Staphylococcus aureus (MRSA) i

Transkript

1 Effektiv og økonomisk rentabel påvisning af methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) i svinebesætninger Summary To identify a cost-effective and practical method for detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in pig herds, the diagnostic sensitivity of four sample types; nasal-, ear-skin (skin behind the ears)-, environmental dust-swabs and air was tested and compared. Moreover, dependency of sensitivity on the within herd prevalence was estimated. The sensitivity of testing one air sample was similar to the sensitivity of testing 10 pools of five nasal swab and relatively independent on the within herd prevalence (predicted to be nearly perfect (99 %) for within herd prevalence 25 %). The results indicate that, taking swabs of skin behind the ears (10 pools of five) was even more sensitive than taking nasal swabs (10 pools of five) on herd level and detected significantly more samples positive. In conclusion, MRSA detection by air sampling is easy to perform, reduces costs and analytical time compared to existing methods and is recommended for screening of herds. MRSA negative herds could be supplemented by ear-skin swab sampling to increase the diagnostic sensitivity. Indledning Antallet af samfundserhvervede humane MRSA-infektioner i Danmark er stadigt stigende, og i mange tilfælde stammer smitten fra landbruget (1). I svineproduktionen ses også en stigning i antallet af MRSA-positive svin ved slagtning, viser DANMAP-rapporten fra 2012 fra DTU Fødevareinstituttet og Statens Serum Institut (1). Handel med MRSA-positive svin bidrager voldsomt til spredningen og den fortsatte stigning i antallet af positive svinebesætninger (2, 3, 4). For at dæmme op for denne udvikling og iværksætte effektive interventioner er det nødvendigt at have en pålidelig metode, der med stor sikkerhed kan bestemme en svinebesætnings MRSA-status. De metoder, der anvendes i dag, er dyre og ikke særlig sensitive, og samtidig er prøveudtagningen både tidskrævende og upraktisk. Nye studier har vist, at man ved at undersøge luftprøver fra svinestaldene og svabre huden bag svinenes ører kan øge sensitiviteten af MRSA-undersøgelsen (5, 6). I indsatsen for at finde en effektiv og økonomisk rentabel metode til at bestemme svinebesætningers MRSA-status har vi testet en række prøvetyper; næse- og øresvabere, støv og luft, og analyseret dem med både klassiske mikrobiologiske dyrkningsmetoder og real-time PCR. 28 DVT FOTO: COLOURBOX

2 Metoder Prøveudtagning Der indgik 48 konventionelle svinebesætninger i undersøgelsen, hvoraf 46 var blevet fundet MRSA-positive indenfor de sidste 4 år enten i besætningen eller på slagteriet. Fødevarestyrelsens regionale mikrobiologiske laboratorium forestod prøveudtagelsen i perioden september til november For at undgå at overføre smitte blev der kun taget prøver fra én besætning om dagen. Dyreprøver Næsesvabere. I hver besætning blev der prøvetaget i 10 individuelle staldafsnit som følger: 5 svin per staldafsnit blev svabret i begge næsebor. De 5 næsesvabere fra samme staldafsnit blev samlet til én prøve i et transportrør (10 ml Mueller- Hinton (MH) bouillon + 6,5 % NaCl), og analyseret på det regionale mikrobiologiske laboratorium samme dag. Øresvabere. Fra 25 besætninger blev der fra de samme svin, som der blev taget næsesvabere fra, også svabret på huden bag øret (ca. 2 cm hud fra ørekant til øre- Sartorius MD8 Airport