Lyngby, den 8. november 2010. s070456 Lise Celine Pedersen s071449 Kristine Duelund Vilsgaard

Lyngby, den 8. november 2010 Forekomst og udbredelse af antibiotikaresistens hos bakterier fra ulke, blåmuslinger og sediment i relation til udledning af spildevand i Ulkebugten, Sisimiut s070456 Lise Celine Pedersen s071449 Kristine Duelund Vilsgaard Vejledere Ingela Dahllöf, DMU Morten Holtegaard Nielsen, DTU Byg

Abstract In the second largest town in Greenland, Sisimiut, untreated wastewater is discharged directly into the bay, Ulkebugten. Wastewater is also discharged into the bay from the hospital s sewage outlet. This sewage contains antibiotics, antibiotic resistant organisms and human pathogens. The discharge of antibiotics to the marine environment would kill non-resistant bacteria, which can lead to the development of antibiotic resistance in bacteria. Antibiotic resistance can be transmitted by vertical and horizontal gene transfer. Resistant bacteria can spread to sediments and organisms in the water. The governing processes of the fate of an antibiotic in the aquatic environment are water flows, sorption and degradability. However, there is limited knowledge on these processes, under the conditions in Ulkebugten. The occurrence and distribution of antibiotic resistance in Ulkebugten is in this project examined by taking samples from five different sites in Ulkebugten. One of the sites is located by the hospitals sewage outlet and another by Frederik VII Island, which is considered as a reference site. The three remaining sites are positioned between the hospital and Frederik VII Island. Bacteria from blue mussels hepatopancreas, gut bacteria from sculpins and sediment bacteria are used to test for antibiotic resistance. All three sample types are tested for three different antibiotics used at the hospital. Benzylpenicillin is a natural antibiotic, which acts against Gram-positive cells. Amoxicillin and Ciprofloxacin are respectively semi-synthetic and synthetic produced and are both broad-spectrum antibiotics that act against both Gram-positive and Gram-negative cells. Besides carrying out a survey of resistance for the three antibiotics, a pilot study is made for Roxithromycin resistance. The number of bacteria is increasing from the hospital towards Frederik VII Island, which indicates a connection between the occurrence of bacteria and the presence of antibiotics in Ulkebugten. In general there is an insignificant occurrence of resistance towards Ciprofloxacin on all locations and in all sample types, and no connection can be made between the resistance and the discharge from the hospital. For Benzylpenicillin and Amoxicillin, the occurrence of resistance is in general largest at the hospital and decreases towards Frederik VII Island. This indicates that there is a connection between the discharge from the hospital and the occurrence of resistance towards Benzylpenicillin and Amoxicillin. Most resistance towards Benzylpenicillin is found in bacteria from blue mussels, while resistance towards Amoxicillin is of greatest extent in gut bacteria from sculpins. The differences between the occurrence of resistance in the sculpins and mussels can be caused by different composition of bacteria in the two sample types. When comparing the test types, bacteria from living organisms, blue mussels and sculpins, show a higher antibiotic resistance than sediment bacteria. Upon identification of the antibiotic resistant bacteria, geographical differences in the occurrence of bacteria were noticed. The same types of bacteria appear various times within the locations, but not between the sites. Due to the potential risk of antibiotic resistance within fish, the fishing industry in Sisimiut is threatened. This will have economic consequences for the town. Another risk is connected to the development of multi-resistant human pathogens, which can be a challenge in the future, because of the lack of new antibiotics introduced to the market. To get an overview of the environmental and human consequences caused by the contamination from the sewage outlets, it is suggested that this study is followed up and extended with for example tests of the water flows and also the sorption and degradability of the antibiotics.

Resumé I Sisimiut, der er Grønlands næststørste by, udledes spildevandet urenset til Ulkebugten. I alt er der fire spildevandsudløb i byen, hvoraf det ene, der udleder sanitært spildevand, er placeret ved hospitalet. Dette spildevand indeholder både antibiotikarester, antibiotikaresistente organismer samt humane patogener. Tilførslen af antibiotika i det marine miljø, vil slå ikke-resistente bakterier ihjel, og bevirke, at bakterier kan udvikle resistens. Antibiotikaresistens kan overføres ved vertikal og horisontal genoverførsel. De allerede resistente humane bakterier vil kunne spredes til sedimentet og organismer i havet. De afgørende processer for antibiotikas skæbne i det akvatiske miljø, er vandets strømninger, sorption og nedbrydelighed, hvilket der imidlertid er begrænset viden omkring. Forekomst og udbredelse af antibiotikaresistens i Ulkebugten er i dette projekt undersøgt ved at tage prøver fra fem forskellige lokaliteter i og omkring bugten. Den ene lokalitet er ved hospitalets spildevandsudløb og en anden, ved Frederik VII s Ø er brugt som referecence. De resterende tre er placeret mellem disse. Der er testet for antibiotikaresistens i bakterier fra blåmuslingers hepatopancreas, mavetarmbakterier fra ulke samt sedimentbakterier. Alle tre prøvetyper er testet for tre forskellige antibiotika, der anvendes på hospitalet. Benzylpenicillin er et naturligt antibiotikum, der primært virker mod Gram-positive celler. Amoxicillin og Ciprofloxacin er henholdsvis semisyntetisk og syntetisk, og er begge bredspektrede antibiotika, der virker mod både Gram-positive og Gram-negative celler. Udover undersøgelsen af resistens for de tre antibiotika er der lavet et pilotstudie af roxithromycinresistens. Antallet af bakterier fra hospitalet mod Frederik VII s Ø er stigende, hvilket tyder på, at der er en sammenhæng mellem bakterieforekomst og tilstedeværelsen af antibiotika i Ulkebugten. Generelt er der en ubetydelig lille forekomst af ciprofloxacinresistens på samtlige lokaliteter i alle prøvetyper, og der ses ingen sammenhæng mellem denne resistens og forureningen fra hospitalet. For benzylpenicillin- og amoxicillinresistensen er forekomsten overordnet set størst ved hospitalet og faldende mod Frederik VII s Ø, hvilket indikerer en sammenhæng mellem udledningen ved og forekomsten af resistens. Der forekommer mest benzylpenicillinresistens i bakterier fra blåmuslinger, mens amoxicillinresistensen er størst i mavetarmbakterier fra ulke. Forskellene i fordelingen kan tilskrives bakteriesammensætningen i disse prøvetyper. Mellem prøvetyperne, forekommer mest resistens i bakterier fra de levende organismer, ulke og blåmuslinger ved flere lokaliteter. Under identifikation af de antibiotikaresistente bakterier viser sig geografiske forskelle i forekomsten af bakterier. De samme bakterietyper forekommer flere gange inden for lokaliteterne, men stort set ikke på tværs af lokaliteterne. Da der er risiko for at antibiotikaresistensen kan spredes i større omfang til eksempelvis spisefisk vil det kunne true fiskeindustrien i Sisimiut, hvilket kan få økonomiske konsekvenser for byen. Risikoen for udvikling af multiresistente humane patogener kan blive en udfordring i fremtiden, da der sjældent introduceres nye antibiotika. For at få et overblik over hvilke miljømæssige og menneskelige konsekvenser forureningen har, foreslås at undersøgelserne i dette projekt opfølges og udbygges med eksempelvis tests af vandets strømninger, samt sorption og nedbrydelighed af antibiotika.

