Ansøgning om tilskud i 2009 fra Pelsdyrafgiftsfonden

Ansøgning om tilskud i 2009 fra Pelsdyrafgiftsfonden 1. Projektets titel Diarre hos minkhvalpe i diegivningsperioden forårsaget af enteriske virus (ætiologiske studier af sygdomskomplekset fedtede hvalpe ) 2. Projektets hovedformål Formålet med projektet er: - At identificere årsagen (eller årsagerne) til diarre i diegivningsperioden hos mink (fedtede hvalpe); - At udvikle diagnostiske redskaber og studere spredningen af det/de sygdomsvoldende agens i og mellem farme; - At udvikle en eksperimental vaccine med henblik på forebyggelse af sygdommen; - At udvikle anbefalinger og en forbedret managementstrategi for minkfarmene med henblik på at minimere økonomiske tab på grund af sygdommen. 3. Projektperiode Projekt start: 01 2006 Projekt afslutning: 12 2009 4. Økonomi i 2009 Projektets budget / tilskudsgrundlaget 1.175.000 t.kr. 100 pct. Det ansøgte tilskud hos Pelsdyrafgiftsfonden 580.000 t.kr. 50 pct. Offentlige tilskud a. ansøgt bevilget t.kr. pct. b. ansøgt bevilget t.kr. pct. Andre tilskud 145 000 t.kr. 12 pct. Bidrag fra samarbejdsparter t.kr. pct. Eget bidrag 450.000 t.kr. 38 pct. 5. Projektets samlede udgifter 1.175.000 6. Ansøger Statens Veterinärmedicinska Anstalt (SVA) SE-751 89 Uppsala, Sverige Tel +46 18 67 4628 fax +46 18 674669 Projektansvarlig Claudia Baule, DVM. PhD 7. Kort beskrivelse af ansøger Virologisk Afdelning på SVA er ansvarlig for diagnose af virale sygdomme hos domesticerede dyr. Laboratoriet er nationalt referencelaboratorium for flere infektiøse sygdomme og OIE samarbejdscenter for nye molekylær diagnostiske metoder. Claudia Baule er ansat ved SVA siden 1997 og i øjeblikket ansat som seniorforsker ved Afdeling for Virologi. Har arbejdet med klassisk virologi med hovedfokus på diagnostik af virale sygdomme relevante for Sydafrika. Har under og efter afslutning af PhD studier i 2000 arbejdet med molekylær karakterisering af virus og udvikling af molekylære detektionsmetoder for virus. Hendes nuværende forskning er fokuseret på studier af infektionsmekanismer for RNA virus, hvor konstruktion af virale kloner suppleret med cellulære studier anvendes som et redskab til at undersøge virus biologiske egenskaber, som patogenicitet og virulens. Herudover har hun erfaring med anvendelse af forskellige genekspressionssystemer til produktion af rekombinante proteiner med henblik på udvikling af vacciner og diagnostiske tests, såvel som til genfunktionsstudier. Side 1 af 1

8. Samarbejdsparter DTU Veterinærinstituttet Hangøvej 2 DK-8200 Aarhus N Tel +45 72 34 68 73, Fax +45 72 34 69 01 9. Pengeinstitut NORDEA BANK SVERIGE AB Swift /Bic address NDEASESS 10. Revisor RIKSREVISIONEN 114 90 Stockholm, Sverige 11. Dato Titel, navn og underskrift 11.06.2008 Enhetschef VIP-SVA, Jens Mattsson 12. Projektbeskrivelse 1. Projektets formål At identificere årsagen (eller årsagerne) til diarre i diegivningsperioden hos mink (fedtede hvalpe) At udvikle diagnostiske redskaber og studere spredningen af det/de sygdomsvoldende agens At udvikle en eksperimental vaccine med henblik på forebyggelse af sygdommen At udvikle anbefalinger og en forbedret managementstrategi for minkfarmene med henblik på at minimere økonomiske tab på grund af sygdommen 2. Baggrund/faglig begrundelse for projektet Diarresygdomme udgør et vigtigt problemområde i minkproduktionen, som først og fremmest rammer mink i vækstperioden. De ramte mink får ofte nedsat ædelyst og forringet almentilstand, hvilket yderligere kan