Detektion af Dichelobacter nodosus og sanering for ondartet klovsyge i tre danske fårebesætninger

Detektion af Dichelobacter nodosus og sanering for ondartet klovsyge i tre danske fårebesætninger Øystein Angen 1, nadja Bengtson AkkAd 2, RAndi WoRm 2, Anne nymand 2, sara FRosth 3, AnnA Aspán 4, jannice schau slettemeås 5, hannah jørgensen 6 og ilka christine klaas 7 1 dyrlæge, ph.d., seniorforsker og FAggRuppeledeR, dtu VeteRinæRinstituttet 2 dyrlæge, city VeteRinäReRnA i lund, sverige 3 FoskningsingeniØR, statens VeteRinäRmedicinskA AnstAlt, uppsala 4 FoRskeR, ph.d., statens VeteRinäRmedicinskA AnstAlt, uppsala 5 FoRskeR, cand. scient., VeteRinæRinstituttet, oslo 6 dyrlæge, ph.d., VeteRinæRinstituttet, oslo 7 dyrlæge, ph.d., lektor, ku life Sammendrag Sanering for ondartet klovsyge blev gennemført i tre danske fårebesætninger. Metoder til dyrkning og realtime PCR-detektion for bakterien Dichelobacter nodosus blev etableret på Veterinærinstituttet, og bakterien blev for første gang isoleret i Danmark. Alle dyr blev undersøgt klinisk to gange og klovene vurderet ud fra en 5-trinsskala. Prævalensen af angrebne dyr (score 2) var 24 %, 64 % og 29 % i flok 1, 2 og 3. Blandt får med karakteristiske ildelugtende, underminerede læsioner svarende til klovsyge-score 3 blev 96 % fundet positive for D. nodosus ved real-time PCR. Alle får behandledes med 10 % zinksulfat klovbad og oxytetracyklin i.m. Ved besætningsbesøget efter sanering havde kun et får klovsygescore 2. Kun en af de tre besætninger har efterfølgende benyttet karantæne ved indkøb af dyr, og 1 år efter sanering er kun denne fortsat symptomfri og PCR-negativ. Abstract An eradication project was applied in three Danish sheep farms affected with footrot. Methods to detect Dichelobacter nodosus by culture and real-time PCR were established at the National Veterinary Institute and the organism was detected for the first time in Denmark. All sheep were examined twice and all hoofs assessed using a 5-point scale. The prevalence of affected sheep was 24 %, 64 % and 29 % in herd 1, 2 and 3, respectively. Among sheep with characteristic, undermined, foul-smelling lesions (hoof-score 3) 96 % were positive for D. nodosus in the real-time PCR. All sheep were treated with 10 % zink-sulphate hoofbath, and oxytetracycline i.m. After treatment only one sheep had a hoof score 2. One year after the eradication project only one herd, which has implemented quarantine restrictions, is still PCR negative and free of clinical signs. 28 DVT 08 2011

Introduktion Ondartet klovsyge er en infektiøs lidelse i klovene hos får. Sygdommen forårsages af den Gramnegative og strikt anaerobe bakterie Dichelobacter nodosus (1). Udvikling af sygdom er afhængig både af virulensegenskaber i bakterien og miljøfaktorer, dyrets modtagelighed og tilstedeværelsen af andre bakterier (fx Fusobacterium necrophorum) (6,16). Infektionen fører initialt til inflammation og nekroser af den interdigitale hud. Derefter vil proteolytiske enzymer kunne føre til beskadigelse af klovhornet og i værste fald føre til at klovhornet løsner sig fra det underliggende væv (3). Figur 1. Brug af fårevender til undersøgelse af klove og prøvetagning. Infektionen fører til alvorlig smerte og ubehag hos dyrene og manifesterer sig ofte som forskellige grader af halthed hos fårene. Ondartet klovsyge giver alvorlige velfærdsproblemer og produktionstab for fåreproducenter over hele verden (17). Sygdommen har som regel størst betydning i et fugtigt og varmt klima. I Norge har sygdommen fået stor opmærksomhed de seneste år og undersøgelser har