Forord Denne bachelorrapport er udarbejdet af to bachelorstuderende i Miljøteknologi, Kristine Duelund Vilsgaard og Lise Celine Pedersen, under vejledning af Seniorforsker Ingela Dahllöf, Danmarks Miljøundersøgelser (DMU) og Lektor Morten Holtegaard Nielsen, DTU Byg Institut for byggeri og anlæg. Projektet er udført i samarbejde med Center for Arktisk Teknologi ved DTU Byg. Bachelorprojektet er normeret til 20 ECTS point. Rapporten er baseret på data opnået ved feltundersøgelser i Ulkebugten, Sisimiut, i august 2010 og laboratoriearbejde på DMU i oktober 2010. Feltundersøgelserne er foretaget i samarbejde med Ingela Dahllöf, Gitte Jacobsen og medstuderende Anna Kabat. Begge gruppemedlemmer har deltaget ligeligt i udarbejdelsen af rapporten. En stor tak til: Seniorforsker Ingela Dahllöf for godt samarbejde og vejledning. Lektor Morten Holtegaard Nielsen for godt samarbejde og vejledning. Laboratoriefuldmægtig Gitte Jacobsen for godt samarbejde. Anna Kabat for godt samarbejde. Center for Arktisk Teknologi, DTU for introduktion til Grønland og praktisk planlægning i forbindelse med vores ophold i Sisimiut. Byggeri- og Anlægsskolen i Sisimiut, Sanaartornermik Ilinniarfik, for gæstfrihed. Anton, Róbert, Lorenzo, Leonardo, Anders og Johan for hjælp til at fange ulke. Lasse Høgstedt for korrekturlæsning. Lyngby, den 8. november 2010, Lise Celine Pedersen s070456 Kristine Duelund Vilsgaard s071449

Indholdsfortegnelse 1 Indledning... 1 1.1 Hypoteser... 1 1.1.1 Problemformulering... 2 2 Baggrund... 3 2.1 Situationen i Sisimiut... 3 2.1.1 Undersøgelser i 2009... 4 2.2 Antibiotika i miljøet... 4 2.3 Antibiotikaresistens... 5 2.4 Beskrivelse af de fire valgte antibiotika... 6 2.4.1 Benzylpenicillin... 6 2.4.2 Amoxicillin... 6 2.4.3 Ciprofloxacin... 7 2.4.4 Roxithromycin... 7 2.5 Prøvetyper... 7 2.5.1 Ulk... 8 2.5.2 Blåmusling... 8 2.6 Prøvetagningslokaliteter i Sisimiut... 8 2.7 Bakterieidentifikation... 8 2.7.1 API 20 E... 8 2.7.2 DNA analyse... 9 2.8 Statistisk databehandling... 9 3 Metoder og materialer... 10 3.1 Systematisering af petriskåle... 10 3.2 Anskaffelse af sediment, muslinger og fisk... 10 3.3 Dyrkning af marine bakterier fra sediment, muslinger og fisk... 10 3.3.1 Fremstilling af vækstmedie til sedimentbakterier... 11 3.3.2 Fremstilling af vækstmedie til bakterier fra muslinger og fisk... 11 3.3.3 Fremstilling af plader... 11 3.3.4 Ekstraktion af sedimentbakterier... 11 3.3.5 Ekstraktion af bakterier fra muslinger og fisk... 12 3.3.6 Podning af plader... 12 3.3.7 Tælling af bakteriekolonier... 12 3.4 Fremgangsmåde ved API 20 E... 13 3.5 Fremgangsmåde ved DNA analyse... 13 3.5.1 Ekstraktion af DNA... 13 3.5.2 Polymerasekædereaktion (PCR)... 13 3.5.3 DNA-sekventering... 14 3.6 Variansanalyse... 14 4 Resultater... 15 4.1 Kvalitet af prøvetyper... 15 4.2 Sterilitetskontrol... 15 4.3 Databehandling... 15 4.4 Fordeling af antibiotikaresistente bakterier på antibiotika... 16 4.5 Antal bakterier på lokaliteterne... 17 4.6 Relativ antibiotikaresistens... 18

4.6.1 Fordeling af antibiotikaresistente bakterier på lokaliteter... 18 4.6.2 Fordeling af antibiotikaresistente bakterier på prøvetyper... 20 4.7 Pilotstudie af Roxithromycinresistens... 21 4.8 Forekomst af bakterietyper... 22 5 Diskussion... 23 6 Perspektivering... 30 7 Konklusion... 31 Referencer Appendiksoversigt 1A Indkøb af antibiotika/penicillin Sisimiut Sundhedscenter 2009 1B Indkøb af antibiotika på Sisimiut Sundhedscenter fra 2008 og 2009 2 Oversigt over biokemiske tests i API 20 E 3 Eksempel på tilfældigt sorteret liste 4 Antibiotikaafvejning til vækstmedier 5 Sterile kontroller 6A Rådata for hospitalet 6B Rådata for lossepladsen 6C Rådata for GEUS lade 6D Rådata for badevigen 6E Rådata for Frederik VII s Ø 7 Antal antibiotikaresistente bakterier fordelt på antibiotika 8 Statistik for antal antibiotikaresistente bakterier fordelt på antibiotika 9 Antal bakterier på lokaliteter 10 Statistik for antal bakterier på lokaliteter 11 Relativ antibiotikaresistens på lokaliteter 12A Statistik for relativ antibiotikaresistens i muslinger 12B Statistik for relativ antibiotikaresistens i fisk 12C Statistik for relativ antibiotikaresistens i sediment 13 Statistik for antibiotikaresistens fordelt på prøvetyper 14 API 20 E testresultater 15 Beskrivelse af supplerende bakteriekolonier udtaget til DNA-analyse

