et al. (2008) studiet havde fået en højere specificitet, kunne være, fordi deres negative population var større end vores, og at deres population var taget fra en repræsentativ gruppe. Udover antallet af prøver, så tilføjede de µl materiale på medierne, hvor vi tilføjede 1µl McFarland opløsning på cirka 0,5 på en halv plade. 22 Bestemt med Polymerase chain-reaction (PCR) med targets af: bla TEM, bla SHV, bla CTX-M, bla GES, bla PER, bla BEL- 1, bla VEB, bla TLA-1, bla TLA-2, bla BES og bla OXA I et af isolaterne blev der fundet 2 forskellige ESβL producerende bakterier. 28 af 48

30 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Lignende studie blev udført af Glupczynski Y. et al. (2007). Ud fra 644 prøver blev 37 af disse fundet som værende ESβL producerende Enterobacteriaceae ved molekylærbiologisktestning 24. De tilføjede 50µl bakteriesuspension til hver ChromID ESβL plade. Ud af de ESβL producerende stammer havde ChromID ESβL agar en diagnostisk sensitivitet på 97,7 %. Den diagnostiske specificitet blev vurderet ud fra 607 ikke-esβl producerende bakterier og var for ChromID ESβL agar 89 % [5]. Studiet havde både en højere sensitivitet og specificitet end vores forsøg, og det kan skyldes samme grunde som ved Réglier-Poupet H. et al. studiet. I følgende afsnit vil de falske resultaterne, vi fik i projektet, blive omtalt (se både bilag 5, 11 og 12): De falsk negative resultater for ChromID ESβL agar var 15 stammer 25. Årsagerne til, at bakterierne ikke voksede frem på mediet, er svært at vurdere, men det kan være bakterierne havde genet, men at ekspressionen var så lav, at de ikke voksede frem. Ved de 15 falsk negative stammer kunne mere prøvemateriale måske få nogle af dem til at vokse frem. Yderligere kunne plasmidet, hvor genet sidder på, være mistet, selvom vi gjorde, hvad vi kunne for at det ikke skulle gå til grunde 26. Hertil mener jeg, at vi sørgede for, at fryseampullerne ikke tøede op, og tilmed prøvede vi at undgå omsåninger. Det kunne også være, at koncentrationen af cefpodoxim i pladen er for høj, så de ESβL producerende bakterier ikke har fået lov til at vokse frem. Dernæst skal nævnes de stammer, som hørte til den negative population, men alligevel voksede frem på mediet. Afhængigt af resultatet ved af oxidasetesten blev disse stammer enten vurderet til sandt negative eller falsk positive. 6 stammer 27 vokset frem med farveløsekolonier (se billeder i bilag 14). På disse stammer blev der udført en oxidasetest; 4 stammer 28 var oxidase negative og blev vurderet til falsk positive, mens 2 stammer 29 var oxidase positive og blev vurderet til sandt negative (se BioMérieuxs begrænsningsafsnit bilag 17). 24 Bestemt med isoelectric focusing og PCR med targets af bla TEM, bla SHV, bla CTX-M, bla OXA og bla ampc. 25 Se bilag 12: Stamme nr. 39, 48, 49, 51, 66, 69, 72, 73, 81, 98, 99, 125, 126, 127 og Kilde: Charlotte Birk Olsen, Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Næstved Sygehus. 27 Se bilag 5: Stamme nr. 4, 5, 9, 15, 136 og Se bilag 11: Stamme nr. 4, 5, 9, Se bilag 5: Stamme nr. 136 og af 48

31 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier På ChromID ESβL agar voksede 7 30 ud af 20 AmpC producerende stammer frem: Hafnia alvei, M. morganii og Salmonella bareilly (S. bareilly) voksede frem med farveløse kolonier (omtalt forrige afsnit), C. freundii og E. coli voksede frem med bordeaux kolonier, og Enterobacter sp. og K. oxytoca voksede frem med grønne kolonier. Disse blev vurderet til falsk positiv. Réglier-Poupet H. et al. (2008) og Glupczynski Y. et al. (2007) fandt i deres studie også, at E. coli, Enterobacter species, Hafnia alvei, K. oxytoga og Citrobacter spp. kunne give falsk positive resultater [5, 9]. Deres fund stemmer meget godt overens med vores, så måske er AmpC produktionen ikke årsagen til, at de voksede frem. Ifølge begrænsningerne for ChromID ESβL agar (se bilag 17) advarer firmaet også om, at andre multiresistente bakterier end ESβL producerende Enterobacteriaceae kan vokse, hvilket bekræfter vores resultat. Så grunden til, at de er i stand til at vokse på mediet, kunne også være, fordi AmpC producerende bakterier oftest også er resistente overfor cefpodoxim [10]. De 7 omtalte stammer er i vores forsøg også resistente overfor cefpodoxim (se bilag 5). Brilliance ESβL Agar fra Oxoid Ud af de 100 ESβL producerende bakterier identificerede Brilliance ESβL Agar 87 rigtigt, og det gav chrompladen en diagnostisk sensitivitet på 87,0 %. Brilliance ESβL Agar identificerede tilmed 27 ud af 40 negative stammer korrekt, hvilket gav den en diagnostiske specificitet på 67,5 %. Publiceret materiale om Brilliance ESβL Agar er mangelfuld, da pladen først lige er blevet lanceret. Dog er der lige blevet publiceret to posters, som vi har fået tilsendt lidt af Søren Mattern Søes, teknisk repræsentant fra Oxoid. Brown A. et al. (2009) er Oxoids eget studie, hvor de sammenligner Brilliance ESβL Agar og ChromID ESβL agar. I studiet havde de 80 rene kulturer bestående af 23 ESβL producerende bakterier 31, 13 kromosomale AmpC 32 og 44 andre ikke-esβl producerende bakterier 33. Deres studie minder meget om vores. De fremstillede også en bakteriesuspension med en McFarland på cirka 0,5. Dog tilføjede de 10µl suspension på hver plade. Brown A. et al. (2009) fandt, at Brilliance ESβL Agar havde en diagnostisk sensitivitet på 95,7 %, mens 30 Se bilag 5: Stamme nr. 1, 2, 3, 4, 5, 7 og E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae og P. aeruginosa med CTX-M, TEM, SHV eller PER. 32 E. coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., Serratia marcescens, Acinetobacter baumanii og P. aeruginosa i forskellige varianter. 33 Både Gram-negative og Gram-positive. 30 af 48

32 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier ChromID ESβL agar havde en på 91,3 %. Den diagnostiske specificitet for Brilliance ESβL Agar var 93,0 % og for ChromID ESβL agar var 91,2 % [24]. Det ses, at begge plader fik højere diagnostiske specificitet og sensitivitet end vi fik i vores forsøg. Derudover har Malhotra-Kumar S. et al. (2009) lavet et studie for MOSAR, hvor de testede 5 forskellige plader blandt andet Brilliance ESβL Agar. De havde 84 molekylærbiologisktestede stammer, som blev sået ud på de 5 medier. Malhotra-Kumar S. et al. (2009) havde to resultater til diagnostisk sensitivitet og specificitet; Den ene var baseret på fund af ESβL producerende Enterobacteriaceae, hvor de fandt en diagnostisk sensitivitet på 99,4 % og 99,6 %, mens den diagnostiske specificitet var 99,2 % og 98,7 % efter henholdsvis 24 og 48 timer. Den anden var baseret på fund af ESβL producerende Enterobacteriaceae, og at det var den rigtige farve, der voksede frem på mediet og her fandt de en diagnostisk sensitivitet på 82,2 % og 86,9 %, mens den diagnostiske specificitet var 98,1 % og 97,1 % efter henholdsvis 24 og 48 timer [21]. I vores projekt er resultaterne baseret på den første af ovenstående 34. Ud af den sandt positive population var der 5 ESβL producerende E. coli stammer 35, der voksede frem på Brilliance ESβL Agar mediet med grønne kolonier i stedet for blå. Som jeg beskrev i teorien, så giver K. pneumoniae grønne farvede kolonier, fordi disse bakterier producerer galaktosidase og visse E. coli producerer både glukuronidase og galaktosidase og vokser frem med blå kolonier. Jeg tror, at den grønne farve skyldes, at det glukuronidase E. coli stammerne indeholdt ikke var kommet til udtryk. Det ses, at de i studiet hos Malhotra-Kumar S. et al. (2009) fik en sensitivitet og specificitet tæt på 100 %. Ved en perfekt metode vil både sensitiviteten og specificiteten være på 100 %, fordi der herved hverken har været falsk positive eller falsk negative resultater. Af den sandt positive population skal også nævnes 21 andre stammer: 11 ESβL producerende E. coli stammer 36 voksede frem med blå kolonier med pink omkring, og 10 ESβL producerende E. coli stammer 37 voksede frem med blå kolonier med grønt omkring (se billeder i bilag 14). På alle blå kolonier skulle der have været udført en indoltest, for at bekræfte identifikationen af E. coli, men dette er ikke gjort på andet end på stamme nr. 1, men dette har ingen betydning for resultaterne (se bilag 5). 34 Fund af ESβL producerende Enterobacteriaceae - uden at tage højde for om farven der voksede frem var rigtig. 35 Se bilag 5: Stamme nr. 46, 51, 64, 95 og Se bilag 3 og 5: Stamme nr. 20, 26, 28, 33, 35, 42, 77, 78, 93, 133 og Se bilag 3 og 5: Stamme nr. 24, 27, 29, 30, 34, 61, 76, 79, 80 og af 48

33 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier I følgende afsnit vil de falske resultaterne, vi fik i projektet, blive omtalt (se både bilag 5, 11 og 12): De falsk negative resultater fundet på Brilliance ESβL Agar var Årsagerne til, at de ESβL producerende ikke voksede frem, var ligesom på ChromID ESβL pladen: For lidt prøvemateriale, lav ekspression af bakterien, at plasmidet var mistet eller at cefpodoxim koncetrationen i pladen var for høj (se uddybning s. 29). Nogle stammer 39 fra vores negative population voksede frem på Brilliance ESβL pladen. 3 P. aeruginosa voksede frem med brune kolonier, 1 P. aeruginosa og 1 Pseudomonas sp. voksede frem med farveløse kolonier (se billeder i bilag 14). Da der ikke var nogle supplerende test, som kunne frikende disse blev disse vurderet til falsk positive. Ifølge Oxoid kan Pseudomonas også godt vokse frem på mediet (se bilag 10). Ud af de 20 AmpC positive stammer voksede 5 stammer AmpC producerende bakterier, der voksede frem, må være resistente overfor cefpodoxim og derved er i stand til at vokse selv ved tilstedeværelsen af cefpodoxim. Ifølge producentens forskrift [22] vil væksten af AmpC blive undertrykt/stoppet (engelsk ord: suppress ) på pladen. Ifølge Søren Mattern Søes, teknisk repræsentant fra Oxoid (se bilag 10), har dette været en prioritering fra deres side. Udover AmpC producerende bakterier, der voksede klart frem, så var der 1 stamme 41, hvor agaren blev misfarvet, men denne er vurderet til sandt negativ (se bilag 10). 40 frem og er derfor falsk positive. De Der er yderligere 3 stammer 42, som gav falsk positive resultater heraf 1 C. freundii, 1 K. pneumoniae og 1 E. coli og en mulig forklaring på, at de voksede frem kan være, at selvom de var negative for ESβL produktion, så var alle 3 stammer resistente overfor cefpodoxim Se bilag 12: Stamme nr. 48, 49, 66, 69, 72, 73, 81, 98, 99, 125, 126, 127 og Se bilag 11: Stamme nr. 128, 136, 138, 139 og Se bilag 11: Stamme nr. 1, 2, 5, 7 og Se bilag 5: Stamme nr Se bilag 11: Stamme nr. 15, 23 og Alle 3 stammer er målt til 6 mm ved cefpodoxim. 32 af 48

34 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Samlede diskussion af ChromID ESβL agar og Brilliance ESβL Agar. Brilliance ESβL Agar fandt to mere ESβL producerende bakterier end ChromID ESβL agar, hvilket vil sige, at Brilliance ESβL Agar diagnostiske sensitivitet er 2 % højere. Ved resultaterne af de falsk negative var der 13 ESβL producerende bakterier, som ikke voksede på nogle af de to kromogene medier; Heraf 10 E. coli og 3 K. pneumoniae (se bilag 12). Under afsnittet for både ChromID ESβL agar og Brilliance ESβL Agar er jeg kommet med bud på hvad, der kunne være årsagerne til, at bakterierne ikke voksede frem hertil bl.a. for lidt prøvemateriale. I studiet Malhotra-Kumar S. et al. (2009) testede de 21 tilfældige stammer 44 heraf 16 ESβL producerende Enterobacteriaceae og 5 ikke-esβl producerende bakterier. Disse 21 stammer blev testet på fire forskellige måder: Bakterierne blev tilsat direkte på pladerne, og bakterierne blev testet med 3 forskellige koncentrationer blandet i fæces [21]. De nævner ikke noget om, hvilke resultater de fik. Det kunne have været relevant i forhold til vores projekt, da vi har været i tvivl om, vi havde tilsat nok inolukum. Yderligere kunne det være interessant, hvis de falsk negative stammer kom fra samme sted, da det kunne være den samme klon, der var årsagen. Det ses ud fra bilag 3, at 2 stammer var fra Herning, 4 stammer var fra Nykøbing Falster Sygehus og de sidste 7 stammer var fra Hvidovre Hospital 45. Det kunne godt ske, at stammerne fra Nykøbing Falster Sygehus og fra Hvidovre Hospital havde hver deres klon, som huserede. Nykøbing Falster Sygehus har, som nævnt i introduktionen, et aktuelt udbrud, hvor differencen med og uden clavulansyre er på 3-4 mm, og er det nogle af de kloner, vi har fået, forklarer det, at de ikke voksede. Det er bemærkelsesværdigt at 4 ud af de 5 kolonier voksede frem på Brilliance ESβL Agar med forkert grøn i stedet for blå, voksede frem på ChromID ESβL agar med farveløse kolonier (se bilag 5). Der var 2 stammer 46, som voksede frem på Brilliance ESβL Agar, men som ikke voksede frem på ChromID ESβL agar. Ved disse 2 stammer mener jeg, at det skyldtes en lav ekspression. De 2 stammer voksede frem på Brilliance ESβL pladen med vækstgrad ++ 47, tilfældige stammer fra populationen på Se bilag 3: Stamme nr. 72 og 73 fra Herning. Stamme nr. 48, 49, 66, 69, 81, 98 og 99 fra Hvidovre Hospital og stamme nr. 125, 126, 127 og 130 fra Nykøbing Falster Sygehus. 46 Se bilag 5: Stamme nr. 39 og Vækst i 1. strøg. 33 af 48