Portable Air Sampler blev brugt til at tage prøver af luft I besætningerne. Luftsampleren blev placeret i det relevante staldafsnit, og der blev samplet i 15 min med et luftflow på 50 L/min. (Foto: www. Sartorius.com). På gelatinefilteret (Sartorius) opsamledes partikler fra luften i stalden, inklusive bakterier. Gelatinefilteret kunne derefter overføres direkte til en selektiv Brilliance MRSA 2 agar og inkuberes. (Foto: www. Sartorius.com). kant). Øresvaberene blev samlet til én prøve på samme måde som næsesvaberne og sendt til analyse på DTU Fødevareinstituttet. Miljøprøver Støvprøver: I hver besætning blev der samlet støvprøver fra de samme staldafsnit, som næsesvaberne blev udtaget (i 5 prøver pr. besætning) på følgende måde: 1-2 meter af separatorernes vandrette overflader blev aftørret med en steril SodiBox-klud i steril Ringeropløsning (Food Diagnostics, Denmark). Støvprøver blev analyseret på det regionale mikrobiologiske laboratorium samme dag. Luftprøver: Luftprøver blev taget fra hver besætning som følger: Et sterilt filter blev sat i luftsampleren (AirPort MD8, Sartorius Stedim Biotech, Danmark), og den blev hængt i samme staldafsnit, hvorfra de andre prøvetyper blev taget. Prøvetagningen varede 15 min, med et luftflow på 50 l/min og et totalt prøvevolumen på 750 l. Filteret blev overført til en steril plasticpose og sendt til DTU Fødevareinstituttet. Prøvebehandling Isolering og identifikation af MRSA Næse- og øresvabere: Ved modtagelse blev svaberne inkuberet ved 37±1 C i timer i transportrøret indeholdende 10 ml MH bouillon. Herefter overførtes 1 ml MH bouillon til 9 ml trypton soyabouillon (TSB) med 4 mg/l cefoxitin og 75 mg/l aztreonam og inkuberet ved 37±1 C i timer. Fra TSB bouillonen blev 10 μl sået ud på Brilliance MRSA 2-agar (Oxoid, Danmark) og inkuberet ved 37±1 C i 24 timer. Blå og blålige kolonier blev rendyrket på Brilliance MRSA 2-agar. To blå kolonier blev rendyrket på blodagar og inkuberet ved 37±1 C i 24 timer. To formodede S. aureus blev analyseret med multiplex PCR for 16S, meca og nuc generne (7). En prøve blev bedømt som værende MRSA-positiv, hvis et af isolaterne var PCR-positivt for både nuc (S. aureus identifikation) og meca (methicillinresistens) (8). Støvprøver: Ved modtagelse blev støvprøverne overført til 100 ml MH bouillon med 6,5 % NaCl og inkuberet ved 37±1 C i timer. Herefter fulgtes samme procedure som for næse- og øresvabere (8). Filtre fra luftprøver: Filterene blev overført direkte til Brilliance MRSA 2-agar og inkuberet ved 37±1 C i timer. Om muligt blev 5 formodede MRSA-kolonier rendyrket på blodagar og inkuberet ved 37±1 C i timer. Én koloni, og i tilfældet af et MRSA-negativt real-time PCR signal endvidere de 4 efterfølgende kolonier, blev analyseret i MRSA real-time PCR som følger: En lille mængde kolonimateriale blev overført til 100 μl 1 TE buffer, og varmebehandlet ved 95 C i 8 min. Et volumen på 5 μl af dette lysat blev analyseret i MRSA real-time PCR på en Mx3005P (Stratagene, USA) med et GeneSig-kit til kvantificering af MRSA. Kittet er designet til at detektere meca (penicillinbindende protein 2A) og det kromosomale gen femb hos S. aureus i to separate reaktioner. Alle prøver, der resulterede i et positivt PCR-signal fra både meca og femb, blev bedømt som MRSApositive. Resultater Som vist i Tabel 1, blev der fundet 29 MRSA-positive besætninger både ved at analysere næsesvabere og luft. Øresvabring blev kun udført i 25 besætninger, og af disse blev 18 fundet positive. Analyse Tabel 1. Fund af MRSA-positive svinebesætninger ved analyse af næse- og øresvabere, støv og luft. Prøvekategori Prøvetype MRSA-positive besætninger Dyreprøver Næsesvabere 29 ud af 48 Øresvabere 18 ud af 25 Miljøprøver Støv 16 ud af 48 Luft 29 ud af 46 > DVT