1 Indledning I Grønland praktiseres spildevandsrensning kun i sjældne tilfælde, og størstedelen af spildevandet udledes derfor urenset til bugter, fjorde og havet (Miljøstyrelsen, 2005). I den vestgrønlandske by, Sisimiut, udledes spildevand fra byens hospital til den nærmeste recipient, Ulkebugten. Spildevandet indeholder både antibiotikarester, humane antibiotikaresistente bakterier og humane patogener. Tilstedeværelsen af antibiotika i spildevandet vil kunne føre til udvikling af resistens hos bakterier i det omgivende miljø. Ligeledes vil tilstedeværelsen af antibiotika slå ikke-resistente bakterier ihjel. Forekomsten af resistente humane bakterier ved hospitalets spildevandsudløb vil kunne spredes til bundsedimentet og organismer i vandet. Ved en undersøgelse i 2009 blev fundet antibiotikaresistente bakterier i fisk og muslinger i Ulkebugten (Lozano og Saltini, 2009). Ved indtagelse af fisk og muslinger indeholdende resistente bakterier, vil bakterierne kunne spredes til andre omgivelser. Bakterier kan videregive antibiotikaresistent DNA (Golan et al., 2008), og det frygtes, at resistensen herved kan blive overført til højere trofiske niveauer. Samtidig er der en potentiel risiko for udvikling af antibiotikaresistente humane patogener. I Sisimiut beskæftiger fiskeindustrien en stor del af befolkningen. Hvis resistente bakterier i fremtiden forekommer i produkter fra fiskeindustrien, kan det, foruden de sundhedsmæssige og økologiske konsekvenser, få stor betydning for befolkningen og byens økonomi. For at undersøge forekomsten af antibiotikaresistens findes det relevant at undersøge området omkring hospitalets spildevandsudløb, hvor der udløber sanitært spildevand og ved lossepladsen, hvor sort spildevand udløber. Derudover undersøges forekomsten af antibiotikaresistens på to lokaliteter i Ulkebugten i retning mod havet, GEUS lade på den sydlige side og badevigen på den nordlige. Til sammenligning undersøges forekomsten af antibiotikaresistens på den ubeboede referencelokalitet, Frederik VII s Ø. Der er testet for antibiotikaresistens i bakterier fra blåmuslingers hepatopancreas, ulkes mavesække og tarme og fra bundsediment. Bakterierne er testet for tre forskellige antibiotika Benzylpenicillin, Amoxicillin og Ciprofloxacin. Benzylpenicillin er naturligt forekommende, mens Amoxicillin er semisyntetisk og Ciprofloxacin er syntetisk fremstillet (Madigan et al., 2008). Derudover omfatter dette arbejde et pilotstudie for Roxithromycinresistens, der ikke var en del af undersøgelsen i 2009. 1.1 Hypoteser I denne rapport undersøges følgende hypoteser H 1. Antibiotikaresistensen er størst ved hospitalets spildevandsudløb og mindskes i rækkefølgen, lossepladsen, GEUS lade, badevigen. H 2. Der er ingen antibiotikaresistens for de fire antibiotika på referencelokaliteten Frederik VII s Ø, som skyldes forureningen fra hospitalets spildevandsudløb. H 3. Der er en stigning i antallet af bakterier fra hospitalet og ud mod referencelokaliteten. H 4. Der er flest resistente bakterier for Benzylpenicillin, dernæst Amoxicillin og færrest resistente bakterier for Ciprofloxacin. H 5. Tendensen i H 1 og H 2 er tydeligst for blåmuslinger og sediment. H 6. Tendensen i H 3 er tydeligst for blåmuslinger og sediment. H 7. Antibiotikaresistensen er størst hos bakterier fra blåmuslinger og sediment sammenlignet med resistensen i bakterier fra ulke. H 8. Forekomsten af antibiotikaresistente bakterietyper varierer geografisk. 1

1.1.1 Problemformulering Formålet med dette bachelorprojekt er at undersøge forekomsten og udbredelsen af antibiotikaresistens i Ulkebugten som følge af hospitalets udledning af antibiotika og antibiotikaresistente bakterier. Denne problemstilling undersøges med udgangspunkt i følgende spørgsmål Hvor udbredt er antibiotikaresistensen i Ulkebugten? Forekommer der mest resistens for Benzylpenicillin, Amoxicillin eller Ciprofloxacin? Forekommer der mest resistens hos bakterier i ulke, blåmuslinger eller sediment? Hvilke bakterier er antibiotikaresistente i Ulkebugten? 2

2 Baggrund Herunder forklares den nuværende situation i Sisimiut og der præsenteres resultater fra sidste års undersøgelser. Dernæst følger afsnit om antibiotikas skæbne i miljøet og antibiotikaresistens. Efterfølgende præsenteres oplysninger om de fire antibiotika, der er testet for. Ligeledes gives en beskrivelse af de anvendte prøvetyper og de fem udvalgte prøvetagningslokaliteter. Desuden beskrives teorien bag de to bakterieidentifikationsmetoder, der er benyttet, API 20 E og DNA analyse. Endeligt beskrives baggrunden for den statistiske databehandling. 2.1 Situationen i Sisimiut Sisimiut er Grønlands næststørste by med omkring 5.500 indbyggere, hvis primære erhverv er fiskeri. Foruden de lokale fiskere er en af Royal Greenlands største rejefabrikker placeret ved havnen (Qeqqata Kommunia, 2010). Byen ligger omkring Ulkebugten, Kangerluarsunnguaq (Figur 2.1). Figur 2.1 Kort over Sisimiut Der er i Sisimiut, som i resten af Grønland, ingen rensning af spildevandet. Det ledes direkte ud i bugter og vige gennem spildevandsafløb. En spildevandsrapport udarbejdet af COWI for Miljøstyrelsen i 2005 konstaterer, at der ikke er nogen målelige påvirkninger på havet omkring Grønland, som følge af forurening. Dog ses lokale påvirkninger af bugter og vige, grundet dårlig vandudskiftning. Dette medfører en risiko for iltsvind og dannelse af metangas. Omkring spildevandsudløb kan der være synlige tegn på forureningen i form af eksempelvis grumset vand, papir og hygiejnebind. Ved store spildevandsudledninger blev der fundet lokale påvirkninger af dyre- og plantelivet, som var reduceret eller næsten ikke-eksisterende. På baggrund af rapporten blev det anbefalet, ikke generelt at installere avancerede biologiske rensningsanlæg, da de både er bekostelige og besværlige at etablere i Grønland. Derimod blev det konkluderet, at der i bugter og vige bør ske en simpel fjernelse af synlig forurening og større partikler, som ikke opløses eller omsættes (Miljøstyrelsen, 2005). Som følge af forurening er der forbud mod fiskeri i Ulkebugten. Der er fire spildevandsudløb i Sisimiut. I den nordlige del af byen er der et udløb ved havnen, ved Royal Greenlands rejefabrik og hospitalets spildevandsudløb. I den sydlige del af byen er spildevandsudløbet ved lossepladsen (Gunnarsdóttir, 2010). Ved hospitalets spildevandsudløb udledes sanitært spildevand, mens der ved lossepladsen udledes sort spildevand. På Sisimiut Sundhedscenter blev der i 2009 sammenlagt indkøbt omkring 33,6 kg antibiotika (Boassen, 2010; Appendiks 1A). Dele af antibiotikamængden ordineres til patienter på sundhedscenteret, og da flere typer antibiotika udskilles med urin og afføring som intakte stoffer (Bergheim et al., 2010), vil 3