35 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier så det er muligt, at de 2 stammer kunne være vokset frem, hvis der var blevet tilført mere prøvemateriale (se bilag 5). På ChromID ESβL agar var der 7 AmpC producerende bakterier, der voksede frem, mens der på Brilliance ESβL Agar var 5 stammer. Jeg synes det ville være godt, hvis screeningspladen også kunne detektere AmpC producerende bakterier, da behandlingsmulighederne for disse bakterier også er begrænset og også er et stigende problem [13]. Vi havde 2 E. coli stammer 48, som var ESβL og AmpC producerende. Hverken ChromID ESβL agar eller Brilliance ESβL Agar detekterede nogle af disse, og set ud fra oversigten af falsk negative resultater blev de heller ikke detekteret i Cica-Beta-Test (se bilag 12). Begge stammer var resistente overfor cefpodoxim (6 mm), så jeg tror, at tilstedeværelsen af AmpC undertrykte væksten af den ESβL producerende bakterier ellers har de begge haft meget lav ekspression. Hverken ChromID ESβL agar, Brilliance ESβL Agar eller Cica-Beta-Test advarer om, at der ved sådanne tilfælde kan ske en maskering, så bakterien ikke detekteres. Det gør VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort derimod (se bilag 15). Ifølge producenterne skulle pladerne selektere væksten af ESβL produktion, og det ses ud fra vores resultater, at dette ikke helt stemmer overens. Set ud fra resultaterne og pladernes diagnostiske sensitivitet og specificitet kan ChromID ESβL agar og Brilliance ESβL Agar det samme. Brilliance ESβL Agar (87,0 %) havde en lidt højere diagnostiske sensitivitet end ChromID ESβL agar (85,0 %), mens ChromID ESβL agars (70,0 %) diagnostiske specificitet var højere end Brilliance ESβL Agar (67,5 %). Detektionstiden for pladerne er den samme, og der er i vores forsøg ingen forskel på den diagnostiske sensitivitet og specificitet i forhold til om pladerne var inkuberet i 24 eller 48 timer. Tages økonomien med i vurderingen af de to plader, er Brilliance ESβL pladen den billigste og koster 7,5 kr./stk., mens ChromID ESβL agar koster 8,8 kr./stk. 49. Til trods for en forholdsvis lille prisforskel kan det have stor betydning i sidste ende, for implementeres en af pladerne på KMA, Næstved Sygehus, bliver antallet af brugte plader højt. 48 Se bilag 12: Stamme nr. 72 og stk. koster 176 kr. 34 af 48

36 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Så ud fra ovenstående facts vil jeg foreslå, at Næstved Sygehus anvender Brilliance ESβL Agar, da denne har vist højest diagnostisk sensitivitet og koster mindst. Jeg synes ikke den nuværende screeningsmetode skal erstattes, men det ville være en fordel at implementere screeningspladen som supplement i detektionen. Her kan der også være mulighed for at finde patienter med bærertilstande. Tages screeningspladen i brug, mener jeg, den skulle anvendes som Tellur og PGUA-pladen i dag anvendes på KMA, Næstved Sygehus, hvor 1 plade anvendes til 8 forskellige prøver. I chrompladens tilfælde skulle der måske anvendes 1 plade til 4 forskellige prøver. Dog står der ChromID ESβL agars forskrift, at der kun må bruges én prøve pr. plade (se bilag 17). Screeningsmetoderne ved den nye nomenklatur Jeg synes, at den nye nomenklatur, som Giske et al. (2009) [29] foreslår, skal indføres. Jeg mener, at den vil være med til at øge forståelsen blandt andre sundhedsfaggrupper. Det skal medføre, at sundhedspersonalet bliver beviste om, at alle betalaktamaserne er et stigende problem og opmærksomme på, at interventioner er nødvendige, for at få nedbragt dødeligheden og prævalensen. Ses vores bakteriepopulation af ESβL producerende bakterier i forhold til den nye nomenklatur vil bakteriepopulationen bestå af 120 stammer, da de AmpC producerende (ESβL M-C ) vil være den del af denne. Hertil ville vores diagnostiske sensitivitet og specificitet blive ændret lidt. Hos ChromID ESβL agar ville den diagnostiske sensitivitet være 76,7 %, da der ville være 92 sandt positive og 28 falsk negative, og den diagnostiske specificitet ville være 85 %, da der ville være 17 sandt negative og 3 falsk positive. Hos Brilliance ESβL Agar ville den diagnostiske sensitivitet være den samme som ChromID ESβL agar på 76,7 %, for her er også 92 sandt positive og 28 falsk negative, og den diagnostiske specificitet ville være 60,0 %, da der ville være 12 sandt negative og 8 falsk positive. Udregningen er baseret på, at de AmpC producerende bakterier, der er voksede frem er ifølge den nye nomenklatur sandt positive i stedet for før, hvor de var falsk positive. De AmpC producerende bakterier, der ikke voksede frem er ifølge den nye nomenklatur falsk negative, hvor de før var sandt negative. Det ses, at firmaerne (Oxoid og biomérieux) burde lave nogle justeringer i pladerne, hvis den nye forståelse tages i brug, da de AmpC producerende bakterier skal kunne vokse frem på mediet. 35 af 48

37 Christina Mejdahl Nielsen De konfirmatoriske tests Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier I det følgende afsnit vil de to konfirmatoriske tests hver især blive kommenteret. Disse vil blive vurderet hver for sig. Til diskussionen for Cica-Beta-Test henvises til rådata i bilag 6, mens der til diskussionen for VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort henvises til rådata i bilag 7. For begge to konfirmatoriske tests ses alle falsk positive resultater i bilag 11 og alle falsk negative resultater i bilag 12. Cica-Beta-Test fra Mast Group Cica-Beta-Testens diagnostisk sensitivitet og specificitet er regnet ud fra CBT-1+CBT-ESβL. Ud af de 100 ESβL producerende bakterier identificerede Cica-Beta-Test 83 rigtigt, og det gav metoden en diagnostisk sensitivitet på 83,0 %. Metoden identificerede tilmed 37 ud af 40 negative stammer korrekt, hvilket gav en diagnostiske specificitet på 92,5 %. Vi har i vores projekt kun valgt at tage højde for detektionen af ESβL, som er en rød farvereaktion i CBT-1 og en gul farvereaktion i CBT-ESβL. Det vil sige, at der ses kritisk på udregningen af den diagnostiske sensitivitet, da der er forekommet flere tilfælde af falske resultater. Det skyldes, at de ESβL producerende bakterier, der gav en rød reaktion i både CBT-1 og CBT-ESβL, blev vurderet til falsk negative for ESβL produktion. Vurderingen i denne sammenhæng var ikke helt optimal, da en rød-rød reaktion i CBT-1 og CBT-ESβL kan indikere, at der enten er en AmpC, MβL eller multiple β-laktamaser, men før vi overhovedet ville kunne sige noget om disse, skulle alle stammer være molekylærbiologisktestet for både ESβL, AmpC og MβL. Dette skulle gøres, for at kunne gruppere resultaterne helt rigtigt. Ydermere skulle alle fire teststrips 50 være udført, som der står i producentens forskrift [19]. Cica-Beta-Test har en ulempe i, at bakteriematerialet, der skal gnides på teststrips, ikke må tages fra en selektiv plade, hvilket vil sige, at kolonien ikke kan tages direkte fra ChromID ESβL agar eller Brilliance ESβL Agar. Jeg tror grunden til, at en selektiv plade ikke kan anvendes, er, fordi de kromogene substrater gør, at kolonierne får en farve. Hertil kunne der opstå tvivl om farvereaktionen på teststrippen opstod, fordi der var en ESβL, AmpC eller MβL produktion eller fordi kolonien, der blev tilsat var eksempelvis bordeauxfarvede. Eftersom det ikke er muligt at tage bakteriemateriale fra en selektiv plade, ville det skulle 50 CBT-1, CBT- ESβL, CBT-AmpC og CBT-MβL 36 af 48

38 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier tages fra den primære iso-sensitest plade uden blod, og det kunne godt give et problem, hvis bakterien kun voksede med sparsom vækst. Livermore D. et al (2007) evaluerede Cica-Beta-Test. I dette studie beskæftigede de sig kun med positive stammer, hvortil både ESβL, MβL, AmpC og multiple betalaktamaser var repræsenteret, og da forsøget skulle udføres var de blindet for de rigtige resultater. ESβL havde en sensitivitet på 85,1 %, hertil fandt Cica-Beta-Test 63 ud af 74 ESβL producerende bakterier, hvortil CTX-M, TEM, SHV, VEB og PER var repræsenteret. Af de resterende 11 var 3 misledt til at have en MβL produktion, 2 var misledt til at have AmpC og de sidste 6 var misledt til at have multiple betalaktamaser [11]. Livermore D. et al (2007) studiet viser fremgangsmåden for, hvordan jeg mener, et forsøg med Cica-Beta-Test skulle bygges op. Deres forsøg mangler dog en negativ population, så der også kunne blive bestemt en diagnostisk specificitet. Colodner R. et al. (2006) testede også Cica-Beta-Test. De havde 304 stammer af Klebsiella species, E. coli og P. mirabilis. De fandt stammerne ved fænotypisk konfirmatorisk disk test og 199 viste sig at være ESβL producerende. Da denne undersøgelse var baseret på konventionel laboratoriemetode modsat vores forsøg, hvor størstedelen er molekylærbiologisktestet, har de måske ikke fundet alle de ESβL producerende bakterier. I denne artikel testede de kun CBT-1, hvilket gør at mulighederne for AmpC, MβL og multiple β-laktamaser udelukkes, og tilmed var forsøget ikke udført blindet for de rigtige resultater [12]. Colodner R. et al. (2006) fik en diagnostisk sensitivitet på 95,5 % og en diagnostisk specificitet på 98,1 %, hvilket er en del højere end os, men samtidigt mener jeg ikke, at der kun kan bruges én teststrip, og som vores projekt viser, er det heller ikke nok med to teststrips. Dette synspunkt er Livermore D. et al (2007) også enig i, da de også kritiserer Colodner R. et al. (2006) studiet. I følgende afsnit vil de falske resultaterne, vi fik i projektet, blive omtalt (se både bilag 6, 11 og 12): I vores projekt blev af de ESβL producerende bakterier vurderet til falsk negative, hertil var 13 E. coli og 4 K. pneumoniae af disse stammer af disse gav en rød-rød reaktion i 51 Se bilag 12: Stamme nr. 35, 39, 48, 49, 51, 66, 69, 72, 73, 81, 96, 98, 99, 125, 126, 127 og af 48