vist at ca. 10 % af alle fårebesætninger i Sydnorge er smittet med bakterien. Der er påvist sammenhæng mellem kliniske fund og virulens af bakterien, og en virulent form af klovsyge er til nu påvist i 70 besætninger (5). Også i Sverige er der blevet gennemført nationale studier af forekomst og betyd- ning af sygdommen (8). Lignende undersøgelser er ikke gennemført i Danmark, men meget tyder på, at sygdommen er vidt udbredt også her til lands. I 2009 begyndte et projekt finansieret af Fåreafgiftsfonden, der ville afprøve en metode til sanering for ondartet klovsyge i danske besætninger. I forbindelse med sanering for D. nodosus i tre af disse besætninger, gennemførte en dyrlægestuderende et specialestudium som et samarbejde mellem KU LIFE og DTU Veterinærinstituttet. I løbet af projektet blev metoder for dyrkning og PCR-påvisning af D. nodosus etableret på Veterinærinstituttet, og relationen mellem forekomst af D. nodosus, klinik og sanering undersøgt. Materialer og Metoder Fårebesætninger Forudsætningen for deltagelse i projektet var at besætningerne havde haft ondartet klovsyge eller mistanke om et udbrud, ikke var nabo til andre besætninger med ondartet klovsyge, ikke indkøbte dyr i forsøgsperioden, og at der ikke græssede andre dyr sammen med fårene. Tre besætninger opfyldte kravene og var villig til at deltage i projektet med systematiske undersøgelser og behandlinger til at nedbringe sygdommen i deres besætninger. Besætning 1 lå i Ebeltoft og bestod af 34 får (Suffolk). Flokken var ikke tidligere behandlet for klovsyge. Besætning 2 lå i Kolind og bestod af 47 får (Suffolk). Flokken var ikke tidligere behandlet for klovsyge. Besætning 3 lå i Midtjylland og bestod af 206 får over 2 måneder samt 10-15 nyfødte lam (hovedsageligt Dorset og Suffolk). Flokken havde tidligere haft problemer med klovsyge. Klinisk undersøgelse og prøveindsamling To kliniske undersøgelser og prøveindsamlinger blev foretaget i de tre besætninger med 3-5 ugers mellemrum i efteråret 2009. Totalt blev 287 får undersøgt ved første besøg og 284 får ved andet besøg (3 får i besætning 3 var blevet udsat). Alle får blev lagt på ryggen med en fårevender (Figur 1). Snavs blev fjernet fra klove og interdigitalområdet med en tør papirserviet inden Figur 2. Prøvetagning til PCR. inspektion af området og prøvetagning. Klovlæsioner blev vurderet ud fra en skala fra 0-5, se faktaboks (19). Til de statistiske analyser blev både score fra den værst angrebne klov (MKS: maksimal klovsyge-score) og summen af score fra alle fire fødder (TKS: total klovsyge-score) benyttet. Materiale til dyrkning for D. nodosus blev udtaget med kulsvaber (Transwab ) fra alle klove med klovsygescore 3 og højere. Prøvemateriale til PCR blev ud- taget fra alle dyr ved hjælp af sterile træpinde (Figur 2). To pinde blev brugt til henholdsvis forben og bagben, begyndende med den klov, der havde den laveste klovsygescore. Prøverne blev taget så dybt i det nekrotiske lag som muligt. Begge pinde blev overført til et rør med 2 ml PSB tilsat 20 mm EDTA Behandling Efter prøvetagningen blev alle forvoksede klove beskåret. Alle dyr blev derefter injiceret i.m. med Aquacyclin Vet (100 mg/ml oxytetracycline hydrochloride). Lammene fik 15 ml og voksne dyr 20-25 ml. Efter antibiotikabehandlingen blev alle dyr ledt gennem et fodbad med 10 % zinksulfat (Golden Hoof ), hvor de stod i minimum 20 min (Figur 3). Efter fodbadet stod alle dyr på et tørt underlag i mindst 30 minutter Figur 3. Fodbad. > DVT 08 2011 29