disse udledes med hospitalets spildevand. Med spildevandet forventes samtidig udledning af humane antibiotikaresistente bakterier samt sygdomsfremkaldende organismer, patogener. På hospitalet anvendes flere forskellige typer antibiotika, heriblandt Benzylpenicillin, Amoxicillin, Ciprofloxacin og Roxithromycin, hvoraf der i 2009 blev indkøbt mest Amoxicillin (Tabel 2.1). Derudover er der også indkøbt en betydelig mængde Phenoxymethylpenicillin. En samlet opgørelse over indkøbt af antibiotika på Sisimiut Sundhedscenter i 2009 ses i Appendiks 1A. Tabel 2.1 Indkøb af Benzylpenicillin, Amoxicillin, Ciprofloxacin og Roxithromycin på Sisimiut Sundhedscenter i 2009. ATC er den anatomiske terapeutiske kemiske klassifikation. Præparat ATC Aktivt indholdsstof Masse [g] Stofmængde [mol] Benzylpenicillin J01CE01 Benzylpenicillinnatrium 306 0,92 Imacillin J01CA04 Amoxicillintrihydrat 600 1,64 Cifin J01MA02 Ciprofloxacin 200 0,60 Surlid J01FA06 Roxithromycin 240 0,29 Til sammenligning blev der i 2008 indkøbt mere Benzylpenicillin, Amoxicillin og Ciprofloxacin end i 2009 (Appendiks 1B). 2.1.1 Undersøgelser i 2009 I 2009 indledtes undersøgelser af forekomsten af antibiotikaresistens hos fisk og muslinger i Sisimiut. Der blev taget prøver på to forskellige lokaliteter i Ulkebugten, ved hospitalet og referencelokaliteten, Frederik VII s Ø (Lozano og Saltini, 2009). a b c Figur 2.2 (a-c) Antal af resistente bakterier for (a) Benzylpenicillin, (b) Amoxicillin og (c) Ciprofloxacin hos og bakterier i blåmuslingers hepatopancreas. CS = Hospital, ulke. RS = Frederik VII s Ø, ulke. CM = Hospital, blåmusling. RM = Frederik VII s Ø, blåmusling. Kilde: Lozano og Saltini, 2009. Undersøgelsen konkluderer, at der for Ciprofloxacin alene blev fundet resistente bakterier ved hospitalet, hvilket tyder på, at antibiotikaresistens er opstået som følge af hospitalets spildevandsudledning. Der var samtidig en større resistensforekomst for Amoxicillin ved hospitalet, hvilket ligeledes tyder på at amoxicillinresistensen er opstået her. Endeligt forekom ingen sammenhæng i resistens af Benzylpenicillin på de to lokaliteter (Figur 2.2) (Lozano og Saltini, 2009). 2.2 Antibiotika i miljøet Antibiotika kan påvirke bakterier i miljøet, hvorfor det er vigtigt at kende til antibiotikas skæbne og effekter i miljøet (Alexy et al., 2004). Der er generelt begrænset viden om konsekvenser forbundet med antibiotikaudledning til det akvatiske miljø. De afgørende processer for, hvor et antibiotikum ender i det akvatiske miljø, er sorption og nedbrydelighed (Kümmerer, 2009a). Sorption er en fællesbetegnelse for absorption og adsorption, der er måder hvorpå kemiske stoffer binder sig til faste stoffer, såsom sediment (Bjerg og Kjeldsen, 2004). Nedbrydningen kan ske ved biologisk nedbrydning og ved abiotisk nedbrydning, såsom fotolyse og hydrolyse (Kümmerer, 2009a). 4

Under arktiske forhold vil nedbrydning af antibiotika typisk foregå langsommere end i andre dele af verden, grundet de lave temperaturer, samt mangel på lys i vinterhalvåret. Foruden temperatur- og lysafhængighed, kan nedbrydelighed af antibiotika også afhænge af ph, suspenderet materiale, sammensætningen af den tilstedeværende mikrobielle population (Bergheim et al., 2010), turbiditet og vanddybde (Kümmerer, 2001). Da flere faktorer har indvirkning på nedbrydeligheden, vil en eksperimentielt bestemt halveringstid for et specifikt miljø ikke nødvendigvis kunne anvendes i et andet. Flere typer antibiotika viser sig imidlertid at være persistente i det akvatiske miljø og i bundsediment (Kümmerer, 2003; Hektoen et al.,1995). Sorption er afhængig af vandets ph, indhold af suspenderet materiale, antibiotikaets lipofilicitet, redokspotentiale, og den kemiske struktur af antibiotikummet (Kümmerer, 2009a). Da mange faktorer påvirker sorptionspotentialet, er det ikke muligt at estimere en pålidelig sorptionskoefficient. Eksempelvis vil en estimering af sorptionskoefficienten, K d, ved hjælp af oktanol/vand-fordelingskoefficienten, K ow, resultere i en underestimering (Kümmerer, 2009b). 2.3 Antibiotikaresistens En bakteries evne til at tilegne sig og overleve ændringer i deres omgivende miljø kaldes resistens. Antibiotika virker ved at hæmme og blokere for livsvigtige processer i bakterier. Imidlertid kan bakterier blive resistente overfor antibiotika på flere måder. Nogle bakterier er naturligt resistente overfor bestemte antibiotika, mens andre kan udvikle en resistens. Der skelnes således mellem naturlig resistens og udvikling af resistens. Naturlig resistens kan forekomme på følgende måder (Madigan et al., 2009) At bakterien mangler den type struktur, som antibiotikummet indvirker på og hæmmer. At bakterien er uigennemtrængelig for et givent antibiotikum. At bakterien ændrer strukturen på et antibiotikum, så det bliver inaktivt. At bakterien ændrer antibiotikummets angrebspunkt. At bakterien udfører en biokemisk reaktion, der kompenserer for antibiotikummets indvirkning. At bakterien udskiller et antibiotikum, der er trængt ind i cellen. Bakterier, der ikke er naturligt resistente, kan imidlertid tilegne sig disse forskellige egenskaber ved mutation i eget DNA eller ved optagelse af resistent DNA fra en anden kilde (Madigan et al., 2009). Bakterier kan videregive resistent DNA til datterceller ved celledeling, hvilket kaldes vertikal genoverførsel. Derudover kan bakterier udveksle resistent DNA ved horisontal genoverførsel. Horisontal overførsel kan forløbe ved enten transformation, transduktion eller konjugation. Transformation er når en bakterie optager et plasmid fra det omgivende miljø, eksempelvis fra en død bakterie. Transduktion er når to relaterede bakterier udveksler DNA ved hjælp af bakteriofager. Konjugation er derimod når to bakterier, der ikke nødvendigvis er relaterede, har direkte cellekontakt og der overføres et plasmid fra det ene til det andet. Dette formodes at være den primære horisontale genoverførsel (Todar, 2008). På verdensplan skønnes antibiotikaforbruget årligt at være på mellem 100.000 og 200.000 tons (Kümmerer, 2003). Ukorrekt brug af antibiotika er den primære årsag til den hurtige udvikling af antibiotikaresistens. Antibiotika bliver brugt klinisk meget hyppigere end nødvendigt. Det anslås, at brugen af antibiotika kan retfærdiggøres hos 20 % af patienterne med infektionssygdomme. Imidlertid bliver der ordineret antibiotika op til 80 % af tilfældene. Ydermere er det op til 50 % af sagerne, hvor der bliver ordineret forkert dosis eller varighed af behandlingen (Madigan et al., 2009). Ved udvikling af resistens for et antibiotikum, kan der samtidig udvikles resistens for antibiotika med samme virkningsmekanisme, men også for antibiotika med andre virkningsmekanismer, hvilket kaldes krydsresistens (Kümmerer, 2009c). 5