39 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier CBT-1 og CBT-ESβL, som tidligere omtalt. De resterende 14 stammer 53 gav en gul reaktion i både CBT-1 og CBT-ESβL. Det mener jeg kan skyldes at: 1) ESβL ekspressionen var for lav, 2) at plasmidet var mistet eller 3) at reaktionen har været for svag til at kunne ses. I studiet Livermore D. et al (2007) foreslås forbedringer til Cica-Beta-Test; At tilføre mere bakteriemateriale til teststrips eller at øge koncentrationen på HMRZ Jeg mener, at forbedringen skulle være at øge koncentrationen på HMRZ-86, da vi tilførte teststrippen en del materiale 55. I den sandt negative population skal nævnes de 7 AmpC producerende stammer rigtig reaktion i henholdsvis CBT-1 og CBT-ESβL ved at blive rød-rød. Der var 3 falsk positive resultater 57, heraf 2 E. coli og 1 M. morganii. Alle 3 indeholdt en 56, som gav AmpC produktion og reaktionen skulle da have været rød i CBT-1 og rød i CBT- ESβL. Det kan være, at farveskiftet fra gul til rød i CBT-ESβL var for svagt. Cica-Beta-Test er ikke anbefalet af firmaet som konfirmatorisk test, men som screeningsmetode [13, 19]. Set ud fra vores resultater for den diagnostiske specificitet (92,5 %) kunne metoden godt bruges til konfirmatorisk test eller i hvert fald som en terapeutisk guideline, da Cica-Beta-Test giver kliniske relevante informationer 24 timer tidligere end før. Cica-Beta-Test har også fordel i, at metoden ikke begrænser sig til, hvilke bakterier, den kan detektere, en ESβL, AmpC, MβL eller multiple β-laktamase produktion på. Detektionstiden for Cica-Beta-Test er kun 2-15 minutter, hvilket er godt, da det er vigtigt, hvis patienten hurtigt skal sættes i relevant behandling. Dette vil nedsætte patientens dødelighed, som er formålet med vores projekt. Den korte detektionstid var grundlaget for at KMA, Næstved Sygehus, gerne ville have testet metoden, hvilket jeg godt kan se relevansen i. Cica-Beta-Test er en dyr metode at udføre: Omkostningerne af én prøve, hvor alle fire testsstrips blev anvendt, koster 167,5 kr. 58. Metoden er måske ikke så dyr alligevel, hvis der ses på omkostningerne i en større sammenhæng. Cica-Beta-Test kunne måske forhindre nogle isolationer på intensiv afdeling. Når en patient skal i isolation sker der mange skærpelser: Patienten skal ligge på enestue, håndhygiejnen skal øges betydeligt og sundhedspersonalet/pårørende skal iføre sig ekstraudstyr ved kontakt med patienten. Tilmed 52 Se bilag 12: Stamme nr. 35, 51 og Se bilag 12: Stamme nr. 39, 48, 49, 66, 72, 73, 81, 96, 98, 99, 125, 126, 127 og CBT-substratet. 55 En produktspecialist fra Mast Group holdt foredrag om Cica-Beta-Test på Næstved Sygehus og her fortalte hun, at der bare skulle tages et bredt skrab langs cefpodoxim hæmningszone. 56 Se bilag 6: 1, 2, 3, 4, 9, 10 og Se bilag 11: Stamme nr. 5, 11, og kit med 40 stk.: CBT-1 = 1675 kr., CBT-ESβL = 1675 kr., CBT-AmpC =1675 kr. og CBT-MβL = 1675 kr. 38 af 48

40 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier skal der passes på med brug af fremmedlegemer, da disse kan fremme væksten af den ESβL producerende bakterier, og der skal ske rapportering af tilfældet ved overflytning [16]. Ses der på omkostninger af dette, så er Cica-Beta-Test ikke dyr. VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort fra biomérieux På VITEK 2 Compact analyserede vi VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort. For rådata over resultaterne se bilag 7 og eksempel på svar printet ud fra VITEK 2 Compact se bilag 2. Ud af 134 stammer fandt vi den diagnostiske sensitivitet for vores undersøgelse til 100 %, idet vi fandt alle de ESβL producerende bakterier. Derimod fik vi en diagnostisk specificitet på 11,4 %, da 31 ud af 35 stammer fra den negative population også blev fundet positive for ESβL produktion. Derudover var 4 stammer 59 sandt negative, mens 6 stammer 60 var inconsistent 61, hvilket betyder, at AES findings ikke fandt en match eller at opslemningen ikke var renkultur, og derved skulle køres om. På grund af vores budget kunne vi ikke bestille flere kort til omkørsel, og stammerne blev derfor taget ud af forsøget og er ikke regnet med i den diagnostiske sensitivitet og specificitet. Den høje diagnostiske sensitivitet og meget lave diagnostiske specificitet undrede os og tænkte, at noget var gået galt. Hertil fandt vi ud af, at der manglede at blive udført et fortyndingstrin. Efter vi havde opslemmet bakteriemateriale i NaCl og lavet en McFarland på 0,5-0,63 (se bilag 16), skulle der have være foretaget endnu en fortynding. Hertil skulle overføres 145µl af bakteriesuspensionen til et andet reagensglas, som indeholdt 3 ml 0,45 % NaCl. Dette trin blev ikke udført, hvilket resulterede i en alt for høj koncentration 62. For meget bakteriemateriale er den mest sandsynlige grund til, at stort set alt blev positivt. Hver enkel bakterie voksede frem og virkede resistent på trods af, at brønden måske indeholdt et antibiotikum, som bakterien var følsom overfor. 59 Bilag 7: Stamme nr. 3, 6, 21 og Bilag 7: Stamme nr. 10, 14, 25, 128, 129 og I VITEK 2 Compact computersystemet stod følgende: Observed results do not match any phenotype in the AES knowlegde base. Verify organism identification and check isolate purity. Restest if deemed necessery. 62 Hver brønd indeholdt over 21 gange mere end det der skulle have været i (3145µl/145µl). 39 af 48

41 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier På grund af budget og mangel på tid kunne vi ikke lave forsøget om. Vi kan konstatere, at selvom VITEK 2 Compact er automatiseret, og apparatet herved har fordel i, at menneskelige fejl minimeres, så fjernes fejlene ikke. Vi lavede en fejl. Det er derfor meget vigtigt, at læse manualen ordentligt igennem og få en ordentlig instruktion af et apparat, når det er første gang, der skal arbejdes med det. Ud fra vores undersøgelse vil vi ikke kunne drage nogen konklusion, af hvordan VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort fungerede, da sensitiviteten og specificiteten ikke er valid eller pålidelig. På grund af fejlen har vi valgt at indhente resultater fra et andet bachelorprojekt på Hvidovre Hospital. De har ligeledes testet VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort og har undersøgt mange af de samme stammer som i dette forsøg. Da bachelorprojektgruppens resultater ikke er blevet publiceret, endnu findes disse i bilag 8. Forsøget er udført på VITEK 2 og fungerer lidt anderledes ved, at apparatet selv sørger for at fortynde bakteriesuspensionen, men analyseprincippet er det samme. Deres forsøg er udført korrekt og er derfor validt. I deres studie havde de en positiv population bestående af 70 ESβL producerende bakterier heriblandt 29 E. coli og 41 K. pneumoniae, og en negativ population bestående af 24 stammer, hvoraf 2 af disse var E. coli og de resterende 22 var K. pneumoniae. Yderligere havde de også 4 ATCC stammer med, hvor 2 var E. coli og 2 var ESβL producerende K. pneumoniae (se bilag 8). De fandt en diagnostisk sensitivitet på 81,9 % og en diagnostisk specificitet på 96,2 % (se udregning bilag 8). Metoden viser en høj diagnostisk specificitet, og det er godt. Den diagnostiske specificitet vægtes højest i forbindelse med den konfirmatoriske test, da metoden skal kunne udelukke de bakterier, som ikke er ESβL producerende, og Hvidovre Hospital fandt 25 sandt negative ud af 26 mulige. Der findes intet publiceret materiale for VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort, hvilket vil sige, at der ikke er nogle artikler at drage direkte paralleller til VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort med. I studiet Färber J. et al. (2008) tester de 3 forskellige VITEK kort heriblandt AST-N041, som ifølge Tina Alsing, produktspecialist fra biomérieux, er det kort AST-GN27 er opdateret fra. I dette studie blev 114 stammer testet, hvortil Etest blev brugt som standarden. Hertil viste 93 stammer sig til at være positive for ESβL produktion. Den positive population blev yderligere 40 af 48

42 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier testet på PCR for de hyppigst forekommende gener 63 og for kromosomal eller plasmidmedieret AmpC produktion. De resterende 21 stammer blev også molekylærbiologisktestet, da andre tests 64 ikke var enige i Etesten. Hertil fandt de, at 6 af disse 21 stammer var negative, 9 af stammerne var positive for AmpC produktion og de sidste 6 stammer indeholdt én eller flere ESβL gener [10]. De fandt en diagnostisk sensitivitet på 84,2 % og specificitet på 50 %, og ud fra deres forsøg ville metoden ikke kunne anvendes til detektion af ESβL producerende Enterobacteriaceae. Dertil ses det også, at den diagnostiske specificitet kun er regnet ud fra 15 negative stammer, hvoraf 9 af disse var AmpC positive, så det er måske grunden til at specificiteten er så lav. Spanu T. et al. (2006) tester kortet AST-N045. Det VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort og VITEK 2 AST-N045 har tilfælles er brønden med ESβL-testen. AST-045 kortet mangler de øvrige cefalosporiner, som AST-GN27 kortet indeholder. I Spanu T. et al. (2006) studiet tester de identifikationen af ESβL producerende Enterobacteriaceae. De molekylærbiologisktestede stammer for TEM, SHV, OXA, CTX-M og PER og AmpC og fandt 312 ESβL producerende bakterier 65. De fandt en diagnostisk sensitivitet på 98,1 % og specificitet på 99,7 % [13]. Det faktum, at Spanu T. et al. (2006) fik en højere diagnostisk sensitivitet og specificitet, kunne skyldes, at de testede på en langt større bakteriepopulation end ved vores forsøg og Hvidovre Hospital bachelorgruppes forsøg. I indlægssedlen for VITEK 2 AST-GN27 kort [21] advarer biomérieux om, at der kan ske en maskering af bakterier, der både er ESβL og AmpC producerende. I studiet omtaler de at detektionen af ESβL producerende bakterier, som indeholder flere betalaktamaser end denne, kan give problemer. Disse havde vi 2 stammer 66 af, men da vi manglede fortyndingstrinnet, blev også disse positive, så hertil kan jeg ikke drage nogen sammenligninger. Hvidovre Hospitals bachelorgruppe har ikke nogen stammer med flere betalaktamaser i samme stamme. Detektionstiden for VITEK 2 Compact er 6-13 timer, så detektionstiden er kortere end den nuværende konfirmatoriske test, som tager 24 timer. Metoden kunne derved være rigtig god at få implementeres. Ifølge Helle Skov Morgenstjerne, produktspecialist fra biomérieux, kan 63 TEM, SHV, OXA og CTX-M 64 To automatiserede systemer og ChromID 65 Heraf stammerne: E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae, P mirabilis, Enterobacter aerogenes, K. oxytoca, C. freundii, Providencia stuartii, Serratia marcescens, M. morganii, Citrobacter koseri og Salmonella spp.. 66 Se bilag 7: Stamme nr. 72 og af 48

43 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier VITEK 2 AST-GN27 kortet godt anvende kolonier fra selektive plader, hvilket vil sige, at ChromID ESβL agar eller Brilliance ESβL Agar godt ville kunne bruges her. Ses der på økonomien koster et VITEK 2 AST-GN27 kortet 29,4 kr. 67, hvor den nuværende konfirmatoriske test koster omkring 20 kr. 68. Metoden koster noget mere end den gamle metode, men hvis VITEK 2 AST-GN27 kortet er med til hurtigere at finde en ESβL producerende bakterier og tilmed finder flere tilfælde, så er 10 kr. ikke så meget. Generelt for vores projekt Alle de resultater, vi har baseret vores diagnostiske sensitiviteter og specificiteter på, er ikke fra en repræsentativ gruppe af stammer. 125 ud af 140 stammer var resistente over for cefpodoxim. Vi har nøje udvalgt stammer, som havde udvidede resistensmekanismer, var AmpC producerende eller som, vi vidste, eventuelt kunne give problemer. Det bevirkede, at mange af bakterierne voksede frem på pladen, og derved gav et øget antal af falsk positive resultater. Det kan have påvirket den diagnostiske specificitet til at blive lavere. Havde vi valgt en repræsentativ gruppe, som der vil ses i den daglige detektion i laboratoriet, så havde resultaterne måske set anderledes ud og nok været højere. Konklusion Da Brilliance ESβL Agar fra Oxoid har den højeste diagnostisk sensitivitet med 87 % i forhold til ChromID ESβL agar fra biomérieux 85 %. Brilliance ESβL Agar diagnostiske specificitet var 67,5 %, mens ChromID ESβL agar var 75,0 %. Udover at Brilliance ESβL Agar har en højere diagnostiske sensitivitet koster Brilliance ESβL Agar også mindre end ChromID ESβL agar. Jeg foreslår, at KMA, Næstved Sygehus implementerer Brilliance ESβL Agar screeningspladen på laboratoriet. Den skal ikke ind og erstatte den nuværende screeningsmetode, men anvendes som supplement i detektionen af ESβL producerende bakterier. Cica-Beta-Testens diagnostiske sensitivitet er 83,0 %, mens den diagnostiske specificitet er 92,5 %. Metoden viser høj specificitet, og på grundlag af dette mener jeg, at Cica-Beta-Test kort koster 588kr. 68 Iso-sensitest koster ca. 10 kr. og de fire disk koster også ca. 10 kr. Kilde: Charlotte Birk Olsen, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Næstved Sygehus. 42 af 48