og blev derefter overført til et græsningsareal, som ikke havde været brugt af klovbærende dyr de sidste to uger. Alle dyr med klovsygescore 3 blev isoleret fra resten af flokken i hele saneringsperioden. Staldene blev rengjort og gulvene desinficeret med en vandig opløsning af calciumhydroxid, og væggene blev kalket. Staldene stod derefter tomme i mindst 10 dage. Efter 14 dage blev alle dyr genbehandlet med Aquacyline Vet og passerede fodbad, og dyrene blev overført til en ny fold, på samme måde som beskrevet ovenfor. Ved den anden prøvetagning passerede alle dyr i besætning 1 og 2 gennem et fodbad. Udvalgte dyr i de tre besætninger modtog en tredje injektion med Aquacycline Vet. I besætning 1 blev kun de dyr, der fortsat havde klovsygescore 1 behandlet. I besætning 2 og 3 blev alle får, der havde haft hhv. klovsygescore 2 og klovsygescore 3 ved første besøg genbehandlet. I besætning 3 blev alle lam, samt de dyr, der havde forandringer i klove eller interdigitalt, behandlet topicalt med Cyclospray Vet (klortetracyclin). PCR undersøgelser Træpindene blev fjernet og PBS-bufferen kogt i 10 min. Prøven blev centrifugeret i 3 min ved 10.000 g og brugt som template til PCR ufortyndet og fortyndet 1:10. DNA blev yderligere oprenset fra 107 prøver ved at opsamle bundfaldet fra prøverørene ved centrifugering i 15 min ved 15.000 g, resupendering i 400 µl PBS, behandling med Tissue lyser og oprensning med Qiagen Virus/Bacteria Mini-kit ved hjælp af QiaSymphony DNA ekstraktionsrobot. Alle 571 prøver blev undersøgt med en real-time PCR specifik for D. nodosus 16S rdna. (Metoden er udviklet i et samarbejde mellem Statens Veterinärmedicinska Anstalt i Uppsala og Veterinærinstituttet i Oslo og er endnu ikke publiceret.) Analyserne blev udført på en Roto-Gene 3000 real-time DNA detector. PCR-resultatet angives som den cykel, hvor signalet passerer detektionsgrænsen. En lav Ct-værdi svarer til høj mængde DNA i prøven og en høj Ct-værdi til en lav DNA-mængde. Prøver med en Ct-værdi <38 blev regnet som positive. Dyrkningsundersøgelser Dyrkning blev forsøgt fra kulsvabre fra alle dyr (n=44), der havde en klovsygescore 3. Dyrkning blev foretaget på et beriget specialmedium (TASH-medium) tilsat tørrede og pulveriserede fåreklove (15). Til primær isolation blev der tilsat 4 % agarose til mediet (4 % TASH-agar) og til Tabel 1: Fordeling af klovsyge score i tre fårebesætninger før sanering, antal (%). Score 0 Score 1 Score 2 Score 3 Score 4/5 Flok 1 15 (44) 11 (32) 3 (9) 5 (15) 0 (0) Flok 2 5 (11) 12 (26) 18 (38) 10 (21) 2 (4) Flok 3 81 (39) 66 (32) 26 (13) 20 (10) 13 (6) Klovsyge score svarer til benet med den højeste score. Figur 4. Primærudsæd på 4 % TASH agarplader, Figur pilene 4 viser Dichelobacter vækst af Dichelobacter DVT nodosus. FOTO: MARIANNE GILHUUS Figur 5. Vækst af Dichelobacter nodosus i renkultur på 2 % TASH agarplader. subkultivering af isolater blev plader med 2 % agarose benyttet (2 % TASH-agar). Udsæd foregik ved at opsamle materiale fra kulsvaberen med en lige podenål og afsætte to vertikale streger på agarpladen. Efter at have opsamlet mere materiale fra kulsvaberen blev dette afsat i to horisontale streger på pladen samt i en cirkel langs pladens kant. Alle plader blev dyrket ved 37 C i 5-7 dage under strikt anaerobe forhold (80 % N 2, 10 % CO 2 og 10 % H 2 ). D. nodosus vokser på TASH-mediet som flade, sværmende kolonier og voksede efter 3-5 dage længere ud fra udsædstregen end den bakterielle følgeflora (Figur 4). Suspekte, sværmende kolonier blev undersøgt i mørkefeltmikroskop - og karakteristiske stavformede bakterier blev subkultiveret på 2 % TASH- Tabel 2. Klinisk score og antal dyr positive for Dichelobacter