Ved spildevandsudløb forekommer flere lægemidler samtidig, hvilket kan give anledning til både additive, synergistiske og antagonistiske virkninger. Den additive virkning svarer til summen af virkningerne for de forskellige antibiotika. Ved synergisme vil antibiotika forstærke hinandens virkning, mens de ved antagonisme vil mindske hinandens virkning (Rand, 1995). Generelt er der mangel på viden om disse effekter (Kümmerer, 2009a). 2.4 Beskrivelse af de fire valgte antibiotika Der findes efterhånden mange forskellige typer antibiotika, hvor nogle er naturligt forekommende, mens andre udelukkende er syntetisk fremstillede. Antibiotika er klassificerede efter deres strukturelle opbygning, deres virkningsmekanisme og spektret af den antimikrobielle aktivitet (Madigan et al., 2009). I dette projekt er der fokus på de fire antibiotika Benzylpenicillin, Amoxicillin, Ciprofloxacin og Roxithromycin. Af disse hører både Benzylpenicillin og Amoxicillin til gruppen -lactamantibiotika. Ciprofloxacin hører til fluorquinolonerne og Roxithromycin til makroliderne (Madigan et al., 2009; Frimodt-Møller et al., 2010). 2.4.1 Benzylpenicillin Benzylpenicillin er også kendt under navnet Penicillin G, og var det første klinisk brugbare antibiotika og blev tilgængelig for almindeligt brug i slutningen af Anden Verdenskrig. Det er et naturligt antibiotika og tilhører, ligesom andet penicillin, gruppen af -lactamantibiotika, da det indeholder en - lactamring (Figur 2.3). Benzylpenicillin er primært aktivt mod Gram-positive bakterier, hvorimod Gram-negative bakterier er impermeable for denne type antibiotika. - lactamantibiotika virker hæmmende på cellevægssyntese hos bakterier. I en cellevægssyntese, der forløber korrekt, vil der Figur 2.3 Strukturformel for Benzylpenicillin. Kilde: Wolters Kluwer, 2010a dannes en krydsbundet forbindelse mellem to glycanbundne peptidkæder, en reaktion kaldet transpeptidation. Når Benzylpenicillin derimod er til stede, vil det gå ind og binde sig med enzymet transpeptidase, som derved forhindres i at katalysere transpeptidationsreaktionen. Dette resulterer i en cellevæg, der ikke er krydsbundet, hvorved den mister sin styrke og bakterien vil gå til grunde. Det er således forklaringen på, hvorfor Benzylpenicillin virker mod Gram-positive bakterier, men ikke Gram-negative. Den Gram-negative cellevæg har en flerlaget struktur og er langt mere kompleks end den Gram-positive cellevæg, der normalt er tykkere og næsten udelukkende består af én slags molekyle. En anden form for resistens forekommer typisk hos stafylokokker, der indeholder enzymet - lactamase, der er i stand til at spalte -lactamringen i de fleste penicilliner. (Madigan et al., 2009). Efter indtagelse af Benzylpenicillin udskilles omkring 70 % i aktiv form med urinen i løbet af seks timer (Lægemiddelstyrelsen, 2009a). 2.4.2 Amoxicillin Amoxicillin, der ligesom Benzylpenicillin er et penicillin i gruppen -lactamantibiotika, er semisyntetisk, dannet fra naturligt penicillin. Amoxicillin er, i modsætning til Benzylpenicillin, bredspektret (Madigan et al., 2009). Det virker således på flere forskellige typer bakterier, heriblandt også Gram-negative bakterier. Amoxicillin tilhører gruppen af aminopenicilliner, der har en positivt ladet aminogruppe på sidekæden (Figur 2.4) (Golan et al., 2008). Amoxicillins Figur 2.4 Strukturformel for Amoxicillin. struktur tillader, som mange andre semisyntetiske penicilliners strukturer, at det kan transporteres gennem Gram- Kilde: Wolters Kluwer, 2010b negative bakteriers yderste cellemembran. Derefter kan det lave cellevægssyntese tilsvarende synte- 6