3 af støvprøver resulterede i fund af 16 MRSA-positive besætninger. Der blev observeret en stor forskel på antallet af positive samleprøver i de enkelte besætninger. For de fleste MRSApositive besætninger var flere end halvdelen (>5) af næse- og øresvaber-samleprøverne positive. Med støvprøver sås ofte kun 1 eller 2 positive prøver ud af 5, når besætningen var kontamineret (Tabel 3). I Tabel 2 ses sensitiviteten af de fire prøvetyper. I de 20 besætninger, hvor der blev taget både næse- og øresvabere, blev der fundet flest positive med øresvabere. Der var ingen signifikant forskel i sensitiviteten på de to prøvetyper på besætningsniveau, men der blev fundet signifikant flere positive samleprøver ved øresvabring. Dette betød også at den estimerede individprævalens var signifikant højere ved brug af øresvabere end ved brug af næsesvabere. Tabel 2. Sensitivitet af fire prøvetyper og efterfølgende prøvebehandling. Prøvetype Prøvebehandling Sensitiviteten ved miljøprøver (støv og luft) var afhængig af prævalensen i den enkelte besætning. Chancen for at finde MRSA i miljøprøverne steg signifikant med antallet af kontaminerede individer, som vist i Figur 1. Sensitiviteten var højere ved luftprøver uafhængigt af prævalensen, og næsten perfekt (99 %) allerede ved en prævalens på 25 % kontaminerede individer. Diskussion Ud af de 48 svinebesætninger, der indgik i studiet, blev 37 fundet MRSA-positive blandt disse fandtes alle de besætninger, som var testet positive mindst én gang tidligere i perioden i besætningen. De, der blev fundet negative, var besætninger, hvor der enten ikke tidligere var fundet positive eller som var fundet positive på slagteriet, hvor der er en væsentlig grad af transmission af MRSA mellem grise fra positive besætninger og Figur 1. Forventet sensitivitet ved støv- og luftprøver ved forskellig prevalens af kontaminerede individer i besætninger. Beregningerne er baseret på en logistisk regressionsmodel med data fra besætninger med mindst én MRSA-positiv næsesvaber, støv- eller luftprøve. Positive besætninger/ kendte positive besætninger* % Sensitivitet [KI] Næsesvabere Opformering + selektiv dyrkning 29/37 78 [62-90] Øresvabere Opformering + selektiv dyrkning 18/20 90 [68-99] Støv Opformering + selektiv dyrkning 16/37 43 [27-61] Luft Selektiv dyrkning + real-time PCR 29/37 78 [62-90] KI, 95 % Konfidensinterval *Antallet af kendte positive besætninger blev i studiet vurderet med yderligere to analyser af luftfiltre. Beskrivelser og resultater af disse analyser er ikke medtaget i indeværende manuskript, da de ikke blev fundet egnet til formålet, men er præsenteret i Agersø et al (9). negative besætninger. Dette indikerer, at når en besætning først bliver kontamineret/koloniseret med MRSA, er det sandsynligt, at bakterien persisterer i det kontinuerte produktionsmiljø, medmindre udrydningsstrategier implementeres. MRSA-positive besætninger kunne findes med alle de anvendte prøvetyper og prøvebehandlinger, men der var stor forskel i sensitiviteten. Ved analyse af én luftprøve kunne opnås samme sensitivitet som ved analyse af 10 næsesvaber-samleprøver. Analyse af øresvaber-samleprøver gav en mindst