nodosus ved PCR før og efter sanering. Før sanering Efter sanering Besætning n % angrebne a MKS b TKS c % PCR + % angrebne a MKS b % PCR + 1 34 24 1,0 (1,0) 1,7 (1,8) 24 0 0,1 (0,1) 6 2 47 62 1,8 (1,0) 4,1 (3,0) 100 0 0,0 (0,1) 11 3 206 d 29 1,1 (1,2) 2,6 (3,4) 47 1 0,1 (0,3) 7 Total 287 d 34 1,3 (1.2) 3,0 (5,5) 53 0 0,1 (0,2) 8 a Defineret som klovsyge score 2, b Gennemsnitlig maksimalt klovsyge score (SD)., c Gennemsnitlig totalt klovsygescore (SD)., d Efter sanering blev der kun undersøgt 204 får i besætning 3, totalt 284 dyr i alle besætninger. 30 DVT 08 2011

Tabel 3: Får positive for Dichelobacter nodosus ved real-time PCR før sanering, antal (%). Alle får Angrebne får Flok 1 8 (24 %) 6 (75 %) Flok 2 47 (100 %) 30 (100 %) Flok 3 97 (47 %) 43 (72 %) Alle flokke 152 (81 %) 79 (31 %) Tabel 4: Gennemsnitlig Ct værdi i real time PCR for Dichelobacter nodosus i de tre flokke før sanering. Alle får Angrebne får Flok 1 31.8 29.8 Flok 2 30.3 29.9 Flok 3 32.8 29.9 Angrebne får: klovsyge score 2. agarplader (Figur 5). Rendyrkede kolonier blev efterfølgende identificeret som D. nodosus med real-time PCR. Virulenstesting Fjorten rendyrkede isolater blev sendt til Veterinærinstituttet i Oslo for virulenstesting. Isolaterne blev undersøgt ved en gelatinase test (13) og en undersøgelse for forekomst af IntA-genet med PCR (2). Statistik Alle statistiske analyser blev udført med SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, 2004). RESULTATER Undersøgelser foretaget før sanering Der var kliniske tegn på ondartet klovsyge i alle tre besætninger (Tabel 1). Prævalensen af angrebne dyr var 24 %, 64 % og 29 % i flok 1, 2 og 3. De højeste værdier for både maksimal klovsyge-score (MKS) og total klovsyge-score (TKS) blev fundet i besætning 2 (Tabel 2). Alle dyr i besætning 2 var positive for D. nodosus ved PCR, mens hhv. 24 % og 47 % var positive i besætning 1 og 3 (Tabel 2). Der var en signifikant højere prævalens af PCR-positive prøver blandt klinisk afficerede dyr (score 2) end blandt dyr med normale klove (hhv. 81 % og 31 %; p<0,001, Fisher s exact test) (Tabel 3). Ctværdiene for de positive prøver lå i intervallet 23,3 til 38,0 (en højere værdi svarer til en lavere mængde D. nodosus-dna i prøven). Prøver fra de angrebne får havde en lavere Ct-værdi end de øvrige dyr (Tabel 4). En høj MKS og TKS score var associeret med en lavere Ct-værdi. For alle flokke under et svarede en øgning af MKS på 1,0 til en reduktion af Ct-værdien på 0,63 (p<0,001, Spearman korrelationstest). Dyrkning blev foretaget fra 44 prøver før sanering (fra dyr med klovscore 3). Der voksede D. nodosus-lignende kolonier fra 41 af disse prøver. Det lykkedes at rendyrke D. nodosus fra totalt 22 af disse prøver. Fjorten af disse isolater blev sendt til Veterinærinstituttet i Oslo for virulenstesting. Af disse viste 13 sig at producere termostabil gelatinase og seks testet positive for IntA-genet ved PCR. Isolater med begge virulensfaktorer blev påvist i alle tre flokke. Undersøgelser efter sanering Ved anden prøvetagning var stort set alle får symptomfri (Tabel 2). Kun et får havde øget klovsygescore fra 1. til 2. besøg (fra MKS 1 til 2). Tre får, der havde haft MKS 3 eller 4 før sanering, havde fortsat svage kliniske symptomer ved 2. besøg (MKS=1). Der var en signifikant reduktion i antal PCR-positive dyr (fra 152 til 23) fra 1. til 2. besøg (p<0,001, Mc Nemars test). Alle Ctværdier ved 2. besøg var høje (gennemsnit 37,4, sd=0,4). Blandt de 11 dyr, der var PCR-positive ved begge prøveudtagninger, var Ct-værdien signifikant forøget (gennemsnit 6,6; p<0,01, parret