sen i Gram-positive bakterier. Cellevægssyntesen resulterer i, at cellevæggen bliver ustabil og bakterien ikke kan formere sig, og i stedet dør (Madigan et al., 2009). Netop fordi Amoxicillin er bredspektret, er risikoen for at udvikle resistens større end for eksempelvis Benzylpenicillin (Medicinhåndbogen, 2010). Ved indtagelse af Amoxicillin udskilles cirka 60 til 70 % uomdannet i urinen i løbet af seks timer (Lægemiddelstyrelsen, 2009b). 2.4.3 Ciprofloxacin Hvor Benzylpenicillin og Amoxicillin virker ved cellevægssyntese er Ciprofloxacin en fluorquinolon og hører overordnet til quinoloner, hvis virkningsmekanisme er at hæmme aktiviteten af DNA-gyrase. DNA-gyrase er et essentielt enzym i bakteriecellen, da det er nødvendigt for at kunne pakke og komprimere DNA. Eftersom DNA-gyrase findes i alle bakterier, både Gram-positive og Gram-negative er Ciprofloxacin et effektivt bredspektret antibiotikum. DNA-gyrase findes ikke i humane celler og påvirker derved ikke den menneskelige DNA (Madigan et al., 2009). Den kemiske struktur ses i Figur 2.5. Figur 2.5 Strukturformel for Ciprofloxacin. Kilde: ChemicalBook, 2008a Under nogle omstændigheder har Ciprofloxacin et stort sorptionspotentiale til sediment (Kümmerer, 2009b). Samtidig viser quinoloner sig typisk at have en længere halveringstid i det akvatiske miljø, sammenlignet med flere β-lactamantibiotika (Kümmerer, 2001). Ciprofloxacin udskilles både med urin og afføring. Omkring 45 % udskilles uomdannet med urin, mens 25 % udskilles fækalt (Lægemiddelstyrelsen, 2009c). 2.4.4 Roxithromycin Roxithromycin hører til gruppen af makrolider. Antibiotika i denne gruppe indeholder alle en makrocyklisk lactonring (Figur 2.6) (Frimodt-Møller et al., 2010). Virkningsmekanismen hos makrolider er, at de binder sig til 50S-delen af ribosomet, hvilket medfører, at proteinsyntesen bliver hæmmet. Roxithromycin virker både mod Gram-positive og Gramnegative bakterier og er derfor ligesom Amoxicillin og Ciprofloxacin et bredspektret antibiotika (Madigan et al., 2009). Roxithromycin udskilles primært fækalt, da 65 % udskilles med afføring og 12 % udskilles med urinen (Lægemiddelstyrelsen, 2009d). Figur 2.6 Strukturformel for Roxithromycin. Kilde: ChemicalBook, 2008b 2.5 Prøvetyper Bakterierne i dette projekt er udtaget fra tre forskellige prøvetyper; fisk, muslinger og sediment. Af fisk er der brugt ulke og af muslinger er der anvendt blåmuslinger. 7

2.5.1 Ulk Der er 11 grønlandske arter i ulkefamilien (Nielsen et al., 1992). Den almindelige ulk, Myoxocephalus scorpius (Figur 2.7), er en bundfisk, der typisk lever på lavt vand (Nielsen, 1990). Ulken svømmer dårligt og ligger derfor typisk på lur på havbunden, hvor den æder næsten alt levende, der passerer den (Steffensen, 2006). Flere ulketyper er inaktive om dagen og søger føde efter mørkets frembrud (Nielsen, 1990). 2.5.2 Blåmusling Den almindelige blåmusling, Mytilus edulus, lever på klippeskær og ved stenede kyster i tidevandszonen (Dance, 1993). Blåmuslingerne sidder oftest hæftet sammen i store klynger, på sten i vandet. De sidder derved det samme sted og filtrerer vandet for spiselige partikler, såsom plankton (Born og Böcher, 1999). 2.6 Prøvetagningslokaliteter i Sisimiut I dette projekt er der valgt fem prøvetagningslokaliteter. Da der ved hospitalets spildevandsudløb udledes sanitært spildevand indeholdende antibiotikarester og allerede antibiotikaresistente bakterier, formodes antibiotikakoncentrationen, og dermed resistensen, at være størst her. Den ene lokalitet er derfor, ligesom sidste års undersøgelser, ved hospitalets spildevandsudløb, i Ulkebugtens sydlige del. Derudover er der taget prøver ved lossepladsen, hvor der udledes sort spildevand. To andre lokaliteter er Figur 2.8 Lokaliteternes placering i Sisimiut Figur 2.7 Den almindelige ulk, Myoxocephalus scorpius Kilde: ViggoWebWorld valgt i Ulkebugten, GEUS lade i den sydlige del, og badevigen i den nordlige. Fra hospitalet er begge placeret i retning mod havet. Det sidste af de fem prøvetagningssteder er et referencested. Det ligger ved Frederik VII s Ø, Qeqertarmiut, der er ubeboet, hvorfor vandet formodes rent og uden antibiotika (Figur 2.8). 2.7 Bakterieidentifikation Der er flere muligheder for at identificere bakterier. En mulighed er at benytte API 20 E tests, der består af 21 minimerede biokemiske tests. En mere præcis identifikationsmetode er DNA-sekventering, hvor rækkefølgen af bakteriens nukleotider bestemmes. 2.7.1 API 20 E Til at identificere antibiotikaresistente bakterier kan det standardiserede identifikationssystem, API 20 E benyttes. Ved API 20 E tests kan identificeres visse Enterobacteriaceae og ikke-kræsne Gramnegative stave. Testen omfatter 21 biokemiske in-vitro tests (Appendiks 2) samt en database over mulige identificerbare mikroorganismer. Bakteriekolonien, der ønskes identificeret blandes med et suspensionsmedium, hvorefter det fordeles i 20 forskellige brønde på API-strippen. Nogle reaktioner vil ske spontant, mens andre kræver tilsætning af andre reagenser. Det kan tage et par dage før alle reaktioner kan aflæses (BioMérieux, 2007). 8

2.7.2 DNA analyse For at kunne identificere bakterier ud fra en DNA analyse, er det nødvendigt først at amplificere dele af DNA et ved hjælp af polymerasekædereaktion, PCR. PCR udføres in-vitro, ved hjælp af enzymet DNA polymerase, der kan kopiere DNA molekyler. DNA ets PCR amplifikation kan opdeles i følgende fire trin DNA opvarmes for at de to strenge adskilles. To primere binder sig under afkøling til hver sin DNA-streng. DNA polymerase bruger de originale DNA-strenge som skabeloner, med udgangspunkt i primerenes position, og der påsættes korresponderende baser til strengen. Efter en inkubationstid forløber processen igen, hvor mængden af DNA igen fordobles. Derved sker en eksponentiel stigning i mængden af DNA. Ved brug af DNA polymerase fra T. aquaticus kan processen effektiviseres, idet T. aquaticus kan modstå høje temperaturer og DNA polymerase dermed ikke skal tilsættes ved hver endt cyklus (Madigan et al., 2009). DNA-sekvensen kan herefter kortlægges ved brug af DNA-sekventering, hvor rækkefølgen af de fire nukleotidtyper bestemmes (Madigan et al., 2009). Under PCR er der risiko for udvikling af biprodukter, såsom primer-dimer. Dette forekommer når to primere binder sig til hinanden i stedet for at binde sig til DNA, og herefter amplificeres. Udvikling af biprodukter kan undgås ved at optimere de fysisk-kemiske omstændigheder ved PCR (Das et al., 1999). 2.8 Statistisk databehandling Den statistiske databehandling benyttes til at påvise om der er signifikante forskelle i forekomsten af antibiotikaresistens. Ved ensidig variansanalyse testes nulhypotesen om, at der er homogenitet mellem uafhængige grupper. I praksis testes om grupperne har samme middelværdi. Herved kan det vurderes, hvor meget af den samlede variation af data, der skyldes forskelle mellem gruppernes middelværdier og hvor meget, der skyldes variationen af data inden for grupperne. Brugen af ensidig variansanalyse kræver at data er normalfordelt (Johansen, 2002). Statistisk signifikans og statistisk insignifikans afgrænses ved signifikansniveauet p = 0,05. Ved p- værdier over 0,05 kan det betyde, at forskelle i grupper er tilfældige, mens p-værdier under 0,05 kan afspejle ikke-tilfældige variationer (Johansen, 2002). 9