44 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier godt kan anvendes i laboratoriet. Den skal ikke erstatte den nuværende konfirmatoriske test, men Cica-Beta-Test ville kunne bidrage til at få nedbragt udbrud på sygehusene, da metodens detektionstid er så kort. Jeg foreslår derfor, at Cica-Beta-Test anvendes i tilfælde, hvor lægerne mener, at det er nødvendigt. For VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort har vi ud fra vores undersøgelse ikke kunne konkludere, hvordan resistenskortet og VITEK 2 Compact fungerede, da den diagnostiske sensitivitet og specificitet ikke var valid eller pålidelig. Perspektivering Vælger KMA, Næstved Sygehus, at anvende enten ChromID ESβL agar eller Brilliance ESβL Agar, ville jeg foreslå, at der blev udført flere forsøg. Hertil forsøg hvor bakterierne blandes i urin, fæces, blod osv., for at se, hvordan de ESβL producerende bakterier vokser frem, og om der er andre ting, der kunne vanskeliggøre detektionen. Tilmed kunne der udføres forsøg, hvor den ESβL producerende bakterie blev blandet med andre bakterier, for at vurdere om den ESβL producerende bakterie også findes her. Da E. coli og K. pneunomiae ofte ses i forbindelse med urinvejsinfektioner [8], så ville jeg synes, at det var her screeningspladerne skulle anvendes. Udover at detektere og identificere ESβL producerende bakterier ved urinprøverne, synes jeg også, at bloddyrkningerne skulle medtages, og grunden er, at en ubehandlet urinvejsinfektion kan fører til sepsis. Jeg vil også komme med et forslag til producenterne for deres videreudvikling: De kunne prøve at sænke cefpodoxim koncentrationen, som ville få flere ESβL producerende bakterier til at vokse frem, men det vil også gøre, at muligheden for at andre bakterier voksede frem, og det er en svær balancegang. Vælges den nye nomenklatur som retningslinje, vil denne ændre opfattelsen af begrebet ESβL, da flere grupper ville høre ind under samme. Hertil skulle firmaerne yderligere overveje at gøre pladen selektiv for AmpC, da disse også er et stigende problem, og det mener jeg ikke, der kan ses bort fra. 43 af 48

45 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier For at få evalueret Cica-Beta-Test ordentligt skulle et forsøg lignede Livermore D. et al (2007) udføres, hvor alle stammer er molekylærbiologisktestet for ESβL, AmpC og MβL. Hertil skulle der yderligere tilføjes en negativ population, som hverken indeholdt produktion af ESβL, AmpC, MβL eller havde flere β-laktamaser, så der også blev fundet en diagnostisk specificitet. Endvidere kunne der laves forsøg med forskellige HMRZ-86 koncentrationer, for at vurdere om denne gav en detektionsforskel. Til slut foreslår jeg, at der udføres et nyt forsøg til VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort, hvor fortyndingstrinnet udføres. Hvidovre Hospitals resultater, hvor de fik en diagnostisk specificitet til 96,2 %, ligger til grund for forslaget. 44 af 48

46 Christina Mejdahl Nielsen Referencer Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 1. Statens Serum Institut. (uge 11, 2008). EPI NYT: ESBL-PRODUCERENDE BAKTERIER. Lokaliseret d. 20. marts 2009 på 2. Christopher Walsh (2008). Antibiotics, Actions, Origins, Resistance. American Society for Mikrobiology. 3. Aarestrup F. M., Emborg H., Bager F, Ajufo J. C., Nielsen A. C., Frimodt-Møller N, Hammerum A. M., Skov R., Poulsen J. (2007). Danmap 2007: Prevalence of ESBL-producing bacteria among humans and animals in Denmark in 2007, Statens Serum Institut, Danish Veterinary and Food Administration, Danish Medicines Agency, National Veterinary Institute (Technical University of Denmark) and National Food Institute (Technical University of Denmark), s Paterson D. L., Bonomo R. A. (2005). Extended-spectrum β-lactamases: a Clinical Update. American Society for Microbiology, 18(4), Lokaliseret d. 5. februar 2009 på 5. Glupczynski Y., Berhin C., Bauraing C., Bogaerts P. (2007). Evaluation of a New Selective Chromogenic Agar Medium for Detection of Extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae. American Society for Microbiology, 45(2), Lokaliseret d. 5. februar 2009 på 6. Song W., Jeong S. H., Kim J. S., Kim H. S., Shin D. H., Roh K. H. og Lee K. M. (2007). Use of boronic acid methods to detect the combined expression of plasmid-mediated AmpC β-lactamases in clinical isolates of Klebsiella spp. Salmonella spp. and Proteus mirabilis. Diagnostics Microbiology and Infections Disease, vol. 57. s Lokaliseret d. 1. juni Ruppé E., Bidet P., Verdet C., Arlet G og Bingen E (2006) First Detection of the Ambler Class C AmpC β-lactamase in Citrobacter freundii by a New, Simple Double-disk Synergy Test. Journal of Clinical Microbiology, vol. 44, no. 11. s Lokaliseret d. 1. juni Cantón R., Novais A., Valverde A., Machado E., Peixe L., Baquero F. og Coque T. M. (2008). Prevalence and spread of extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in Europe. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, CMI, 14 (Suppl.1), Lokaliseret d. 20. januar Réglier-Poupet H., Naas T., Carrer A., Cady A., Adam J., Fortineau N., Poyart C. og Nordmann P. (2008). Perfomence of chromid ESBL, a chromogenic medium for detection of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases. Society for General Microbiology, 57, Lokaliseret d. 20. marts Färber J., Moder K-A., Layer F., Tammer I., König W. og König B. (2008). Extended-Spectrum β- Lactamase Detection with Different Panels for Automated Susceptibility Testing and with a Chromogenic Medium. American Society for Microbiology, 46(11), Lokaliseret d. 18. marts Livermore D. M., Warner W. og Mushtaq S. (2007). Evaluation of the chromogenic Cica-β-Test for detecting extended-spectrum, AmpC and metallo-β-lactamases. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 60, Facts seddel hertil: D Lokaliseret d. 2. april Colodner R., Reznik B., Gal V., Yamazaki H., Hanaki H. og Kubo R. (2006). Evaluation of a novel kit for the rapid detection of extended-spectrum beta-lactamases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 25, Lokaliseret d. 3. april Spanu T., Sanguinetti M., Tumbarello M., D Inzeo T., Fiori B., Posteraro B., Santangelo R., Cauda R. og Fadda G. (2006). Evaluation of the New VITEK 2 Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) Test for Rapid Detection of ESBL Production in Enterobacteriaceae Isolates. American Society for Microbiology, 44(9), Lokaliseret d. 18. marts af 48

47 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 14. Statens serum instituts smitteberedskab, status ESBL ENDNU EN TRUSSEL, s Lokaliseret d. 20. marts 2009 på eberedskab% pdf 15. Rupp M.E. og Fey P. D. (2003). Extended Spectrum β-lactamase (ESBL)-Producing Enterobacteriaceae: Considerations for Diagnosis, Prevention and Drug Treatment. Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, Omaha, Nebraska, USA, 63 (4), Lokaliseret d. 18. marts Frimodt-Møller N og Hansen D. S. (2007). Extended spektrum Beta-lactamase (ESBL) en ny trussel. Notat skrevet på vegne af DANRES-gruppen til Sundhedsstyrelsen vedrørende DANRES s prævalensundersøgelse om ESBL i Danmark sept-okt Se bilag nr. 13, for hele artiklen. 17. Busk H.E., Engbæk K., Heltberg O. og Frederiksen W. (1983). Identifikationsskema for Enterobacteriaceae. Statens Seruminstitut, 1. udgave. 18. ChromID ESBL - Chromogenic medium for the Screening of Extended Spectrum β-lactamaseproducing Enterobacteria (ESBL). The biomeriéux Clinical Diagnostics website. Lokaliseret d. 5. februar 2009 på orm=9&lang=en. 19. CICA-BETA-TEST Rapid ESβL Detection. MAST Group Ltd Lokaliseret d. 4. marts 2009 på sting.pdf. 20. Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Landry M. L. og Pfaller M. A. (2007). Manual of Clinical Microbiology 9 th Edition Antibacterial agents and susceptibility test methods. s og Malhotra-Kumar S., Abrahantes J. C., Lammens C., Molenberghs G., Aerts M., Goossens H. (2009). Rapid detection of extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae: A randomized, investigator-blinded evaluation of culture-based approaches. On the behalf of the MOSAR WP2 study group. Sendt til os pr. mail den 20. maj Indlægsseddel for Oxoid Briliance TM ESBL Agar. Culture Media. Lokaliseret d. 12. april 2009 på Prepared Media - Briliance TM ESBL Agar Code: PO5302. Lokaliseret d. 12. april 2009 på Brown A., O Brien S., Cocks S., Beaves J. og Dimmer S. (2009). A laboratory evaluation of chromogenic screening media for the detection of extended-spectrum beta-lactamase producing bacteria. Oxoid Ltd, Basingstoke, United Kingdom. Sendt til os pr. mail den 20. maj Turner P. (2005). Extended-Spectrum β-lactamases. Infectious Diseases Sociaty of America, 41, s Lokaliseret d. 14. april Overlæge D.S. Hansen (2006). Nye β- lactamaser hos enterobakterierne. UGESKRIFT FOR LÆGER Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi, 168/12. Lokaliseret d. 22. marts Kjeldsen K., Nielsen L. P., Peterslund N. A. og Tvede M. (2006). Infektionssygdomme og mikrobiologi. Akademisk Forlag. 28. Hanaki H., Kubo R., Nakano T., Kurihara M. og Sunagawa K. (2004). Characterization of HMRZ- 86: a novel chromogenic cephalosporin for the detection of extended-spectrum β-lactamases. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, s Lokaliseret d. 18. april af 48

48 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 29. Giske C.G., Sundsfjord A. S., Kahlmeter G., Woodford N., Nordmann P., Paterson D.L., Cantón R. og Walsh T. R. (2009). Redefining extended-spectrum β-lactamases: balancing science and clinical need. Leading article - Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 63, s.1-4. Lokaliseret d. 28. april Lautrop H, Høiby N, Bremmelgaard A, Korsager B (1979). Bakteriologiske undersøgelsesmetoder. FADL's Forlag. s Lokaliseret d. 5. maj Screening for betalactam resistance using Cefpodoxime 10 µg disk. Lokaliseret d. 1. juni 2009 på: Haldorsen B., Aasnaes B., Dahl K. H., Hanssen A-M., Simonsen G. S., Walsh T. R., Sundsfjord A. og Lundblad E. W. (2008), The AmpC phenotype in Norwegian clinical isolates of Escherichia coli is associated with an acquired ISEcp1-like ampc element or hyperproduction of the endogenous AmpC. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 62, Lokaliseret d. 20. marts Degré M., Hovig B., Bukholm G., Rollag H. (2000). Medisinsk Mikrobiologi. Gyldendal Norsk Forlag AS 2000, 2. udgave, 1. oplag. s Medicin.dk. Følsomhedsbestemmelse og resistens. Revideret Lokaliseret d. 7. juni på: uppenr=315714&name=følsomhedsbestemmelse%20og%20resistens&docid=frameset Figurer 1. Betalaktamringen og betalaktambindingen [33]. 2. Vækst på ChromID ESβL agar. Billederne er alle egne billeder taget i laboratoriet. 3. Vækst på Brilliance. Billede 1, 2, 3 og 5 er fra bilag 11, mens billede 4 er eget billede taget i laboratoriet 4. Misfarvning af agar på Brilliance mediet. 5. HMRZ-molekylet [28] 6. To teststrips; Én uden reaktion (gul) og én med reaktion (rød) [19]. 7. VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort 8. VITEK 2 Compact apparatet Bilag 1. Konfirmatorisk test beskrevet mere uddybende. 2. Eksempel på svar printet ud fra VITEK 2 Compact 3. Detaljeret informationer om alle de brugte stammer. 4. Fuldt detaljeret fremgangsmåde. 5. Alle resultater for Cefpodoxim zonen samt resultater for ChromID ESβL agar (biomérieux) og Brilliance TM ESβL Agar (Oxoid) 6. Alle resultater for CICA-BETA-TEST (MAST Group) 7. Alle resultater for VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort (biomérieux) 8. Resultaterne på VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort hentet fra Hvidovre Hospital. 47 af 48

49 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 9. Beregninger af diagnostisk sensitivitet og specificitet. 10. Slideshow fra Oxoid reference: Søren Mattern Søes, Oxoid, tlf Oversigt over alle falske positive for alle fire metoder. 12. Oversigt over alle falsk negative resultater for alle 4 metoder. 13. Artikel (kilde 16 i litteraturlisten): Extended spektrum Beta-lactamase (ESβL) en ny trussel. 14. Billeder af pladerne overblik over de forskellig farvede kolonier vi har observeret. 15. Indlægsseddel for Vitek2 AST-GN27. Gram negativt Resistenskort. biomeriéux. 16. Instruktionsmanual for biomeriéux VITEK 2 COMPACT apparat 17. Indlægsseddel for biomeriéux ChromID TM ESβL agar Selektivt kromogent medium til screening for Extended Spektrum β -laktamase producerende enterobakterier (ESβL). 18. Indlægsseddel for biomeriéux 48 af 48

50 Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 49 af 48

51 Bilag 1 Cephalosporin/clavulan kombinationsdisk på iso-sensitest agar [4, s. 671] Den konfirmatoriske test består i, at bakterien totalspredes på en resistensplade (iso-sensitest) uden blod. På resistenspladen lægges fire antibiotika disks; 1) Ceftazidim, 2) Ceftazidim med Clavulansyre, 3) Cefotaxim og 4) Cefotaxim med Clavulansyre). Clavulansyre bruges, fordi syren ved en ESBL-produktion vil danne et akryl-enzym-konpleks med beta-laktamaseenzymet i bakterien i stedet for beta-laktam-antibiotikummet. Beta-laktamase-enzymet mister herved sin aktivitet [20, s.1082]. Bakterier, hvor en ESBL-produktion forekommer, vil Clavulansyren virke og hæmningszonen måles større end antibiotikummet uden Clavulansyre, som stadigvæk vil være resistent. Resistenspladen inkuberes ved 35 C i atmosfærisk luft til dagen efter. Efter inkubation måler bioanalytikeren alle fire hæmningszonestørrelser og finder differensen af Ceftazidim og Ceftazidim med Clavulansyre samt differensen af Cefotaxim og Cefotaxim med Clavulansyre. Er et af disse forhold 5mm er en ESBL-produktion påvist. Side 1 af 1