t-test). En moderat forøget huldscore blev observeret mellem 1. og 2. besøg for dyr, der havde haft klovsyge-score 3 før sanering (p=0,04, parret t-test). Effekt af DNA oprensning. DNA blev oprenset med QiaGene Mini kit fra 47 prøver udtaget fra besætning 1 før sanering, men dette førte ikke til en signifikant øgning i antal PCR-positive prøver. Blandt de prøver, der var positive både før og efter DNA-oprensning, blev der fundet en signifikant lavere Ct-værdi efter oprensning (p<0,001, parret t-test). DNA blev også oprenset med samme metode fra 60 prøver fra besætning 3 efter sanering. Dette var alle de prøver, hvor undersøgelse af kogelysaterne havde resulteret i svagt positive Ct-værdier (>36), eller hvor fårene havde haft klovsyge-score 3 før sanering. Alle disse prøver viste sig at være negative (Ct 38), når de blev testet efter oprensning. DISKUSSION Isolation af D. nodosus Dette er den første rapport om isolation af D. nodosus i Danmark. For at rendyrke stammerne var det nødvendigt at fremstille subkulturer fra den yderste del af sværmzonen (Figur 4). I dette område var bakterierne forholdsvis kokkoide i form, noget der sandsynligvis svarer til en tidlig vækstfase. Mere centralt i kolonierne fandtes de for D. nodosus karakteristiske, lange stave, men her kunne man i tillæg finde andre bakterier af varierende størrelse og form. Tilsætning af 4 % agarose hæmmede sværmningen af følgefloraen og gjorde det nemmere at isolere D. nodosus Klovsygescore I litteraturen er der ingen konsensus om, hvornår man skal definere et dyr som»angrebet«, og hvornår en læsion er»alvorlig«. Marshall et al. (11) klassificerede får med en klovsygescore 2 som»angrebet«(affected). Denne grænse blev også brugt i dette projekt. Andre regner et score 3 for at være bedre, da dette svarer til forekomst af de karakteristiske underminerede klovlæsioner (19). Woolaston (22) mente på den anden side, at et får med klovsygescore 1 bør betragtes som angrebet. > DVT 08 2011 31

Fakta om ondartet klovsyge Ved ondartet klovsyge udvikles typiske klovlæsioner og disse kan klassificeres i et graderingssystem. Ved grad 1-2 er læsionerne begrænset til klovspalten og ved grad 3-5 er også sålen angrebet (19). (Foto: Ulrika König, Grad 3b: Helen Björk Averpil) Grad 1. Grad 2. Grad 0: Ingen tegn til ondartet klovsyge. Grad 1: Mild inflammation med fugtighed, rødme og hårtab interdigitalt. Grad 2: Nekrotiserende inflammation med skade på det bløde horn på klovens indervæg. Grad 3: Underminering og moderat vævsskade på klovens indervæg og sål. Kan underinddeles i grad 3a-3c efter udbredelsen af skaden på sålen. Grad 4: Underminering og mere alvorlig vævsskade, der når sålens yderkant. Grad 5: Meget alvorlig vævsskade med underminering, der når ned til de dybe vævslag og tåens yderside. Grad 3b. Grad 3c. Grad 0. Grad 4. Grad 5. 32 DVT 08 2011

Sammenhæng mellem klovsygescore og PCR resultat I alt var 48 ud af 50 dyr (96 %) med klovsygescore 3 positive for D. nodosus ved PCR. Kun 66 % af alle får med en klovsygescore 2 var PCR-positive, og hvis der korrigeres for flok 2, falder dette tal til 45 %. Dette pludselige fald i D. nodosus prævalens mellem score 3 og 2 kan skyldes vanskelighederne med at differentiere mild klovsyge (uden underminering af horn) fra interdigital dermatitis. Disse to sygdomme omfatter kun betændelse i den interdigitale hud og er stort set umuligt at adskille, baseret på kliniske tegn alene (4,14,17). Det er ikke usandsynligt, at mange får, der blev diagnosticeret med klovsyge-score 2, i virkeligheden havde interdigital dermatitis. De