resultere i nedsat tilvækst og dårlig pelskvalitet. I alvorlige tilfælde kan diarre føre til dødsfald. Store resurser, såvel tidsmæssige som økonomiske, må oftest sættes ind for f.eks. at rengøre bure og antibiotikabehandle. Hovedparten af antibiotikaanvendelsen i minkproduktionen sker ved problemer relateret til mave- og tarmkanalen. Trods det faktum at disse sygdomsproblemer har været udbredt i mange år savnes fortsat viden om, hvilke faktorer der udløser problemerne. Derudover har patoanatomiske undersøgelser udført i Sverige (Järplid och Mejerland, 1998) vist at celleforandringer i tarmtarmslimhinden også tyder på, at virusinfektioner forekommer hos disse hvalpe med diarre. En sådan virusinfektion kan bane vej for den vækst af forskellige typer af bakterier som påvises i tarmene hos unge hvalpe med diarré. Lignende sygdomskomplekser forekommer hos de fleste andre husdyrsarter. Epidemiologisk og immunologisk forskning i Danmark (M. Chriél, 1998 pers.medd., Å. Uttenthal, 1998, pers.medd.) taler for at diarrér på de yngste dyr (fedtede hvalpe) også kan have forbindelse med fodringsrutiner og tævernes immunstatus i drægtighedsperioden. Diarréproblemer senere i vækstperioden (epizootisk katarrhalsk gastroenteritis) er i reglen mindre dramatiske i forløbet, end de der ses hos de yngste hvalpe, men ofte lige så omkostningsfulde. Sygdommen spredes, som var den smitsom, og har et karakteristisk forløb som har medført, at den ofte omtales som "tre-dages-syge". Side 2 af 2

Tidligere publikationer har beskrevet forekomst af coronavirus (Gorham et al., 1990, Have et al., 1992. Jørgensen et al., 1996) og reovirus (Kokles, 1975) hos mink. En licentiatafhandling af V. Svansson (Inst. for veterinær virologi og immunologi, KVL, København, 1991) samt et mindre studie af M. Jørgensen og medarbejdere (1996) bekræftede fund af reovirus/rotavirus, coronavirus og muligvis calicivirus i danske minkvalpe. En begrænset undersøgelse af fæces fra mink ældre end 5 måneder (Svansson, 1991) viste også, at reovirus kunne isoleres fra farme med samtidig udbrud af mink virusenteritis. Ved serologisk undersøgelse viste 80% af alle undersøgte ældre, danske mink sig at have antistoffer mod reovirus. Disse virusinfektioners betydning for udvikling af diarré hos mink er blevet debatteret i flere omgange, f.eks. i Dansk Veterinærtidsskrift nr 14, 17 och 20 1996. I en rapport fra USA beskrives en variant af calicivirus som årsag til diarré hos voksne mink og hvalpe ved et udbrud i juni måned, det vil sige langt senere i vækstperioden end hos de hvalpe vi har studeret (Guo et al., 2001). 3. Projektets indhold Resultater af forskningsgruppens arbejde indtil 2003 Projektet blev indledt med et case-control studie, hvor astrovirus blev påvist med elektronmikroskopisk undersøgelse (EM) af fæcesprøver indsamlet fra syge mink. Tilstedeværelse af mink astrovirus øgede signifikant risikoen for forekomst af diarre I diegivningsperioden både på farm og minkhvalpniveau, mens den kliniske betydning af tilstedeværelse af Sapporo og/eller Norwalk-like calicivirus endnu ikke er undersøgt. Den komplette genomsekvens for mink astrovirus er undersøgt og publiceret (Mittelholzer et al. 2003a) og en traditional polymerase chain reaction (PCR) er blevet udviklet (Mittelholzer et al. 2003b). Fylogenetiske analyser har afsløret, at mink astrovirus er fjernt beslægtet med flere allerede kendte astrovirus hos andre dyrearter, tættest beslægtet er den med astrovirus fra får. Sekvensanalyser af mink astrovirus