52 Bilag 2 Eksempel på svar for VITEK Compact Side 1 af 1

53 Bilag 3 Skemaet viser informationer om de bakteriestammer der er anvendt i dette projekt. Disse data sørger for at vi kan finde tilbage til vores stammers oprindelse, hvor de ligger i fryseren på Næstved Sygehus, samt hvad, vi ved, de er testet for; ESβL, AmpC og hvilke gener, der er fundet (for mere uddybende information ses Metodevalg i opgaven) Stamme nr. Fryseplads Art Oprindelse ESβL AmpC Gener 1 CFI II A4 C. freundii Norge CFI II B4 Enterobacter sp. Norge CFI II C4 K. oxytoca Norge CFI II D4 Hafnia alvei Norge CFI II E4 Morganella morganii Norge CFI II F4 E. coli (16) DTU Food CFI II G4 E. coli DTU Food - + CMY-1 8 CFI II H4 S. heidelberg DTU Food - + CMY-2 9 CFI II i4 S. bareilly DTU Food - + ACC-1 10 CFI II A5 E. coli DTU Food - + FOX-1 11 CFI II B5 E. coli DTU Food - + LCR-1 12 CFI II C5 E. coli DTU Food - + DHA-1 13 CFI II D5 E. coli DTU Food - + ACT-1 14 CFI II E5 E. coli ATCC BEL II E2 C. freundii QC 5364 sending CFJ I A2 E. coli QC 7314 sending CFJ I H3 K. pneumonia QC 7383 sending CFI I A7 E. coli QC 7216 EQA-test EARSS-NEQAS CFI I A9 E. coli QC 7241 sending CFI I i6 E. coli QC 7215 EQA-test EARSS-NEQAS CEI V E7 K. pneumonia QC 6944 sending CFI I E4 K. pneumoniae QC 7095 sending BGJ II H4 K. pneumoniae QC 7918 sending CGK III i6 E. coli QC 8738 sending CGK III A7 E. coli QC 8739 sending CGK III i9 E. coli Uds pr CFI II G5 E. coli E0497 DTU Food + - CTX-M15 28 CFI II H5 E. coli K 5-7 DTU Food + - SHV12 el CFI II i5 E. coli H DTU Food + - CTX-M14 30 CFI II A6 E. coli H DTU Food + - CTX-M15 Side 1 af 5 Bilag 3

54 Stamme nr. Fryseplads Art Oprindelse ESβL AmpC Gener 31 CFI II B6 E. coli DTU Food + - CTX-M1 32 CFI II C6 E. coli DTU Food + - CTX-M1 33 CFI II D6 E. coli DTU Food + - CTX-M14 34 CFI II E6 E. coli H DTU Food + - CTX-M3 35 CFI II F6 E. coli H DTU Food + - CTX-M2 36 CFI II G6 E. coli DTU Food + - CTX-M14 37 CFI II H6 E. coli DTU Food + - CTX-M2 38 CFI II i6 K. pneumoniae DTU Food CFI II A7 K. pneumoniae DTU Food CFI II B7 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II C7 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II D7 E. coli Hvidovre Hospital CFI II E7 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II F7 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II G7 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II H7 E. coli Hvidovre Hospital CFI II i7 E. coli Hvidovre Hospital CFI II A8 E. coli Hvidovre Hospital CFI II B8 E. coli Hvidovre Hospital CFI II C8 E. coli Hvidovre Hospital CFI II D8 E. coli Hvidovre Hospital CFI II E8 E. coli Hvidovre Hospital CFI II F8 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II G8 E. coli Hvidovre Hospital CFI II H8 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II i8 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II F5 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II A9 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II B9 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II C9 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + - Side 2 af 5 Bilag 3

55 Stamme nr. Fryseplads Art Oprindelse ESβL AmpC Gener 61 CFI II D9 E. coli Hvidovre Hospital CFI II E9 E. coli Hvidovre Hospital CFI II F9 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II G9 E. coli Hvidovre Hospital CFI II H9 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II I9 E. coli Hvidovre Hospital CFL IV A1 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV B1 E. coli Hvidovre Hospital CFL IVC1 E. coli Hvidovre Hospital CFL IVD1 K. pneumoniae ATCC CFI II A1 E. coli Herning CFI II B1 E. coli Herning + + CTX-M, SHV, TEM 73 CFI II C1 E. coli Herning + + CTX-M 74 CFI II D1 K. pneumoniae Herning + - CTX-M, SHV, TEM 75 CFI II E1 K. pneumoniae Herning + - CTX-M, SHV, TEM 76 CFI II F1 E. coli Herning + - CTX-M, TEM 77 CFI II G1 E. coli Herning + - CTX-M 78 CFI II H1 E. coli Herning + - CTX-M 79 CFI II B2 E. coli Hvidovre Hospital CFI II C2 E. coli Hvidovre Hospital CFI II D2 E. coli Hvidovre Hospital CFI II E2 E. coli Hvidovre Hospital CFI II F2 E. coli Hvidovre Hospital CFI II G2 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II H2 E. coli Hvidovre Hospital CFI II i2 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II A3 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFI II B3 E. coli Hvidovre Hospital CFI II C3 E. coli Hvidovre Hospital CFI II D3 E. coli Hvidovre Hospital - + Side 3 af 5 Bilag 3

56 Stamme nr. Fryseplads Art Oprindelse ESβL AmpC Gener 91 CFI II E3 E. coli Hvidovre Hospital CFI II F3 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV E1 E. coli Hvidovre Hospital CFL IV F1 E. coli Hvidovre Hospital CFL IV G1 E. coli Hvidovre Hospital CFL IV H1 E. coli Hvidovre Hospital CFL IV I1 E. coli Hvidovre Hospital CFL IV A2 E. coli Hvidovre Hospital CFL IV B2 E. coli Hvidovre Hospital CFL IV C2 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV D2 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV E2 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV F2 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV G2 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV H2 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV I2 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV A3 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV B3 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV C3 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV D3 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV E3 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV F3 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV G3 K. pneumoniae Hvidovre Hospital CFL IV H3 P. mirabilis Hvidovre Hospital Ikke oprettet K. pneumoniae Y Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, SHV28, TEM 116 Ikke oprettet K. pneumoniae Y Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, SHV28, TEM 117 Ikke oprettet K. pneumoniae Y Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, SHV28, TEM 118 Ikke oprettet K. pneumoniae Y Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, TEM 119 Ikke oprettet K. pneumoniae Y Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, SHV28, TEM 120 Ikke oprettet K. pneumoniae Y Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, SHV28, TEM Side 4 af 5 Bilag 3

57 Stamme nr. Fryseplads Art Oprindelse ESβL AmpC Gener 121 Ikke oprettet K. pneumoniae Y Nykøbing Falster Sygehus + - SVH Ikke oprettet K. pneumoniae Y Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, SHV-1, TEM 123 Ikke oprettet K. pneumoniae Y Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, SHV-1, TEM 124 BGJ V H3 E. coli Næstved Sygehus + - CTX-M14/ AFJ III E1 K. pneumoniae Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, SHV AFJ III E4 K. pneumoniae Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M14/18,SHV AFJ B8 E. coli Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M CFK V C7 P. aeruginosa Næstved Sygehus DEJ I H2 S. typhimurium Næstved Sygehus AFJ III A4 K. pneumoniae Nykøbing Falster Sygehus + - CTX-M15, SHV Ikke oprettet E. coli Slagelse Sygehus + - CTX-M Ikke oprettet E. coli Slagelse Sygehus + - CTX-M Ikke oprettet E. coli Slagelse Sygehus + - CTX-M Ikke oprettet E. coli Slagelse Sygehus + - CTX-M BGK V D1 S. enteritidis Næstved Sygehus CBI II C6 Pseudomonas. sp Næstved Sygehus DEJ I A3 S. typhimurium Næstved Sygehus CGK III C8 P. aeruginosa Næstved Sygehus CGK III D6 P. aeruginosa Næstved Sygehus CEL IIII C7 P. aeruginosa Næstved Sygehus - - Side 5 af 5 Bilag 3

58 Bilag 4 Detaljeret fremgangsmåde Udsåning af bakteriestammer 1. Bakteriestamme tages op af fryseren. 2. Med vatpind skrabes materiale fra overflade af fryseboullionen og bakteriematerialet afsættes i første strøg på ½ 5 % blodagarplade. 3. Med 1 µl øjepodenål udføres en 2- trinsspredning: der spredes i 1. strøg med øjepodenålens ene side, hvorefter 2. strøg spredes med den anden side af øjepodenålen. 4. Pladerne inkuberes i timer ved 35 C i atmosfærisk luft. 5. Pladerne tages ud af varmeskab. 6. Pladerne kontrolleres for blandingskulturer. Hvis dette er tilfældet isoleres bakterien og der udføres eventuelle supplerende tests, for at sikre at det er den korrekte bakterie som undersøges. 7. En vatpind dyppes i en bakteriekoloni og opslemmes i reagensglas med 0,45 % NaCl. 8. Reagensglasset med bakteriesuspensionen placeres i Densichek og drejes en halv omgang, hvorefter McFarland-værdien måles og noteres i skema. Der tilstræbes McFarland 0,5. 9. Med 1 µl øjepodenål udsås bakteriesuspensionen på ½ iso-sensitest (resistensplade uden blod) med 2- trinsspredning. 10. En Cefpodoxim tablet påsættes mellem 1. og 2. strøg. 11. Pladerne inkuberes i timer ved 35 C i atmosfærisk luft. 12. Pladerne tages ud af varmeskab og hæmningszonen for Cefpodoxim aflæses og noteres i skema. Chrompladerne - ChromID ESβL agar og Brilliance ESβL Agar 1. En bakteriekoloni fra iso-sensitest pladen opslemmes med en vatpind i et reagensglas med 0,45 % NaCl. Der tilstræbes McFarland 0,5. Den præcise værdi noteres i skema. 2. Med 1 µl øjepodenål udsås bakteriesuspensionen på ½ ChromID ESBL agarplade (BioMérieux) og ½ Brilliance ESBL plade (Oxoid), med 2- trinsspredning. 3. Chrompladerne inkuberes i timer ved 35 C i atmosfærisk luft. 4. Pladerne tages ud af varmeskab og aflæses efter 24 timer. Resultaterne noteres i skema. Side 1 af 3

59 Bilag 4 5. Pladerne reinkuberes og aflæses igen efter yderligere 24 timer. Resultaterne noteres i skema. Positivt resultat: (BioMérieux) Ved ESBL producerende Escherichia coli ses kolonier som pink til bordeaux. Ved ESBL producerende Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, Serratia og Citrobacter ses ved grønne, brunlig grønne eller blå kolonier. Ved ESBL producerende Proteus ses mørkebrune til lysebrune kolonier. Ved fund af pink eller bordeaux kolonier udføres der en ID Indol TDA test. Hvis der her fremkommer en turkis farvereaktion er E. coli bekræftet. Ved fund af farveløse kolonier udføres der en oxidase test. Ved en negativ oxidase test kan der mistænkes for en ESBL producerende bakterie, hvilket yderligere skal bekræftes. Positivt resultat (Oxoid) Ved ESBL producerende Escherichia coli ses kolonier som pink eller blå. Ved ESBL producerende Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, Serratia og Citrobacter ses ved grønne kolonier. Ved ESBL producerende Proteus, Morganella og Providencia ses en brun halo. Ved ESBL producerende Salmonella og Acinotobacter ses farveløse kolonier Ved fund af pink eller blå kolonier kan E. coli identifikation bekræftes ved positiv turkis reaktion med RapID Spot Indole test. VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort 1. En bakteriekoloni opslemmes med en vatpind i et reagensglas med 0,45 % NaCl til McFarland 0,5-0,63. Den præcise McFarland værdi noteres i skema. 2. Reagensglas og VITEK 2 ESBL AST-GN27 kort placeres i VITEK rack, med spidsen ned i reagensglasset og placeres i "fylderstationen". 3. Efter et par minutter signalerer VITEK 2 Compact at racket kan overføres til "kassette-i-sætningsstationen". 4. Efter et par minutter signalerer VITEK 2 Compact at racket kan tages ud og reagensglas bortskaffes. 5. På VITEK 2 Compacts tilhørende computer, trykkes der på ikonet "manage cassettes view" og der vælges det undersøgte kassetterack. Bench name, prøvenummer, og organisme indtastes og kassetten gemmes ved at trykke på ikonet diskette. Side 2 af 3