læsioner, der definerer score 2, er relativt overfladiske, og risikoen for at prøven kontamineres fra omgivelserne relativt stor. De fleste PCR positive prøver fra dyr med klovsygescore 2 var kun positive ved 1:10 fortynding. Dette kan tyde på kontamination af prøverne fra omgivelserne. På baggrund af disse resultater ville en nedre grænse på score 3 være mere pålidelig til at definere et får som værende»angrebet«. Før sanering blev der påvist en sammenhæng mellem klovsygescore og prævalens af D. nodosus ved PCR i besætning 1 og 3. I besætning 2 blev derimod alle dyr fundet PCR-positive. Dette skyldes sandsynligvis, at prøveudtagningen i besætning 2 foregik på en regnvåd dag. Alle dyr havde før prøveudtagningen opholdt sig på et meget mudret område, og klovene var meget beskidte ved undersøgelsen. Det har derfor kunnet ske en spredning af D. nodosus fra klinisk afficerede dyr til de andre dyr i besætningen via underlaget. Mange får med lav klovsygescore blev også testet positiv ved PCR. Antal PCRpositive dyr med klovsygescore på 0 og 1 var hhv. 38 og 40 %. En mulig årsag til dette kunne være, at fårene var i en tidlig fase af sygdomsforløbet. En anden mulighed er, at de forekommende stammer var lavvirulente og med begrænset proteolytisk kapacitet. Flere undersøgelser (9,12,23) har vist, at flere forskellige stammer med varierende virulens kan forekomme i en og samme flok. Undersøgelsen af virulensfaktorer tyder på, at der forekommer stammer med varierende virulens også i de tre danske fårebesætninger. Kontamination fra omgivelserne kan også være en forklaring. Det blev bemærket i flok 3, at får med lav klovsygescore, der blev holdt sammen med hårdt angrebne dyr forud for prøveudtagningen, i højere grad end andre dyr i besætningen blev testet positiv ved PCR. Disse får blev opstaldet sammen indendørs i grupper på 10-30 dyr til omkring 12 timer før undersøgelsen fandt sted, hvilket muliggjorde spredning af inficeret materiale fra de angrebne dyr til strøelsen og de andre dyr. Oprensning af DNA Oprensning af prøverne førte ikke til et højere antal positive testresultater. De PCR-positive prøver efter DNA-oprensning adskilte sig dog fra de ikke-oprensede ved at have klart lavere Ct-værdier, hvilket er at forvente som resultat af, at inhibitorerne fjernes. Alle 60 prøver, der blev udvalgt fra flok 3 efter sanering, blev fundet negative efter DNA-oprensning. Disse prøver stammede fra får, der havde klovsyge-score 3 ved 1. besøg, samt prøver der havde meget høje Ct-værdier før DNA-oprensningen. Dette kan skyldes, at en DNAoprensning i en vis grad vil reducere prøvernes DNA-indhold, hvilket kan påvirke testens sensitivitet ved lave bakteriekoncentrationer. Baseret på disse resultater er det nærliggende at konkludere, at det ikke er påkrævet at lave DNA-oprensning forud for PCR-kørslen for at opnå en pålidelig diagnose, forudsat at man sørger for at undgå inhibition ved at udtage prøver fra så rene klove som muligt. Effekt af sanering I denne undersøgelse havde 80 % af alle får en klovsygescore på 0 ved andet besøg, og 92 % af alle dyr blev fundet negative ved PCR. Saneringsprogrammet viste sig derfor at være effektivt til at kurere selv meget alvorlige læsioner, samt i stor grad at fjerne D. nodosus fra de angrebne klove. Kun 22 af prøverne fra andet besøg (8 %) var positive ved PCR. Noget overraskende kom kun to af disse prøver fra får med MKS på 3 under det første besøg. Det indikerer, at selv svært inficerede dyr har en chance for at komme sig, hvis et omfattende behandlingsprogram med parenteral antibiotikabehandling, fodbade, isolation