lige så god sensitivitet som næsesvaber-samleprøver, mens analyse af 5 støvprøver viste sig at være mindst sensitivt. Der var god overensstemmelse mellem næsesvaberprøver og luftprøver. Baseret på resultater fra disse prøvetyper vil sandsynligheden for at klassificere en MRSApositiv besætning korrekt være den samme ved analyse af hhv. 10 næsesvaber-prøver som én luftprøve. Prøvetagning af luft er meget simpel at udføre sammenlignet med svabring af enkelte dyr. Samtidig reduceres det efterfølgende analysebehov i laboratoriet fra 10 til én prøve. Fordi filteret fra luftprøven kan lægges direkte på en selektiv agarplade, og ikke kræver et forudgående opformeringstrin, reduceres analysetiden med 24 timer, til en total varighed af 2 i stedet for 3 dage. De modellerede data indikerede endvidere, at sensitiviteten af luftprøvetagning var næsten perfekt (99 %) allerede ved en prævalens på 25 % kontaminerede individer. Prøvetagning af luft er altså fordelagtig i forhold til svabring af enkelte dyr, da det er mere omkostningseffektivt, hurtigere og mindre arbejdskrævende. Luftprøvetagningen i dette studie var ikke optimeret, så der kan sandsynligvis vindes endnu mere ved at tilpasse prøvetagningstid og volumen, placering af luftsampleren og efterfølgende analyse af luftfiltre i laboratoriet. Luftprøvetagning af MRSA er også blevet evalueret i et andet studie (5). Her blev der taget luftprøver i 27 besætninger, der tidligere var fundet MRSA-positive vha. støvprøver. Selvom prøvetagningsmetoderne i de to studier ikke var identiske, blev prøvetagning af luft fun- 30 DVT

4 Tabel 3. Information om besætningstype, prøvetagnings-aldersgruppe og opnåede MRSA resultater med de fire prøvetyper. Besætning nr. Besætningstype Prøvetagningsaldersgruppe Positive næsesvabersamleprøver (af 10) Positive øresvabersamleprøver (af 10) Positive støvprøver (af 5) Luftprøver 1 Integreret Smågrise 0 IP 0 Neg 2 Integreret Smågrise Pos 3 Smågrise/slagtesvin Smågrise 9 IP 0 Pos 4 Integreret Smågrise 10 IP 0 Pos 5 Integreret Smågrise 8 IP 2 Pos 6 Slagtesvin Slagtesvin 0 IP 0 Neg 7 Slagtesvin Slagtesvin 0 IP 0 Neg 8 Slagtesvin Slagtesvin 0 IP 0 Neg 9 Integreret Smågrise 4 IP 0 Pos 10 Slagtesvin Slagtesvin Neg 11 Smågrise/slagtesvin Smågrise 1 IP 3 Neg 12 Slagtesvin Slagtesvin 0 IP 0 Neg 13 Slagtesvin Slagtesvin 4 IP 1 Pos 14 Slagtesvin Slagtesvin 0 IP 0 Neg 15 Integreret Smågrise 8 IP 0 Pos 16 Integreret Smågrise 2 IP 0 Neg 17 Slagtesvin Slagtesvin 10 IP 5 Pos 18 Slagtesvin Slagtesvin 8 IP 0 Pos 19 Integreret Smågrise 5 IP 3 Neg 20 Integreret Smågrise 0 IP 0 Neg 21 Slagtesvin Slagtesvin 0 IP 0 IP 22 Integreret Smågrise 7 IP 3 Pos 23 Slagtesvin Slagtesvin Pos 24 Integreret Smågrise 3 IP 5 Pos 25 Smågrise/slagtesvin Smågrise 0 IP 0 Neg 26 Integreret Smågrise 8 IP 0 Pos 27 Slagtesvin Slagtesvin Pos 28 Integreret Smågrise Pos 29 Integreret Smågrise 9 8 (af 8) 1 Pos 30 Integreret Smågrise Pos 31 Slagtesvin Slagtesvin Pos 32 Integreret Smågrise Pos 33 Integreret Smågrise Pos 34 Integreret Smågrise 0 4 (af 9) 0 Pos 35 Integreret Smågrise IP 36 Smågrise/slagtesvin Smågrise Neg 37 Integreret Smågrise Pos 38 Integreret Smågrise Pos 39 Integreret Smågrise Pos 40 Integreret Smågrise Neg 41 Integreret Smågrise Pos 42 Slagtesvin Slagtesvin Neg 43 Integreret Smågrise Pos 44 Smågrise/slagtesvin Smågrise Pos 45 Integreret Smågrise Neg 46 Slagtesvin Slagtesvin Neg 47 Slagtesvin Slagtesvin Pos 48 Smågrise/slagtesvin Smågrise Pos Antal positive besætninger (af 48) IP: Ingen prøvetagning (af 25) (af 46) > DVT