60 6. Prøven analyseres nu i 6-13 timer. 7. Resultatet udprintes fra VITEK 2 8. Resultatet findes under AES findings, phenotype, og noteres i skema Bilag 4 Cica-Beta-Test 1. Tilsæt en dråbe (ca. 20µl.) af Cica-Beta-Test substratet på hver af de 2 test strips, umiddelbart før testen udføres. (Cica-Beta-Test 1, Cica-Beta-Test CVA) 2. Isoler bakteriemateriale fra kanten af cefpodoxims hæmningszone med en 1 µl øjepodenål. (Kolonierne skal tages direkte fra inkubation) 3. Bakteriemateriale afsættes grundigt på hver af de 3 test strips filterpuder. Her må filterpuderne gerne gå lidt fra hinanden! 4. Observer de 2 test strips indenfor 2-15 minutter i stuetemperatur. 5. Ved mistanke om en mulig AmpC producerende bakterie, udføres Cica-Beta-Test C. 6. Resultaterne noteres i skema. ESBL test protokol Hvis Cica-Beta-Test 1 bliver gul, er det ikke en ESBL producerende bakterie og testen stoppes her. Ved farveskift til rød, kan der enten være ESBL, AmpC eller MβL og testen fortsætter med Cica-Beta-Test CVA. Hvis Cica-Beta-Test CVA bliver gul betyder det tilstedeværelse af ESBL producerende bakterie, men ved farveskift til rød, skal der videretestes med Cica-Beta- Test C. Cica-Beta-Test C viser om AmpC er tilstede ved at give farven gul. Hvis farven skifter til rød, kan der være tale om MβL eller multible β-laktamase producerende bakterier. Side 3 af 3

61 Bilag 5 Skemaet viser alle resultater i rådata. Vores resultater er: Cefpodoxims hæmningszone størrelse (målt i mm.), Farvereaktioner og vækstgrad og bemærkninger for ChromID ESβL og Brilliance ESβL, samt hvad vi har vurderet resultaterne til (SN, SP, FN eller FP). Falsk positive (FP) resultater er markeret med gul. Falsk negative (FN) resultater er markeret med lyse blå. Stamme nr. ESβL AmpC Cefpodoxim zone McFarland ChromID ESβL (biomérieux) Bemærkning Vurdering Brilliance ESβL (Oxoid) Bemærkning Dag 1 Dag 2 Dag 1 Dag ,49 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IN FP Blå+++ Blå+++ IN FP ,49 Grøn+++ Grøn+++ FP Grøn+++ Grøn+++ FP ,52 Grøn+++ Grøn+++ FP - - SN ,49 Farveløs+++ Farveløs+++ ON FP Grøn+ Grøn+ SN ,48 Farveløs+++ Farveløs+++ ON, V FP Brun+++ Brun+++ V FP , SN - - SN ,50 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP FP Blå++ Blå++ FP , SN - - SN ,46 Farveløs++ Farveløs+++ ON FP - - SN , SN - - SN , SN - - SN , SN - - SN , SN Blå++ Blå++ FP , SN - - SN ,49 Farveløs+++ Farveløs+++ ON FP Grøn+++ Grøn+++ FP , SN - - SN ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,51 Bordeaux++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,44 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ I SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ I, III SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP , SN - - SN ,50 Grøn+++ Grøn+++ FP Grøn+++ Grøn+++ FP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ II SP , SN - - SN ,53 Bordeaux++ Bordeaux++ IP FP Blå+++ Blå+++ III FP ,49 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ I, II SP ,49 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ III SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ I, II SP ,51 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ I, II SP Vurdering Side 1 af 5 Bilag 5

62 Stamme nr. ESβL AmpC Cefpodoxim McFarland ChromID ESβL Bemærkning Vurdering Brilliance ESβL Bemærkning Vurdering zone (biomérieux) (Oxoid) Dag 1 Dag 2 Dag 1 Dag ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,47 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ III SP ,50 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ II SP ,52 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ III SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,48 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP , FN Grøn++ Grøn++ SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,50 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,52 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ III SP ,56 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,50 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,53 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,53 Farveløs+++ Farveløs+++ ON SP Grøn+++ Grøn+++ Forkert farve SP ,55 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP , FN - - FN , FN - - FN ,52 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP , FN Grøn++ Grøn++ Forkert farve SP ,56 Bordeaux++ Bordeaux++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,56 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,50 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,55 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,50 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,55 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,51 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP Side 2 af 5 Bilag 5

63 Stamme nr. ESβL AmpC Cefpodoxim McFarland ChromID ESβL Bemærkning Vurdering Brilliance ESβL Bemærkning Vurdering zone (biomérieux) (Oxoid) Dag 1 Dag 2 Dag 1 Dag ,51 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ I, II SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,55 Farveløs+++ Farveløs+++ ON SP Grøn+++ Grøn+++ Forkert farve SP ,56 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP , FN - - FN ,55 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP , FN - - FN ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP , SN - - SN , FN - - FN , FN - - FN ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,52 Farveløs++ Grøn++ ON SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,52 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ II SP ,53 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ III SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ III SP ,52 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ II SP ,47 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ II SP , FN - - FN , SN - Grøn+ SN , SN - - SN , SN - - SN , SN - - SN , SN - - SN , SN - - SN , SN - - SN , SN - - SN , SN - - SN Side 3 af 5 Bilag 5

64 Stamme nr. ESβL AmpC Cefpodoxim McFarland ChromID ESβL Bemærkning Vurdering Brilliance ESβL Bemærkning Vurdering zone (biomérieux) (Oxoid) Dag 1 Dag 2 Dag 1 Dag , SN - - SN , SN - - SN ,55 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ III SP ,52 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,49 Farveløs+++ Farveløs+++ ON SP Grøn+++ Grøn+++ Forkert farve SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,48 Farveløs+++ Farveløs+++ ON SP Grøn+++ Grøn+++ Forkert farve SP , FN - - FN , FN - - FN ,54 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn++ SP ,48 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,53 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,48 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,47 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,47 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,47 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,53 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,48 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,51 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,51 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,50 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,51 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,59 Brun+++ Brun+++ V SP Brun+++ Brun+++ V SP ,60 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,50 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP Side 4 af 5 Bilag 5

65 Stamme nr. ESβL AmpC Cefpodoxim McFarland ChromID ESβL Bemærkning Vurdering Brilliance ESβL Bemærkning Vurdering zone (biomérieux) (Oxoid) Dag 1 Dag 2 Dag 1 Dag ,52 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,56 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,51 Grøn+++ Grøn+++ SP Grøn+++ Grøn+++ SP ,55 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP , FN - - FN , FN - - FN , FN - - FN ,54 Brun+++ Brun+++ OP SN Brun+++ Brun+++ FP , SN - - SN , FN - - FN ,55 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ SP ,52 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ I, II SP ,54 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ III SP ,53 Bordeaux+++ Bordeaux+++ IP SP Blå+++ Blå+++ III SP , SN - - SN ,58 Farveløs+++ Farveløs+++ OP SN Farveløs+++ Farveløs+++ FP , SN - - SN ,52 Farveløs+++ Farveløs+++ OP SN Brun+++ Brun+++ FP , SN Farveløs+++ Farveløs+++ FP ,51 Brun+++ Brun+++ OP SN Brun+++ Brun+++ VI FP - Ingen vækst I Gnidret grøn farve i midten af 1. strøg Samlede resultater for Samlede resultater for + Agaren farves gnidret II Grøn omkring kolonier ChromID ESβL Brilliance ESβL ++ Vækst i 1. strøg III Pink omkring kolonier Antal Antal +++ Vækst i 2. strøg IV Sværmer SN 30 SN 27 ON Oxidase negativ V Agar farves SP 85 SP 87 OP Oxidase positiv VI Agar farves pink FN 15 FN 13 IP Indol positiv FP 10 FP 13 IN Indol negativ Side 5 af 5 Bilag 5

66 Bilag 6 Skemaet viser alle resultater i rådata. Vores resultater er: Gul eller rød alt efter om der er sket en farveændring eller ej for CBT-1, CBT- ESβL og CBT-AmpC, samt hvad vi har vurderet resultaterne til (SN, SP, FN eller FP). Falsk positive (FP) resultater er markeret med gul. Falsk negative (FN) resultater er markeret med lyse blå. Stamme nr. ESβL AmpC Cica-Beta-Test (MAST Group) Vurdering af CBT-1+CBT- ESβL CBT-1 CBT- ESβL CBT- AmpC Rød Rød Gul SN Rød Rød Gul SN Rød Rød Gul SN Rød Rød Gul SN Rød Gul FP Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Rød Rød Rød SN Rød Rød Gul SN Rød Gul FP Rød Gul FP Rød Rød Gul SN Gul Gul SN Rød Rød Gul SN Gul Gul SN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Gul Gul SN Rød Rød Rød SN Rød Gul SP Gul Gul SN Gul Gul SN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Side 1 af 5 Bilag 6

67 Stamme nr. ESβL AmpC Cica-Beta-Test Vurdering af CBT-1+CBT- ESβL (MAST Group) CBT-1 CBT- ESβL CBT- AmpC Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Rød Rød FN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Gul Gul FN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Gul Gul FN Gul Gul FN Rød Gul SP Rød Rød Gul FN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Side 2 af 5 Bilag 6

68 Stamme nr. ESβL AmpC Cica-Beta-Test Vurdering af CBT-1+CBT- ESβL (MAST Group) CBT-1 CBT- ESβL CBT- AmpC Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Gul Gul FN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Rød Gul FN Rød Gul SP Gul Gul SN Gul Gul FN Gul Gul FN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Gul Gul FN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Side 3 af 5 Bilag 6

69 Stamme nr. ESβL AmpC Cica-Beta-Test Vurdering af CBT-1+CBT- ESβL (MAST Group) CBT-1 CBT- ESβL CBT- AmpC Gul Gul SN Gul Gul SN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Gul Gul FN Rød Gul SP Gul Gul FN Gul Gul FN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Side 4 af 5 Bilag 6

70 Stamme nr. ESβL AmpC Cica-Beta-Test Vurdering af CBT-1+CBT- ESβL (MAST Group) CBT-1 CBT- ESβL CBT- AmpC Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Gul Gul FN Gul Gul FN Gul Gul FN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul FN Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Rød Gul SP Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Gul Gul SN Samlede resultater for CBT-1 + CBT- ESβL Antal SN 37 SP 83 FN 17 FP 3 Side 5 af 5 Bilag 6

71 Bilag 7 Skemaet viser alle resultater i rådata. Vores resultater er: ESβL positiv, ESβL negativ og bemærkninger for VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort, samt hvad vi har vurderet resultaterne til (SN, SP, FN eller FP). Falsk positive (FP) resultater er markeret med gul. Stamme nr. ESβL AmpC McFarland VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort (BioMérieux) VITEK 2Compact Bemærkninger Vurdering ,57 + AES 2 FP ,50 + AES 2 FP ,59 - AES 3 SN ,55 + AES 2 FP ,55 + AES 2 FP ,53 - AES 4 SN ,52 + AES 2 FP ,55 + AES 2 FP ,62 + AES 2 FP ,52 Inconsistent ,63 + AES 2 FP ,52 + AES 2 FP ,53 + AES 2 FP ,63 Inconsistent ,53 + AES 2 FP ,51 + AES 2 FP ,53 + AES 1 SP ,62 + AES 2 SP ,59 + AES 2 SP ,54 + AES 2 SP ,59 + AES 2 SP ,52 - AES 5 SN ,58 + AES 2 FP ,54 + AES 2 SP ,56 Inconsistent ,53 + AES 2 FP ,63 + AES 2 SP ,53 + AES 2 SP ,57 + AES 2 SP ,59 + AES 2 SP Side 1 af 5 Bilag 7

72 Stamme nr. ESβL AmpC McFarland VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort (BioMérieux) VITEK 2Compact Bemærkninger Vurdering ,51 + AES 2 SP ,62 + AES 2 SP ,52 + AES 2 SP ,63 + AES 2 SP ,60 + AES 2 SP ,56 + AES 2 SP ,54 + AES 2 SP ,63 + AES 2 SP ,56 + AES 7 SP ,52 + AES 2 SP ,50 + AES 1 SP ,52 + AES 2 SP ,56 + AES 1 SP ,50 + AES 1 SP ,53 + AES 1 SP ,53 + AES 2 SP ,55 + AES 2 SP ,53 + AES 2 SP ,51 + AES 2 SP ,52 + AES 2 SP ,53 + AES 2 SP ,56 + AES 1 SP ,56 + AES 2 SP ,54 + AES 2 SP ,50 + AES 2 SP ,52 + AES 8 SP ,55 + AES 2 SP ,50 + AES 2 SP ,55 + AES 1 SP ,51 + AES 1 SP Side 2 af 5 Bilag 7

73 Stamme nr. ESβL AmpC McFarland VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort (BioMérieux) VITEK 2Compact Bemærkninger Vurdering ,51 + AES 2 SP ,54 + AES 2 SP ,52 + AES 9 SP ,55 + AES 2 SP ,56 + AES 8 SP ,53 + AES 2 SP ,55 + AES 9 SP ,54 + AES 2 SP ,56 + AES 2 SP ,52 + AES 2 SP ,61 + AES 2 FP ,63 + AES 2 SP ,50 + AES 2 SP ,52 + AES 2 SP ,59 + AES 2 SP ,55 + AES 2 SP ,58 + AES 2 SP ,59 + AES 2 SP ,50 + AES 2 SP ,62 + AES 2 SP ,51 + AES 2 SP ,50 + AES 2 FP ,55 + AES 2 FP ,53 + AES 10 FP ,53 + AES 2 FP ,50 + AES 2 FP ,53 + AES 2 FP ,62 + FP ,50 + AES 2 FP ,56 + AES 2 FP Side 3 af 5 Bilag 7