fra geografisk adskilte svenske og danske farme viser meget mindre variation. Dette tyder på spredning af infektionen i minkpopulationen af et virus, der er udviklet for lang tid siden, eller senere introduktion af et gammelt virus i en ny værtsart. Resultater af forskningsgruppens arbejde indtil 2008 Baseret på genetiske sekvensdata for mink astrovirus, blev en ny real-time polymerase chain reaction assay (real-time PCR) udviklet og evalueret til hurtig påvisning af mink astrovirus i kliniske prøver. Der blev fundet meget god korrelation mellem resultater af real-time PCR og elektronmikroskopiske undersøgelser (EM) da 218 fæcesprøver blev analyseret med begge metoder. Real-time PCR metoden viste sig at være mere følsom end EM-metoden, den kan automatiseres og er velegnet til analyse af store antal prøver (Ullman et al. 2004). Mink astrovirus kapsidproteinet, det vigtigste strukturelle protein i mink astrovirus, er særligt interessant, fordi homologe proteiner i andre astrovirus har vist sig at være immunogene og således har diagnostisk og profylaktisk potentiale. Målrettet anbringelse af kapsidproteingenet i en klonings- og ekspressionsvektor af Gatewayserien (Invitrogen) resulterede i et rekombinantprotein udtrykt i bakterieceller. Ved anvendelse af peptidmassespektrofotometri (Hellman 2002) og med Western blot analyse (med kanin- og hønseantisera rettet mod potentielt antigene områder på kapsidproteinet) blev det bekræftet, at det ca. 85 kda store protein var identisk med naturligt produceret mink astrovirus kapsidprotein (Baule et al. 2004). Side 3 af 3

I år 2005, var det endelig muligt at gennemføre flere meget vigtige eksperimenter. Resultaterne af disse seneste eksperimenter og studier er endnu ikke publiceret, på grund af igangværende forhandlinger om patentrettigheder, men de foreløbige resultater af disse eksperimenter er kort beskrevet herunder. Drægtige minktæver blev immuniseret to gange med en eksperimentel vaccine. Disse tæver udviklede specifikke antistoffer mod mink astrovirus. Sygdomskomplekset fedtede hvalpe blev reproduceret under kontrollerede laboratorieforhold ved et infektionsforsøg med oral indgift af fæcesmateriale indeholdende mink astrovirus. Symptomerne kunne ikke reproduceres i kontrolhvalpe ved oral indgift af virus-frit fæcesmateriale. Præventiv immunisering af drægtige tæver med en eksperimentel vaccine (baseret på et rekombinant mink astrovirus kapsidprotein) inducerede produktion af beskyttende maternelle antistoffer. Minkhvalpe fra immuniserede mink blev beskyttet mod alle symptomer relateret til sygdomskomplekset fedtede hvalpe eller viste langt mildere symptomer end hvalpe fra ikke-immuniserede tæver. Resultater af dette infektions og immuniserings eksperiment bekræfter hypotesen, at mink astrovirus infektion kan forårsage syndromet fedtede hvalpe hos minkhvalpe og indikerer, at sygdommen muligvis vil kunne kontrolleres gennem en målrettet vaccinations strategi. Med henblik på at udvikle et redskab til at evaluere resultaterne af eksperimentelle immuniseringer, blev det rekombinante protein også anvendt til at udvikle en ELISA. I 2007, blev kortere varianter af proteinet testet hos voksne mink. Et af disse proteiner inducerede same antistofniveauer som fuldlængde kapsidproteinet. Resultater tillod identifikation af en potentiel vaccinekandidat, som nu vil blive yderligere testet under kontrollerede forhold i forsøgsstald og i kliniske forsøg på farme. Udvalgte proteiner testes i øjeblikket (2008) i