3 Metoder og materialer I det følgende beskrives hvilke metoder og materialer, der er benyttet til ekstraktion og dyrkning af bakterier fra sediment, muslinger og fisk samt bakterieidentifikation ved API 20 E test og DNA analyse. Endeligt beskrives fremgangsmåden for den statistiske databehandling. 3.1 Systematisering af petriskåle Fra hver af de fem prøvetagningslokaliteter blev taget tre replikater af de tre prøvetyper, sediment, blåmuslinger og ulke. For hvert replikat blev lavet tre subreplikater. For at få tilstrækkelig mængde mavesæk og hepatopancreas fra henholdsvis fisk og muslinger per subreplikat, krævedes der langt færre ulke end muslinger. Dette giver større usikkerhed for dataene fra fisk, hvorimod muslinger vil være mere repræsentative. Hvert subreplikat blev udsat for Benzylpenicillin, Amoxicillin, Ciprofloxacin og Roxithromycin og derudover blev der lavet kontrolplader uden antibiotika, for at kunne sikre sig, at bakterierne groede på vækstmediet og for at vide hvor mange bakterier, der forekommer på de fem lokaliteter. Desuden blev der lavet et par sterile kontroller for hvert vækstmedie, for at kontrollere, at mediet ikke var forurenet. Antallet af petriskåle, der blev brugt, var da: 5 (lokaliteter) 3 (prøvetyper) 3 (replikater) 3 (subreplikater) 5 (behandlinger) = 675 petriskåle Petriskålene opdeltes efter prøvetagningssted og prøvetype og nummereredes fra 1-45. Pladerne anførtes prøvetagningssted ved et bogstav fra A-E, og om der var tale om bakterier fra sediment, musling eller fisk med S, M eller F. I Microsoft Office Excel opstilledes tilfældigt sorterede lister for 45 plader indenfor hver lokalitet og prøvetype (Appendiks 3). Herved fremgik det ikke direkte af petriskålene hvilken behandling bakterierne fik, hvilket sikrede en objektiv tælling af bakteriekolonierne. 3.2 Anskaffelse af sediment, muslinger og fisk Sedimentet blev gravet op fra enten båd eller land, ved brug af en gribeskovl. For hvert prøvetagningssted anvendtes 10 g sediment til hvert replikat. For Lossepladsen var det ikke muligt at anskaffe sediment, men for de andre lokaliteter var der rigelig sedimentprøve. Blåmuslinger sidder typisk fast på sten og klipper, hvorfor de nemmest kunne samles ved lavvande. For at få 8,3 g hepatopancreas, der udgør muslingens fordøjelsesorgan, per replikat skulle bruges 30-40 muslinger per lokalitet. Der skulle som minimum bruges tre større ulke fra hvert prøvetagningssted, for at have 8,3 g mavesæk og tarme per replikat. Ulkene var nemmest at fiske ved højvande og ved skumringstid. For GEUS lade var der ikke tilstrækkeligt store ulke til at udtage 8,3 g mavesæk per replikat, og mængden af LBmedie blev derfor nedskaleret. Ved hospitalet, GEUS lade og badevigen anvendtes tre fisk per lokalitet, en per replikat. Ved Frederik VII s Ø blev to fisk brugt, hvor replikat 3 var en blanding af replikat 1 og 2. Ved lossepladsen blev brugt fire fisk, en til hver af replikaterne 1 og 2, og to fisk til replikat 3. 3.3 Dyrkning af marine bakterier fra sediment, muslinger og fisk Dyrkning af bakterierne fra sediment er forskellig fra dyrkningen af bakterier fra muslinger og fisk når det angår vækstmedie, ekstraktion af bakterier og opbevaring af plader. Herunder beskrives de anvendte procedurer. 10