5 det at være lige så sensitiv som prøvetagning af 12 næsesvaber-samleprøver, hvilket stemmer overens med resultaterne fra nærværende studie (5). Støvprøver resulterede i en dårligere sensitivitet end de andre prøvetyper i dette studie, hvilket også stemmer overens med tidligere observationer af Broens et al. (2011) (10). Blandt de besætninger, hvor der både blev udtaget næse- og øresvabere, blev der fundet flere positive med øresvabersamleprøver. Der var dog ingen signifikant forskel på de to prøvetypers sensitivitet på besætningsniveau. Der blev imidlertid fundet signifikant flere positive øresva- ber-samleprøver, og den estimerede prævalens i de enkelte besætninger var højere med øresvabere sammenlignet med næsesvabere. Dette indikerer at øresvabring potentielt er mere sensitivt end næsesvabring på besætningsniveau, hvilket understøttes af observationer i et belgisk studie (6). Der er imidlertid behov for flere data for at verificere dette, ligesom antallet af øresvabere pr. besætning skal optimeres. Ved samtlige metoder er MRSA verificeret ved PCR, hvorfor risikoen for falske positive vurderes at være minimal. Afslutningsvis kan det konkluderes, at luftprøvetagning er simpel at udføre, omkostningsreduceret i forhold til analyse af næsesvaber-samleprøver, hurtig og sensitiv og med fordel kan anvendes til screening af svinebesætninger for MRSA. For at øge den diagnostiske sensitivitet, anbefales det i MRSA-negative besætninger at supplere med øresvabring. Finansiering Dette studie blev finansieret af Fødevareministeriet Grant no.: 3304-FVFP- 09-F og Grant no.: 3304-NIFA ) samt Fødevarestyrelsens centralt koordinerede projekter. Referencer 1. DANMAP Use of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, food and humans in Denmark ( Tilgået 8. januar Broens EM, et al. Transmission of methicillin resistant Staphylococcus aureus among pigs during transportation from farm to abattoir. Veterinary Journal 2011; 189: Ciccolini, M, et al. Disease transmission on fragmented contact networks: Livestock-associated Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the Danish pig-industry. Epidemics 2012; 4: Espinosa-Gongora C, et al. Transmission of MRSA CC398 strains between pig farms related by trade of animals. Veterinary Record 2012; 170: Friese A, et al. Occurrence of MRSA in air and housing environment of pig barns. Veterinary Microbiology 2012; 158: Pletinckx LJ, et al. Evaluation of salt concentrations, chromogenic media and anatomical sampling sites for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in pigs. Veterinary Microbiology 2012; 154: Maes N, et al. Evaluation of a triplex PCR assay to discriminate Staphylococcus aureus from coagulase-negative Staphylococci and determine methicillin resistance from blood cultures. Journal of Clinical Microbiology 2002; 40: Agersø Y, et al. Study of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Danish pigs at slaughter and in imported retail meat reveals a novel MRSA type in slaughter pigs. Veterinary Microbiology 2012; 157: Agersø Y, et al. Comparison of air samples, nasal swabs, ear-skin swabs and environmental dust samples for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in pig herds. Epidemiology and Infection 2013; doi: /s x. 10. Broens EM, et al. Comparison of sampling methods used for MRSA-classification of herds with breeding pigs. Veterinary Microbiology 2011; 147: DVT