og rent græsningsareal bliver gennemført. Det stemmer overens med udenlandske anbefalinger om, at det kun er kronisk syge dyr, der bør udsættes (4,18,20,21). Ved behandling af store flokke er det vanskeligt at sikre, at alle dyr behandles korrekt. En injektion kan blive glemt, nogle dyr opholder sig måske ikke lang nok tid i fodbadet, og zinksulfatopløsningen kunne være utilstrækkelig til at garantere en effektiv behandling til de får, der blev behandlet sidst. Den periode, hvor denne sanering fandt sted, var heller ikke klimamæssigt optimal. Selvom den gennemsnitlige daglige temperatur var under 10 C det meste af tiden, var den gennemsnitlige nedbør meget høj i løbet af denne periode. Fugtighed er den mest almindelige årsag til svækkelse af den interdigitale hud, og gør det muligt for bakterier som F. necrophorum og D. nodosus at trænge ind i klovene (6,17). Den eneste veldokumenterede regionale sanering er blevet gennemført i New South Wales, Australien, i et område, hvor en veldefineret, tør, ikke-transmissionsperiode er til stede i flere måneder hvert år (10). Britiske undersøgelser viser også, at det kan være meget vanskeligt at udrydde klovsyge fra flokke i det nordvestlige Europa, hvor klimaet favoriserer transmission af D. nodosus det meste af året (7). Behandlingen, der er foretaget i denne undersøgelse var baseret på tidligere erfaringer fra danske fårepraktiserende dyrlæger. Den stemmer godt overens med udenlandske behandlings- og saneringsanbefalinger, dog er det her ikke almindeligt, at får uden alvorlige læsioner behandles med antibiotika (4,17,20). Konklusion Metoder til at detektere D. nodosus er nu blevet etableret på DTU Veterinærinstituttet, hvilket gør det nemmere at diag- > DVT 08 2011 33

nosticere ondartet klovsyge i fremtiden. DNA fra D. nodosus kunne påvises selv fra får uden synlige tegn på klovsyge. Real-time PCR kan derfor være af stor værdi for at opdage infektionen på et tidligt stadium, og dermed bidrage til at mindske risikoen for overførsel og etablering af infektionen i en flok. Det blev også vist, at klove med helede læsioner stadig kan indeholde D. nodosus, og at en klinisk undersøgelse alene derfor ikke er nok at erklære et får frit for ondartet klovsyge. Hvis karakteristiske ildelugtende, underminerede læsioner, svarende til klovsygescore 3 er til stede, kan fårene med meget høj sikkerhed diagnosticeres som værende smittet med D. nodosus, da 96 % af disse dyr blev testet positiv ved realtime PCR. Stigende klovsygescore var generelt forbundet med både en øgende sandsynlighed for en positiv PCR-påvisning og faldende Ct-værdier. En interessant konklusion fra dette projekt er, at det ikke er absolut påkrævet at foretage DNA-oprensning før PCR, noget der væsentligt forenkler analysen af prøverne. Efterskrift Et og et halvt år er nu gået siden de tre besætninger blev forsøgt saneret. Besætning 1 har ingen symptomer haft siden saneringen og har overholdt strikt karantæne og prøvetagning af indkøbte dyr. Ved test af 8 af besætningens egne dyr (pool PCR) var denne negativ. Besætning 2 og 3 har kliniske symptomer og må betragtes som reinficeret. Disse besætninger har fortsat med indkøb af dyr, hvor dyrene kun er blevet behandlet med fodbad og uden yderligere karantæneforanstaltninger. Besætning 2 har tilsyneladende fået en mere virulent stamme ind med deraf følgende meget alvorlige haltheder og skader i klovene sammenlignet med tidligere tilfælde. REFERENCER 1.Beveridge, W.I.B. Footrot in sheep: a transmissible disease due to infection with Fusiformis nodosus (n.sp.), 1941, Bulletin of Council for Scientific and Industrial Research (Australia), 140, 1-56. 