immuniserings og smitteforsøg. I 2006 lykkedes det igen, at reproducere sygdomskomplekset fedtede hvalpe ved oral indgift af mink astrovirus. Ikke-immuniserede tæver der havde kuld med fedtede hvalpe i 2005 udviklede antistoffer specifikke for astrovirus, dog var niveauet lavere end hos immuniserede minktæver. Ved infektionsforsøget i 2006 forekom symptomer karakteristiske for sygdomskomplekset fedtede hvalpe i kuld fra ikke-immuniserede tæver og i ét kuld fra en immuniseret tæve. Generelt var sygdoms symptombilledet langt mildere end i 2006, hvor mink astrovirus-fri mink blev inficeret. Et longitudinal studie udført på tre forskellige farme bekræftede, at mink astrovirus infektion er til stede på disse minkfarme samtidig med udbrud af fedtede hvalpe. På to ud af tre farme forekommer de typiske symptomer på fedtede hvalpe omkring 7 dage efter påvisning af mink astrovirus, men på én farm optrådte symptomerne flere dage før mink astrovirus kunne påvises i fæcesprøver. EM analyse af prøver indsamlet på denne farm i perioden umiddelbart inden symptomerne opstod viste at fæces fra disse hvalpe indeholdt calicivirus. Dette fund synes at bekræfte en anden tidlig antagelse: at mink hvalpe muligvis har forskellige virusinfektioner gennem diegivningsperioden, som forårsager et meget ens symptombillede. Det kan derfor ikke afvises at calicivirus har en rolle som årsagsfaktor i forbindelse med sygdomskomplekset fedtede hvalpe tilsvarende den der nu er demonstreret for mink astrovirus. I 2009 vil fokus være på: færdiggørelse af studier og vaccineudvikling i forbindelse med mink astrovirus; påbegyndelse af feltstudier, udvikling af diagnostiske redskaber og vaccineudvikling I forbindelse med mink calicivirus; Med det hovedformål at kombinere de udviklede redskaber til detektion og ultimativt Side 4 af 4

kontrol af infektioner forårsaget af begge virus. Vaccineudvikling (Mink Astrovirus) Analyse af prøver fra immuniseringsforsøg: Prøver indsamlet fra immuniseringsforsøg udført i 2008 vil blive analyseret med henblik på at fastlægge niveau og varighed af antistoftiterværdier hos de immuniserede dyr. Analyserne vil blive foretaget med ELISA udviklet i forbindelse med projektet. Analyse af effekten af forskellige adjuvanter på udvalgte vaccinekandidaters immunogenicitet: Den vaccinekandidat der bliver udvalgt på baggrund af immuniserings og infektionsforsøg i 2008, vil blive anvendt med forskellige adjuvanter med henblik på om nødvendigt at øge niveau og varighed af immunsvaret. Alternativt, vil det være muligt at teste en variant af det udvalgte protein som bærer et molekyle der kan påvirke immunogeniciteten. Epitopkortlægning i C-proteinet: Med henblik på at karakterisere den immunogene del af det C-protein der udvælges som vaccinekandidat er det nødvendigt at identificere, hvilke epitoper der er involveret i induktion af beskyttende immunitet. Kloner der udtrykker de varianter af C-proteinet der er blevet produceret i forbindelse med projektet vil blive indsat i Minkceller. Med immunfarvning vil områder, hvor veldefinerede antistoffer binder til disse proteiner vil blive identificeret. Immuniseringsforsøg Prøveindsamling fra immuniserede mink fortsættes over en længere periode med henblik på at bestemme niveau og varighed af antistoftiter efter immunisering. Målet er at afgøre varigheden af beskyttende antistofniveauer med henblik på fastlæggelse af en passende immuniseringsplan for farmmink. I kombination med dette foretages studier af effekten af forskellige