74 Stamme nr. ESβL AmpC McFarland VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort (BioMérieux) VITEK 2Compact Bemærkninger Vurdering ,59 - AES 4 SN ,59 + AES 9 FP ,59 + AES 2 SP ,61 + AES 2 SP ,59 + AES 1+3 SP ,58 + AES 2 SP ,56 + AES 2 SP ,60 + AES 2 SP ,50 + AES 2 SP ,62 + AES 1+3 SP ,55 + AES 2 SP ,60 + AES 2 SP ,63 + AES 1 SP ,52 + AES 2 SP ,56 + AES 2 SP ,60 + AES 2 SP ,53 + AES 1 SP ,54 + AES 2 SP ,56 + AES 1 SP ,51 + AES 2 SP ,58 + AES 2 SP ,60 + AES 1 SP ,51 + AES 2 SP ,59 + AES 2 SP ,60 + AES 1 SP ,52 + AES 1 SP ,52 + AES 1 SP ,50 + AES 1 SP ,52 + AES 1+3 SP ,52 + AES 2 SP Side 4 af 5 Bilag 7

75 Stamme nr. ESβL AmpC McFarland VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort (BioMérieux) VITEK 2Compact Bemærkninger Vurdering ,52 + AES 2 SP ,56 + AES 2 SP ,51 + AES 2 SP ,55 + AES 2 SP ,54 + AES 1 SP ,53 + AES 2 SP ,59 + AES 2 SP ,54 + AES 2 FP ,59 Inconsistent ,51 Inconsistent ,55 + AES 2 SP ,52 + AES 2 SP ,54 + AES 2 SP ,53 + AES 2 SP ,52 Inconsistent ,58 + AES 2 FP ,52 + AES 2 FP ,52 + AES 2 FP ,54 + AES 2 FP ,51 + AES 2 FP AES 1 AES 2 AES 3 AES 4 AES 5 AES 6 AES 7 AES 8 AES 9 AES 10 Extended-spectrum beta-lactamase Resistent (Carbapenems), ESBL + Carbapenemase (Metallo-OR KPC) Carbapenemase (Metallo-OR KPC) Acquired penicillinase + Cephalosporinase Acq pase + Impermeability (cephamycins) Inconsistent Extended-spectrum beta-lactamase, SHV1-hyperproduction ESBL + Impermeability (cephamycins), ESBL + Carbapenemase (Metallo-OR KPC) Extended-spectrum beta-lactamase, ESBL + Impermeability (cephamycins) Resistent (Carbapenems), ESBL + Carbapenemase (Metallo-OR KPC), Acquired Cephalosporinase (Except ACC-1) Samlede resultater for VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort Antal SN 4 SP 99 FN 0 FP 31 Side 5 af 5 Bilag 7

76 Bilag 8 Skemaet viser alle resultater i rådata. Disse resultater er: ESβL positiv, ESβL negativ for VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort, samt hvad vi har vurderet resultaterne til (SN, SP, FN eller FP). Falsk positive (FP) resultater er markeret med gul. Falsk negative (FN) resultater er markeret med lyse blå. Stamme nr. Stamme nr. Art Oprindelse Molekylærbiologisk testet VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort Vurdering (BioMérieux) Projektgruppe Vores nr. ESβL (Hvidovre) Positiv kontrol K. pneumoniae ATCC + + SP Negativ kontrol E. coli ATCC - - SN 1 46 E. coli Hvidovre Hospital + + SP 2 64 E. coli Hvidovre Hospital + + SP 3 42 E. coli Hvidovre Hospital + + SP 4 61 E. coli Hvidovre Hospital + + SP 5 68 E. coli Hvidovre Hospital + + SP 6 54 E. coli Hvidovre Hospital + + SP 7 62 E. coli Hvidovre Hospital + + SP 8 E. coli Hvidovre Hospital + + SP 9 93 E. coli Hvidovre Hospital + + SP E. coli Hvidovre Hospital + - FN E. coli Hvidovre Hospital + + SP 12 E. coli Hvidovre Hospital + + SP E. coli Hvidovre Hospital + + SP E. coli Hvidovre Hospital + + SP E. coli Hvidovre Hospital + - FN E. coli Hvidovre Hospital + - FN E. coli Hvidovre Hospital + - FN E. coli Hvidovre Hospital + - FN 19 E. coli Hvidovre Hospital + - FN 20 E. coli Hvidovre Hospital + - FN E. coli Hvidovre Hospital + - FN E. coli Hvidovre Hospital + - FN E. coli Hvidovre Hospital + + SP 24 E. coli Hvidovre Hospital + + SP E. coli Hvidovre Hospital + + SP 26 E. coli Hvidovre Hospital + + SP Side 1 af 4 Bilag 8

77 Stamme nr. Stamme nr. Art Oprindelse Molekylærbiologisk testet VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort Vurdering (BioMérieux) Projektgruppe Vores nr. ESβL (Hvidovre) 27 E. coli Hvidovre Hospital + + SP E. coli Hvidovre Hospital + - FN E. coli Hvidovre Hospital + - FN 30 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 31 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 32 K. pneumoniae E Hvidovre Hospital - - SN 33 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 34 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 35 K. pneumoniae E Hvidovre Hospital - - SN 36 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 37 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 38 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 39 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 40 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 41 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 42 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + - FN 43 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 44 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 47 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 48 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP Side 2 af 4 Bilag 8

78 Stamme nr. Stamme nr. Art Oprindelse Molekylærbiologisk testet VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort Vurdering (BioMérieux) Projektgruppe Vores nr. ESβL (Hvidovre) K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 60 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 63 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 64 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + - FN K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 68 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 71 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 74 K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP K. pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 81 E.coli Hvidovre Hospital - + FP 82 K.pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP Side 3 af 4 Bilag 8

79 Stamme nr. Stamme nr. Art Oprindelse Molekylærbiologisk testet VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort Vurdering (BioMérieux) Projektgruppe Vores nr. ESβL (Hvidovre) 83 E.coli Hvidovre Hospital - - SN 84 K.pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 85 K.pneumoniae Hvidovre Hospital + + SP 87 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 88 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 89 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 90 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 91 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 92 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 93 K. pneumoniae Hvidovre Hospital - - SN 94 K. pneumoniae E Hvidovre Hospital - - SN 95 K. pneumoniae E Hvidovre Hospital - - SN Positiv kontrol K. pneumoniae ATCC + + SP Negativ kontrol E. coli ATCC - - SN Samlede resultater for VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort Antal SN 25 SP 59 FN 13 FP 1 Bemærk: Deres stamme nr. 86 ikke er med. Denne er slette i deres forsøg, hvad der er blevet af denne, ved vi ikke. Side 4 af 4 Bilag 8

80 Bilag 9 Udregninger af diagnostisk sensitivitet og specificitet. Side 1 af 1

81 The world leader in serving science Use of Oxoid MOSAR chromogenic ESBL agar

82 Oxoid MOSAR ESBL specification Oxoid MOSAR ESBL agar a chromogenic media for identifying presumptive extended-spectrum β-lactamase producing organisms (ESBL s). Inoculation can be performed directly from screening swabs (rectal, faeces, etc.) or sub-cultured from isolated colonies or liquid suspensions. Plates are incubated at 37 C for h (aerobic). Clinically significant groups of organisms are able to be differentiated on this medium. 2

83 Typical ESBL producing organisms Interpretation of results after h incubation Colony colour Presumptive ESBL isolate Expected colour Dark blue/violet E. coli Double disc or combination disc testing may be used for confirmation of ESBLs. Pink Turquoise/green E. coli (β-galactosidase negative) Coliforms (KESC) Tan/light brown Proteus/Providencia/Morganella spp. colourless Acinetobacter spp. Straw/brown/naturally pigmented, irregular, spreading Pseudomonas spp. 3

84 Typical E. coli morphology Escherichia coli TEM-3 Dark blue colonies indicate expressions of both beta-glucosidase and beta-galactosidase 4

85 Atypical E. coli morphology Escherichia coli CTX-M-3 Pink colonies indicate expression of betaglucosidase only (i.e. non-expression of betagalactosidase). 5

86 Typical morphology of KESC group Klebsiella pneumoniae SHV-18 Enterobacter cloacae CTX-M-9 Klebsiella, Enterobacter, Serratia and Citrobacter: Green-turquoise colonies produced by expression of beta-galactosidase. KESC group (coliforms) do not express beta-glucosidase. 6

87 Non-ESBL resistance mechanisms Most organisms expressing non-esbl resistant mechanisms are inhibited on Oxoid MOSAR ESBL agar. However, certain mechanisms may not be fully inhibited and dependant on the organism, may produce chromogenic reactions. All chromogenic media provide presumptive identification and require confirmation. The follow slides are examples of such cases: 7

88 Non-ESBL resistance mechanisms Klebsiella Derepressed AmpC Chromosomal AmpC with derepressed expression: inhibited growth is expected. 8

89 Non-ESBL resistance mechanisms Pseudomonas aeruginosa Inducible AmpC Non-ESBL-producing Pseudomonads may also grow on this medium due to other inherent (chromosomal) resistance mechanisms. Morphology can be varied, including natural pigmentation, orange, brown, or green-brown colonies. 9

90 Non-ESBL resistance mechanisms Pseudomonas aeruginosa VIM-2 Pseudomonas spp. possessing metallo-beta-lactamases (e.g. VIM-2) may also grow on this medium. 10

91 Faecal sample Plate inoculated with faecal sample (ESBL negative) Discoloration of the medium is expected when faecal material is directly inoculated on the medium. This discoloration is due to faecal components interfering with the chromogenic compounds in the medium and does not indicate growth of microorganisms. 11

92 Bilag 11: Falsk positive resultater Stamme nr. Art ESβL AmpC ChromID Brilliance VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort CBT-1+ CBT- ESβL ESβL agar ESβL Agar (Næstved) 1 C. freundii - + Bordeaux+++ Blå Enterobacter sp. - + Grøn+++ Grøn K. oxytoca - + Grøn+++ 4 Hafnia alvei - + Farveløs M. morganii - + Farveløs+++ Brun+++ + Rød-Gul 7 E. coli - + Bordeaux+++ Blå S. heidelberg S. bareilly - + Farveløs E. coli Rød-Gul 12 E. coli Rød-Gul 13 E. coli - + Blå C. freundii - - Farveløs+++ Grøn E. coli K. pneumoniae - - Grøn+++ Grøn E. coli - - Bordeaux++ Blå E. coli E. coli E. coli K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae K. pneumoniae E. coli E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa Brun Pseudomonas. sp Farveløs S. typhimurium P. aeruginosa - - Brun P. aeruginosa - - Farveløs P. aeruginosa - - Brun+++ + Side 1 af 1 Bilag 11

93 Bilag 12: Falsk negative resultater Stamme nr. Art ESβL AmpC ChromID Brilliance VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort CBT-1+ CBT- ESβL ESβL agar ESβL Agar (Næstved) 35 E. coli H Rød-Rød 39 K. pneumoniae Ingen vækst Gul-Gul 48 E. coli Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 49 E. coli Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 51 E. coli Ingen vækst Rød-Rød 66 E. coli Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 69 E. coli Ingen vækst Ingen vækst Rød-Rød 72 E. coli + + Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 73 E. coli + + Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 81 E. coli + - Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 96 E. coli Gul-Gul 98 E. coli Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 99 E. coli Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 125 K. pneumoniae Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 126 K. pneumoniae Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 127 E. coli Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul 130 K. pneumoniae Ingen vækst Ingen vækst Gul-Gul Side 1 af 1 Bilag 12

94 Bilag 13 Extended Spectrum Beta-Lactamaser (ESBL) en ny trussel af Niels Frimodt-Møller, overlæge, Afd. for Antibiotikaresistens og Sygehushygiejne, Statens Serum Institut, og Dennis Schrøder Hansen, overlæge, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Hillerød sygehus, på vegne af DANRES, antibiotikaresistensudvalg under Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi. De danske klinisk mikrobiologiske afdelinger (KMA er) udførte i septemberoktober 2007 en prævalensundersøgelse, hvor de screenede alle Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae og Proteus mirabilis for ESBL. Undersøgelsen er endnu ikke afsluttet, men Nyhedsavisen er kommet i besiddelse af de foreløbige resultater. Disse viser følgende forekomst af ESBL i Danmark: 13 ud af 15 KMA'er deltog i undersøgeslen, hvilket dækker > 90% af Danmarks befolkning patienter er blevet bloddyrket i september og oktober måned patienter er blevet urindyrket i september og oktober måned Ialt er der fundet 352 (patienter med) ESBL producerende stammer: 257 E.coli stammer 93 K. pneumoniae stammer 2 P. mirabilis stammer Følgende prævalenser er fundet for ESBL-producerende stammer: Bakteriæmier: 4,2 % af E. coli 5,0 % af K. pneumoniae Praksis-uriner: 1,5 % af E. coli 2,7 % af K. pneumoniae Hospitals-uriner: 2,3 % af E. coli 6,6 % af K. pneumoniae P. mirabilis udgør ikke noget stort ESBL problem (i hele landet blev der kun fundet 2 isolater) Antager man den samme fordeling hele året bliver der årligt i Danmark fundet omkring E.coli og K. pneumoniae med ESBL, og det overstiger forekomsten af MRSA (methicilllin resistente Staphylococcus aureus). Baggrund: I midten af 1980 erne blev der i Centraleuropa første gang rapporteret om en ny type beta-laktamaser, de såkaldte Extended Spectrum Beta-lactamaser (ESBL), som ud over de ældre cefalosporiner også inaktiverer de nyeste, bredspektrede såkaldte 3. generations cefalosporiner (cefotaxim, ceftazidim og ceftriaxon) samt monobaktamet aztreonam. De er fordelt mellem alle klasser beta-laktamaser og er karakteriseret ved følgende: 1) at resistensgenerne altid Side 1 af 6