2. Cheetham, B.F., Tanjung, L.R., Sutherland, M., Druitt, J., Green, G., McFarlane, J., Bailey, G.D., Seaman, J.T., Katz, M.E. Improved diagnosis of virulent ovine footrot using the inta gene, 2006, Veterinary Microbiology, 116, 166-74. 3. Egerton, J.R., Parsonson, I.M. Benign footrot a specific interdigital dermatitis of sheep associated with infection by less proteolytic strains of Fusiformis nodosus, 1969, Australian Veterinary Journal, 45, 345-349. 4. Egerton, J.R. Diseases of the feet. In: Aitken, I.D. (ed), Diseases of Sheep (4th ed.), 2007, Blackwell, Oxford, 273 281. 5. Friske føtter Statusrapport nr. 3, 2011, Veterinærinstituttet, Oslo. 6. Graham, N.P.H., Egerton, J.R. Pathogenesis of ovine foot-rot: The role of some environmental factors, 1968, Australian Veterinary Journal, 44, 235-240. 7. Hosie, B. Footrot and lameness in sheep: summary of a workshop, 2004, Veterinary Record 154, 37-38. 8. König, U., Björk Averpil, H. Fotröta i svenska fårbesättningar 2007-2008, sanering och friskförklaring, 2009, Slutrapport till Stiftelsen Svensk Fårforskning. 9. Links, I.J, Morris, S. Assessment of gelatin gel and and elastase tests for detection of protease activity of Dichelobacter nodosus isolates from ovine footrot, 1996, Veterinary Microbiology, 51, 305-318. 10. MacDonald, I. Footrot controlled in NSW after 20 year battle, New South Wales Media Release 28 July 2009. 11. Marshall, D.J., Walker, R.I., Cullis, B.R., Luff, M.F. The effect of footrot on body weight and wool growth of sheep, 1991, Australian Veterinary Journal, 68, 45-49. 12. Moore, L.J., Wassink, G.J., Green, L.E., Grogono-Thomas, R. The detection and characterisation of Dichelobacter nodosus from cases of ovine footrot in England and Wales, 2005, Veterinary Microbiology, 108, 57-67. 13. Palmer, M.A. A gelatin test to detect activity and stability of proteases produced by Dichelobacter (Bacteroides) nodosus, 1993, Veterinary Microbiology, 36, 113-22. 14. Parsonson, I.M., Egerton, J.R., and Roberts, D.S. Ovine interdigital dermatitis, 1967, Journal of Comparative Pathology, 77, 309-313. 15. Pitman, D.R., Palmer, M.A., Depiazzi, L.J. The laboratory culture of Dichelobacter nododus in a footrot eradication program. Australian Veterinary Journal, 71, 109-112. 16 Raadsma, H.W. Genetic aspects of resistance to ovine footrot. In: Axford, R.F.E., Bishop, S.C., Nicholas, F.W., Owen, J.B. (eds.), Breeding for resistance in farm animals (2nd ed.), 2000, 219-241. 17. Stewart, D.J. Footrot of sheep, In: Egerton, J.R., Yong, W.K., Riffkin, G.G. (eds.), Footrot and foot abscess in ruminants, CRC press, Boca Raton, FL, 1989, 5-46. 18. West, D.M., Bruère, A.N., Ridler, A.L. Chapter 12: Foot diseases, In: The sheep (2nd ed.), 2002, Veterinary Continuing Education, Massey Universityu, New Zealand. 19. Whittington, R.J., Nicholls, P.J. Grading the lesions of ovine footrot, 1995, Research in Veterinary Science 58, 26-34. 20. Winter, A. Chapter 8: Footrot. In: Lameness in sheep (1st ed.), Wiltshire, Great Britain, The Crowood Press Ltd, 2004, 52-63. 21. Winter, A.C. Lameness in sheep, 2008, Small Ruminant Research, 76, 149-153. 22. Woolaston, R.R. Factors affecting the prevalence and severity of footrot in a Merino flock selected for resistance to Haemonchus contortus, 1993, Australian Veterinary Journal, 70, 365-369. 23. Zhou, H., Hickford, J.H.G. Extensive diversity in New Zealand Dichelobacter nodosus strains from infected sheep and goats, 2000, Veterinary Microbiology, 71, 113-123. 34 DVT 08 2011