adjuvanter med henblik på at forbedre vaccinens immunogenicitet (Morein et al. 1984., Czifra et al. 2000). Feltstudier af mink calicivirus Indsamlingen af materiale vil fortsætte også i 2009. Baseret på erfaringer fra indsamlinger i perioden 2005-2008. Prøver vil blive indsamlet fra farme med forskellige kliniske mønstre. Prøver vil også blive indsamlet fra problemfarme i forskellige geografiske regioner og fra farme, der aldrig har oplevet sygdommen. Minkblodprøver vil blive analyseret med ELISA, og fæcesprøver med real-time PCR. Elektronmikroskopiske undersøgelser forbliver golden standard referencemetoden til påvisning af calicivirus og vil fortsat blive anvendt til bekræftelse af tvivlsomme analyser. Genetiske karakteriseringsstudier (mink calicivirus og mink astrovirus) Mink calicivirus fundet i fæcesprøver indsamlet på farme med forskellige kliniske mønstre vil blive sekventeret og sammenlignet, tilsvarende de studier der i øjeblikket udføres for mink astrovirus. PCR-positive prøver fra forskellige geografiske områder vil blive sekventeret med henblik på at undersøge eventuel genetisk variation i Mink calicivirus og astrovirus og om muligt spredningen af infektionen mellem farme. Fuldlængde genetiske sekventering af mink calicivirus fra problemfarme vil blive foretaget med henblik på at danne grundlag for udvikling af diagnostiske redskaber og på længere sigt en vaccine. Udvikling af diagnostiske metoder til påvisning af mink calicivirus Calicivirus er påvist i fæcesprøver fra mink med diarre i diegivningsperioden, men det er endnu ikke undersøgt hvilken rolle dette virus spiller. De svensk-danske fund af Side 5 af 5

calicivirus må undersøges ved hjælp at egen metodik og ved hjælp af identifikationsog detektionsmetoder for mink calicivirus som for nylig er beskrevet af amerikanske forskere (Guo et al. 2001). Den generede sekvensdata vil blive anvendt til at forbedre den konventionelle PCR og designe en real-time PCR metode med henblik på at øge muligheden for påvisning af en større variation af calicivirusstammer. Fordele ved multipel påvisning of patogener ved real-time PCR vil blive udnyttet til påvisning af forskellige calicivirus og astrovirus i samme analyse. Påbegyndelse af undersøgelser med henblik på vaccineudvikling (Mink calicivirus) Sekvensdata genereret for mink calicivirus vil blive anvendt som grundlag for en udvælgelse af egnede stammer associeret med kliniske problemer på farme. Disse stammer vil blive anvendt til at fremstille immunogene proteiner. En sekvens af calicivirus, udvalgt på baggrund af antigenicitetsberegninger, vil blive klonet ind i en vektor der tillader ekspression af proteiner både i bakterie- og pattedyrsceller. De producerede proteiner vil blive testet ved eksperimentel immunisering af mink, men henblik på at evaluere deres immunogenicitet. Smitteforsøg vil blive udført, også i kombination med mink astrovirus vaccinen, med henblik på at evaluere den individuelle og kombinerede effekt i reduktion af kliniske tegn på diarre hos minkhvalpe i diegivningsperioden. 