95 Bilag 13 sidder på plasmider og derfor kan overføres mellem bakterier, 2) at disse enzymer hæmmes af beta-laktamase hæmmerne clavulansyre og tazobactam, og 3) at ESBL producerende bakterier er følsomme for carbapenemer men ofte ko-resistente over for aminoglykosider og fluorkinoloner. ESBL forekommer hyppigst i E. coli og Klebsiella spp, men er set i en lang række tarmbakterier samt i Acinetobacter og Pseudomonas spp. ESBL bakterier optræder som en del af tarmfloraen både hos indlagte og inficerede patienter, samt hos raske individer uden for sygehuse. Bærertilstand i tarmen er en risikofaktor for senere infektion med samme ESBL. Imidlertid optræder ESBL infektioner også, hvor patienter ikke har været bærere på forhånd, og det er ikke afklaret, om det kan betale sig at foretage rutinemæssig screening af alle indlagte patienter. På sygehusafdelinger smitter bakterierne mellem patienter ved direkte og indirekte kontakt via personalet, og fremmes af katetre og andre fremmedlegemer. ESBL er først og fremmest et problem ved sygehusinfektioner, hvor de har en tendens til epidemisk optræden. Der har i Danmark i 2007 været en epidemi med ESBL producerende K. pneumoniae på Hillerød sygehus. Infektionerne medfører betydeligt længere indlæggelsestid, med større omkostninger til følge særligt når de optræder på intensivafdelinger. Uden for sygehuse optræder ESBL oftest ved urinvejsinfektioner hos ældre og hos patienter med underliggende lidelser som diabetes mellitus. Mortaliteten ved bakteriæmier forårsaget af E. coli og Klebsiella spp er normalt omkring 20%, men den øges med en faktor 1,5 2 ved ESBL, fordi påvisning af resistensegenskaben tager tid, og fordi de ofte er multiresistente. Mange patienter med ESBL har imidlertid alvorlige underliggende lidelser som medvirkende dødsårsag. Forekomst af ESBL i øvrigt: Enkeltstående prævalensundersøgelser i begyndelsen af 2000-tallet på danske mikrobiologiske afdelinger i København viste forekomster på 0-1% af ESBL hos E.coli, mens en frivillig indsendelse af ESBL-stammer i 2006 til SSI resulterede i omkring 600 isolater. En detaljeret undersøgelse af de første 100 stammer viste, at 80% tilhørte CTX-M typen, der de seneste år har spredt sig i hele Europa. De nye tal fra 2007 tyder på en stigning i forekomsten i Danmark. Forekomsten i Danmark er stadig lav sammenlignet med forholdene i Europa (Figur 1). Som det ses af Figur 1 var der i 2006 meget høje forekomster i Tyrkiet og på Balkan (>25%) og lidt lavere i England og Middelhavslandene (5-10%). ESBL forårsagede en større hospitalsepidemi på universitetssygehuset i Uppsala i Sverige i , og prævalensen i Sverige svarer nu til den danske. Forekomsten af ESBL hos både E. coli og K. pneumoniae er hyppig i lande uden for Europa, specielt i Asien og Sydamerika. Risikofaktorer: Den klart vigtigste risikofaktor for selektion af ESBL bakterier, både som bærertilstand og ved infektion, er forudgående antibiotikabehandling, specielt med cefalosporiner, herunder især cefuroxim, cefotaxim, ceftriaxon og ceftazidim, samt fluorkinoloner (ciprofloxacin). Disse to grupper af antibiotika hører blandt dem, hvor der i Danmark fra på sygehusene er sket den største relative stigning (se figur 2). Af andre risikofaktorer for ESBL er indlæggelse, specielt på intensivafdeling, og tilstedeværelse af fremmedlegemer som blærekatetre, iv katetre, ventrikelsonder mm. Side 2 af 6

96 Bilag 13 Konsekvenser for den enkelte patient: Der er kun få antibiotika, der er aktive over for bakterier med ESBL, idet de er resistente over de fleste beta-laktam antibiotika og ofte resistente over for andre antibiotika som aminoglykosider og fluorkinoloner. Den mest effektive intravenøse behandling er carbapenemer og hvis disse svigter: Polymycin/Colistin. I øvrigt efter resistensbestemmelse. Peroral behandling afhænger af bakteriens antibiotikafølsomhed hvis der er følsomhed for sulfonamid, trimethoprim eller nitrofurantoin, kan disse anvendes til behandling af urinvejsinfektion som vanligt. Konsekvensen for Danmarks antibiotikapolitik: ESBL giver resistens over for vores vigtigste antibiotikagruppe, beta-laktam antibiotika, undtagen carbapenemer. Hvis ESBL-frekvensen stiger yderligere, må den empiriske antibiotikabehandling ændres til anvendelse af carbapenemer. Udbredt anvendelse af disse bredspektrede antibiotika vil imidlertid selektere for beta-laktamaser, der spalter carbapenemer, de såkaldte carbapenemaser, som rammer endnu bredere end ESBL. Dette vil således fortsætte den onde cirkel mod pan-resistente stammer, altså resistente mod alle kendte antibiotika. Tiltag for at forhindre spredning af ESBL: De oplagte interventioner for at forhindre ESBL er reduktion af antibiotikaforbruget generelt, og specielt cefalosporiner og fluorkinoloner, samt oprustning af sygehushygiejnen. Med baggrund i undersøgelsen bør det overvejes, om der skal gøres en målrettet indsats for at reducere antibiotikabrug på sygehuse, både gennem en mere detaljeret overvågning og ved en aktiv kontrol af, hvordan specielt de ovennævnte antibiotika bruges. Tiltagene kan omfatte: I: Interventioner på antibiotikaforbrugsområdet: Prævalensundersøgelser på sygehuse af antibiotikabrug, typer og indikation; udføres regelmæssigt (årligt eller hyppigere). Oprustning på sygehusene vedr. regelmæssig monitorering af antibiotikaforbrug, mængde og type, på alle afdelinger, med kvalificeret (besøg af klinisk mikrobiolog/farmaceut/andre) tilbagemelding monitorering udføres af hospitalsapoteket i samarbejde med klinisk mikrobiologisk afdeling, evt. klinisk farmakologisk afd., hvis en sådan findes. Opdatering af antibiotikainstrukser specifikt mhp. reduktion af forbrug af cefalosporiner, fluorkinoloner og carbapenemer. Stopkoder for anvendelse af nævnte antibiotika: Hver gang de anvendes de novo, meddeler apoteket til klinisk mikrobiolog/infektionsmediciner, der herefter tager stilling til validiteten af behandlingen (dette anvendes på flere amerkanske sygehuse) Ændring af kirurgisk antibiotikaprofylakseregimer, der anvender cefuroxim/fluorkinolon. Oprettelse af Antibiotikapatruljer, der regelmæssigt besøger afdelinger med højt antibiotikaforbrug mhp reduktion af brug. II: Detektion og monitorering af ESBL Alle KMA er kan rutinemæssigt undersøge alle gramnegative tarmbakterier og eventuelle andre gramnegative bakterier (e.g. Ps. aeruginosa) for ESBLproduktion. Screening i alle KMA er for og identifikation af ESBL. Yderligere Side 3 af 6

97 Bilag 13 påvisning med PCR og eventuel typning kan foretages af de KMA er med mulighed herfor. Statens Serum Institut kan hjælpe KMA er med identifikation og eventuel typning af ESBL, og kan påvise de sjældnere typer f.eks. ved hjælp af isoelektrisk fokusering og DNA-sekventering. Meldepligt for patienter med ESBL og laboratoriemeldepligt af ESBL-isolater kan også overvejes mhp. epidemiologisk overvågning. III: Af skærpede hospitalshygiejniske tiltag kan især nævnes: Isolation, måske kohorte-isolation af patienter, der er inficerede eller bærere af ESBL Håndhygiejne, før og efter enhver kontakt med patienter. Forsigtig brug af fremmedlegemer, specielt hvis der er infektion/bærertilstand med ESBL. Rapportering af infektion/bærertilstand med ESBL, når patienter overflyttes, udskrives mm Screening af patienter, der har været indlagt på sygehuse uden for Danmark. Screening af bærertilstand hos andre patienter er diskuteret og kræver yderligere undersøgelser. Eradikationsbehandling af ESBL i tarmen har hidtil ikke haft større succes. Konklusion: Den stigende aktivitet på- og uden for sygehusene har medført en parallel stigning i antibiotikaforbruget, specielt cefalosporiner og fluorkinoloner. Stigningen i prævalensen af ikke blot ESBL, men også MRSA, multiresistente enterokokker og Candida albicans som set i Danmark de seneste år kan alle ses som en konsekvens af stigning i antibiotikaforbrug som vigtigste risikofaktor. En skærpet indsats over for både antibiotikaforbrug og sygehushygiejne bør derfor overvejes og det skønnes stadig muligt at vende udviklingen, som det er på vej til at lykkes for MRSA. Det foreslås således, at overveje en handlingsplan på linie med MRSA-handlingsplanen. Links: De svenske forslag til retningslinier for håndtering af ESBL kan ses på STRAMAs hjemmeside: Side 4 af 6

98 Bilag 13 Figur 1: Forekomst i Europa i 2006 af resistens over for 3. generations cephalosporiner hos E. coli fra bloddyrkninger. Kilde: EARSS ( Side 5 af 6

99 Bilag 13 Figur 2. Udviklingen i antibiotikaforbruget på danske sygehuse fra fordelt på de vigtigste antibiotikagrupper. Ordinaten viser den procentvise ændring i forbruget (Kilde: DANMAP 2006). 30% Percentage of total DDD/1,000 occupied bed-days 25% 20% 15% 10% 5% Penicillins w ith extended spectrum (J01CA) Beta-lactamase sensitive penicillins (J01CE) Macrolides (J01FA) Aminoglycosides (J01GB) Fluoroquinolones (J01MA) Carbapenems (J01DH) Cephalosporins (J01DB, J01DC, J01DD) 0% Side 6 af 6

100 Bilag 14 Billeder taget af ChromID i laboratoriet Escherichia coli kolonier bliver lyserød eller bourgognefarvet. Farveudviklingen for E. coli sker, fordi disse bakterier danner glukuronidase. Billedet til venstre er en E. coli vokset frem med bordeaux kolonier. Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter (KESC) kolonier bliver grønne, brunlig grønne eller blåfarvet. KESC-gruppens farve skyldes, at disse bakterier danner glukosidase. Billedet til venstre er en K. pneumoniae vokset frem med grønne kolonier. Proteeae (Proteus, Providencia og Morganella) giver kolonierne en mørkebrun til lysebrun farve. Stammerne får denne farve, da de udtrykker deaminase Billedet til venstre er en P. mirabilis vokset frem med brune kolonier. E. coli-stammer, som ikke producerer glukuronidase, og Proteus mirabilis (P. mirabilis), som kun udtrykker lav ESβL produktion, kan vokse frem på pladen med farveløse kolonier. Billedet til venstre er en E. coli vokset frem med farveløse kolonier. Nogle Pseudomonas-stammer kan ligne Proteeae, idet de kan vokse frem som brune i deres pigmentering. Hertil bruges igen oxidasetesten til adskillelse. En positiv oxidasetest er Pseudomonas, mens en negativ oxidasetest er Proteeae. Billedet til højre øverst er en P. aeruginosa og nederst er en K. pneumoniae. Side 1 af 2

101 Billeder taget af Brilliance i laboratoriet Bilag 14 Escherichia coli, der både producerer glukuronidase og galaktosidase, giver blåfarvede kolonier. Billedet til venstre er en E. coli vokset frem med blå kolonier. Enterobacter, Serratia og Citrobacter (KESC) producerer galaktosidase, hvilket fremkalder grønne kolonier på Brilliance TM ESβL Agar. Billedet til venstre er en K. pneumoniae vokset frem med grønne kolonier. Escherichia coli, der både producerer glukuronidase og galaktosidase, giver blåfarvede kolonier. Hvis galaktosidasen er mest dominerende ses grøn pigmentering rundt om de blå kolonier. Billedet til venstre er en E. coli vokset frem med blå kolonier med grønt omkring. E. coli, der kun producerer glukuronidase, giver pink kolonier. Den slags bakterier så vi ikke nogle af, men der voksede blå kolonier frem med pink omkring. Billedet til venstre er en E. coli vokset frem med blå kolonier med grønt omkring. Proteus, Morganella og Providencia vokser med brunlige kolonier. Til farvereaktionen udnyttes det faktum, at bakterierne er i stand til at deaminere tryptohan Billedet til venstre er en P. mirabilis vokset frem med brune kolonier. Ikke-ESβL producerende Pseudomonas-stammer kan også vokse på mediet pga. andre kromosomal resistensmekanismer. Disse kan vokse frem med: Farveløs, orange, brun eller grønbrune kolonier. Billedet til venstre er en P. aeruginosa vokset frem med brune kolonier. Side 2 af 2

102 Bilag 16 Side 1 af 4

103 Bilag 16 Side 2 af 4

104 Bilag 16 Side 3 af 4

105 Bilag 16 Side 4 af 4

106 Bilag 17 Side 1 af 4

107 Bilag 17 Side 2 af 4

108 Bilag 17 Side 3 af 4

109 Bilag 17 Side 4 af 4

110 Bilag 18 Side 1 af 1