4. Udbytte af projektet Fedtede hvalpe er et alvorligt og tilbagevendende problem på mange minkfarme. Sygdommen har været kendt i 50 år, men trods tiltag til at begrænse problemet er forekomsten generelt øget i de seneste ti-femten år. Fedtede hvalpe er i dag en af de vigtigste årsager (i Sverige så godt som den eneste årsag) til behandling med antibiotika og den eneste alvorlige infektionssygdom, udover plasmacytose, som ikke er under kontrol i pelsdyrproduktionen. Udover de indlysende omkostninger i forbindelse med dyrlægebesøg, antibiotika og hvalpedødelighed forårsager fedtede hvalpe indtægtstab som følge af nedsat tilvækst og lejlighedsvis dårlig skindkvalitet (hårløse partier). Sygdommen giver også øgede arbejdsomkostninger på minkfarmen idet syge hvalpekuld skal inspiceres, hvalpe vaskes, antibiotika doseres og kasser rengøres. Kan sygdommen forebygges med vaccine og ændrede håndteringsrutiner forbedres velfærden hos minken antageligt og minkfarmerens tab mindskes. Det vigtigste udbytte af projektet er: Identifikation af nye vaccine kandidat proteiner som giver god beskyttende immunitet mod sygdomskomplekset fedtede hvalpe. Bedre forståelse af sygdomskomplekset fedtede hvalpe: patogenese, samt variation i sygdomsforekomst og spredning Bedre forståelse af calicivirus rolle i sygdommens patogenese Udvikling af nye diagnostiske redskaber til påvisning af calicivirus i prøver fra mink. 5. Planer vedr. offentliggørelse I de foregående år er resultater af projektet blevet publiceret i Faglig Årsberetning. Mere detaljerede manuskripter der omfatter yderligere data er under forberedelse og så snart beskyttelsen af rettighederne til eventuelle patenter og lignende er sikret, vil disse manuskripter blive indsendt til peer reviewede tidsskrifter. Vi vil løbende informere mink avlernes organisation og dyrlægerne ved NJF møder og på sigt i forbindelse med internationale videnskabelige møder. Side 6 af 6

Der forventes publikationer indenfor følgende emner: Udvikling af en infektionsmodel for sygdomskomplekset fedtede hvalpe Proteiner giver god immunitet mod sygdommen, som vaccine kandidater. Calicivirus rolle i sygdommens patogenese Diagnostiske redskaber til påvisning af astrovirus og calicivirus Referenceliste til projektbeskrivelse Baule, C., K. Ullman, U. Hellman, H.H. Dietz, L. Englund & G. Czifra 2004. Diarre i dieperioden hos minkhvalpe II. Kloning og ekspression af Mink Astrovirus (MiAstV) Kapsidprotein Faglig Årsberetning 2004. Czifra, G., Sundquist, B.G., Hellman, U., & Stipkovits, L. 2000. Protective effect of two Mycoplasma gallisepticum protein fractions affinity purified with monoclonal antibodies. Avian Path, 29:243-251. Englund L, Chriél M, Dietz HH, Hedlund K-O, 2002. Astrovirus epidemiologically linked to pre-weaning diarrhoea in mink. Vet Microbiol 85:1-11. Gorham JR, Evermann JF, Ward A, Pearson R, Shen D, Hartsough GR, Leathers C, 1990, Detection of coronavirus-like particles from mink with epizootic catharral gastroenteritis. Can J Vet Res 54:383-384. Guo M, Evermann JF, Saif LJ, 2001, Detection and molecular characterization of cultivable caliciviruses from clinically normal mink and enteric caliciviruses associated with diarrhoea. Arch Vir 146:479-493. Have P, Moving V, Svansson V, Uttenthal Å, Bloch B, 1992, Coronavirus infection in mink (Mustela vison). Serological evidence of infection with a coronavirus related to transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus. Vet Microbiol 31:1-10. Hammer, A. S., Ullman, K. & G. Czifra Diarre i dieperioden hos minkhvalpe IV. Astrovirus infektion hos minkhvalpe, virologiske og patologiske fund i fedtede hvalpe indsendt til diagnostisk undersøgelse Faglig Årsberetning 2006, 165-170. Hellman, U. 2002. Peptide mapping using MALDI- TOF-MS. p. 259-275. In J.Silberring & R. Ekman (eds) Mass Spectrometry and Hyphenated Techniques in Neuropeptide Research 1 st ed. Wiley-Interscience, New York Järplid B, Mejerland T, 1998, Villous atrophy in the small intestine of mink kits with diarrhea. Scientifur 22(2):157-160. Jørgensen M, Scheutz F, Strandbygaard B, 1996, Escherichia coli and virus isolated from sticky kits. Acta vet scand 37:163-169 Kokles R, 1975, Isolation of reoviruses from mink (in German). Arch Exp Veterinarmed 29:781-78 Mittelholzer, C., L. Englund, K.H. Hedlund, H.H. Dietz, and L. Svensson 2003a. Molecular characterization of a novel astrovirus associated with disease in mink. J Gen Vir 84, 3087-3094. Side 7 af 7

Mittelholzer, C., L. Englund, K.H. Hedlund, H.H. Dietz, and L. Svensson 2003b. Detection and sequence analysis of Danish and Swedish strains of mink astrovirus. J Clin Micro 41, 5192-5194. Morein, B., Sundquist, B., Hoglund, S., Dalsgaard, K. & Osterhaus, A. 1984. Iscom, a novel structure for antigenic presentation of membrane proteins from enveloped viruses. Nature, 308, 457-460. Ullman, K., K. O. Hedlund, A. S. Hammer M. Isaksson, H.H. Dietz, L. Englund & G. Czifra 2004. Diarre i dieperioden hos minkhvalpe I. Påvisning af Mink Astrovirus (MiAstV) i klininske prover med Real-time RT-PCR Faglig Årsberetning 2004. Ullman, K., Hammer, A. S., Hedlund, K. O., Thorén, P. & G. Czifra 2007. Diarre i dieperioden hos minkhvalpe III. Prævalens af Mink Astrovirus (MiAstV) i fæcesprøver fra minkhvalpe på tre farme i dieperioden. Faglig Årsberetning 2006, 159-163. 13. Bilagsliste Liste over evt. bilag vedlagt ansøgningen f.eks. CV er, vedtægter. 14. Det samlede budget for projektperioden 2009 Det samlede budget 1.000 kr. Interne lønomkostninger (ansøger + evt. medansøgere) s 620 Ekstern bistand Materialer 210 Udstyr Møder og rejser 30 Andre udgifter (eksperimentelle immuniseringer) 80 Administrative omkostninger (overhead, 20%) 235 Omkostninger i alt 1.175 Indtægter fra projektet Anslået scrapværdi for udstyr Det samlede tilskudsgrundlag i alt 1.175 Det ansøgte tilskud 725 Tilskuddets andel af tilskudsgrundlaget, i pct. 62 % OBS: Omkostningerne skal være eksklusiv moms. Side 8 af 8

15. Specifikation af ansøgers interne lønomkostninger Lønkategori timesats kr. pr. time timeforbrug I alt 1.000 kr. AC 15% TAP 100% Overhead I alt 370 115% 370 16. Bemærkninger til budgettet Den tredje treårige projektperiode er påbegyndt i 2007. Foreliggende oplæg vedrører 2009, det tredje år af denne periode. Udover driftsmidler til at dække prøveindsamling og laboratoriematerialer i Danmark og i Sverige, vil vi gerne have mulighed for at udnytte Claudia Baules (CB) ekspertise som molekylærbiolog 15 % af fuld tid. Mehdi Bidhoktis (MB) vil arbejde 100 % af fuld tid med genetisk karakterisering af calicivirus og astrovirus, produktion of rekombinante calicivirusproteiner med henblik på udvikling af vaccinekandidater og videreudvikling af en astrovirus vaccine i samarbejde med et vaccinefirma. Karin Ullman (KU) vil arbejde 50 % af fuld tid med udvikling af molekylære og serologiske testmetoder til påvisning af mink calicivirus og kombination af disse metoder med eksisterende mink astrovirus assays. CB og KU har finansiering fra Afdeling for Virologi SVA til at dække den resterende tid (CB (35%) og KU (50%)). Modfinansiering af lønomkostninger for projektdeltagelse af Kjell-Olof Hedlund (10 %) dækkes af ordinære arbejdsgivere, dvs SMI. 17. Oplysninger i relation til samarbejdsprojekter, hvor samarbejdspart er medansøger Budget 1.000 kr. Ansøgt tilskud 1.000 kr. Ansøgt tilskud i pct. Ansøger 775 425 59 Medansøger 1 400 300 41 Medansøger 2 I alt 1.175 725 100 Side 9 af 9