3.3.1 Fremstilling af vækstmedie til sedimentbakterier Til sedimentbakterierne blev der fremstillet vækstmedie med og uden agar. Vækstmediet med agar anvendtes til petriskåle og vækstmediet uden agar blev fremstillet til bakterier udvalgt til DNAanalyse. Vækstmediet blev fremstillet til fire lokaliteter, da det ikke var muligt at skaffe sediment fra lossepladsen. For referencelokaliteten blev der ved en fejl fremstillet for mange plader for replikat 1. Der forekom derved 45 plader for replikat 1, 15 for replikat 2 og 15 for replikat 3. For hver lokalitet blev der fremstillet et vækstmedie med agar for hvert antibiotikum og en kontrolflaske. Fremstillingen af vækstmediet til sediment foregik over to gange af henholdsvis 600 ml filtreret havvand per behandling for prøverne fra Frederik VII s Ø og 800 ml filtreret havvand per behandling for prøverne fra hospitalet, GEUS lade og badevigen. Til i alt 1.400 ml filtreret havvand per behandling tilsattes 21 g agar, 1,4 g gærekstrakt og 7 g fiskepepton. For hver lokalitet fordeltes ingredienserne i fem 1 liters flasker, tilsattes magneter og autoklaveredes med låget løst skruet på. Efter autoklavering blev flaskerne afkølet til 60 C på magnetomrører. Efter afkøling tilsattes antibiotika, svarende til 50 µg/ml agar (Lozano og Saltini, 2009). Det præcise antal gram antibiotika der benyttedes fremgår af Appendiks 4. Der fremstilledes 300 ml vækstmedie uden agar ved samme fremgangsmåde. 3.3.2 Fremstilling af vækstmedie til bakterier fra muslinger og fisk Til bakterier fra muslinger og fisk fremstilledes Luria-Bertani-medium med og uden agar. LB-mediet med agar anvendtes til petriskåle, mens mediet uden agar anvendtes til inkubation af bakterier og til bakterier udvalgt til DNA-analyse. LB-mediet med agar blev, for hvert antibiotikum samt en kontrolflaske, fremstillet i en 1 liters flaske af demineraliseret vand, 10 g bacto-trypton, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl og 15 g agar. Derefter afstemtes ph til 7,0 med natriumhydroxid, NaOH og volumen afstemtes til 1 l med demineraliseret vand. Der tilsattes magneter og flaskerne autoklaveredes med låget løst skruet på. For Ciprofloxacin og Roxithromycin tilsattes 50 mg antibiotika til 1.000 ml vækstmedie, svarende til 50 µg/ml. For Benzylpenicillin og Amoxicillin tilsattes 100 mg antibiotika til 1.000 ml vækstmedie, svarende til 100 µg/ml (Lozano og Saltini, 2009). Antibiotikummet tilsattes efter opløsning i 6 ml sterilt filtreret havvand. Det præcise antal gram antibiotika, der benyttedes fremgår af Appendiks 4. Fremstillingen af vækstmediet til bakterier fra fisk og muslinger foregik over tre gange af henholdsvis 1.000 ml agar for lokaliteterne GEUS lade og Frederik VII s Ø, 1.000 ml agar for lokaliteterne hospitalet og lossepladsen og 500 ml agar for badevigen. Der blev desuden fremstillet 1 l LB-medie ved samme fremgangsmåde, blot uden agar. 3.3.3 Fremstilling af plader Der hældtes cirka 25 ml vækstmedie med agar, med og uden antibiotika, i et tyndt lag i de afmærkede petriskåle. Der blev lavet et par ekstra kontrolplader til steril kontrol for hvert vækstmedie, hvor der hverken tilsattes antibiotika eller bakteriekultur. Låget til petriskålene placeredes, så kondens kunne fordampe, og efter omkring 10 minutter lagdes lågene på petriskålene, og pladerne opbevaredes med bunden opad for at undgå at yderligere kondensation ville forekomme på vækstmediets overflade. 3.3.4 Ekstraktion af sedimentbakterier Ekstraktionen af sedimentbakterier skete ved at blande 10 g sigtet sediment fra hvert replikat med 50 ml autoklaveret, filtreret havvand i et sterilt falcon-rør. Blandingen rystedes i to minutter og bundfældede i 30 sekunder, hvorefter vandfasen overførtes til en anden falcon-tube. 11

3.3.5 Ekstraktion af bakterier fra muslinger og fisk Ekstraktionen af bakterier fra ulke og blåmuslinger blev gjort i henhold til kriterier defineret af den europæiske forordning (EF) nr. 2073/2005 for mikrobiologiske kriterier for fødevarer. Dele af EN/ISO 6579 blev brugt. Billede 3.1 Blåmuslinger fra hospitalet. Billede 3.2 Blåmuslingers hepatopancreas. Billede 3.3 Ulk fra hospitalet Ved dissektion af blåmuslinger blev brugt hepatopancreas (Billede 3.1, Billede 3.2). For ulke blev der, foruden mavesæk og tarme, brugt maveindholdet (Billede 3.3). 8,3 g hepatopancreas fra muslinger eller mavesæk og tarme fra fisk blandedes med 75 ml LB-medie i en flaske med magnet og inkuberedes på magnetomrører i 24 timer ved stuetemperatur (Billede 3.4). 3.3.6 Podning af plader Efter inkubation rystedes flasken og hvilede i et halvt minut inden der blev udtaget 0,1 ml af opløsningen. For Benzylpenicillin, Amoxicillin og kontrol fortyndedes bakteriekulturen 10.000.000 gange, Ciprofloxacin og Roxithromycin fortyndedes 10.000 gange. Fortyndingen af bakteriekulturerne blev foretaget for at sikre, at det var muligt at tælle bakteriekolonierne på pladerne. De fortyndede bakterieopløsninger fra fisk, muslinger og sediment vendtes et par gange, og fra den overliggende vandfase blev overført 100 µl til en petriskål med agar og fordeltes over pladen med en Drigalski spatel (Billede 3.5). Spatlen blev efterfølgende desinficeret ved at dyppe den i ethanol og brænde den over gasbrænder. For at spare tid blev spatlen sat til afkøling i demineraliseret vand. Efter podning blev låget sat på pladen og pladerne vendt med bunden nedad for at sikre, at bakterierne satte sig på vækstmediet. Efter omkring 10 minutter blev pladerne vendt med bunden opad for at undgå kondensering på bakteriekolonierne. Petriskåle med sedimentbakterier blev opbevaret i køleskab ved 6 C, mens de for pladerne med muslinge- og fiskebakterier opbevaredes i et skab ved omkring 20 C. Det skyldes, at bakterier fra fisk og muslinger er vant til højere temperaturer end bakterier i sediment. Billede 3.4 Tre subreplikater af bakteriekulturer fra henholdsvis ulke og blåmuslinger Billede 3.5 Podning af petriskål. 3.3.7 Tælling af bakteriekolonier Bakteriekolonierne taltes så snart det observeredes, at bakterierne groede. For muslinger og fisk var det typisk muligt at tælle kolonier efter 24 timer, mens det for sedimentbakterier tog omkring 60 timer. Hver talt koloni markeredes med permanent tusch for at sikre, at samme koloni ikke blev talt flere gange. For plader med stor bakteriel vækst, blev det antaget, at væksten var den samme over hele 12

pladen, og der taltes enten halvdelen, fjerdedelen eller ottendedelen af pladen og ganget op. Bakteriekolonierne taltes indtil 48 timer for fisk og muslinger og 108 timer for sediment, da der ikke forekom væsentlig vækst herefter. 3.4 Fremgangsmåde ved API 20 E Der var en begrænsning på 100 API strips. Der blev derfor udvalgt cirka 20 kolonier per prøvetagningssted. Primært blev brugt bakteriekolonier fra muslinger behandlet med Amoxicillin og Ciprofloxacin. I tilfælde af manglende kolonier behandlet med Ciprofloxacin fra muslinger, blev kolonier fra fisk benyttet. Billede 3.6 Aflæste API strips. De udvalgte bakteriekolonier blev overført til et suspensionsmedium, hvor bakteriekolonien blev grundigt opblandet. Der fordeltes 5 ml demineraliseret vand på inkubationsæskens bund. API strippen anbragtes i inkubationsæsken. Suspensionsmediet tilførtes rørene på API strippen, hvor rørene for testene CIT, VP og GEL blev helt fyldt. For de resterende tests fyldtes rørene halvt. Testene ADH, LDC, ODC, H 2S og URE blev tildækket med mineralsk olie, for at skabe et anaerobt miljø (BioMérieux, 2007). Æsken blev lukket og inkuberedes ved stuetemperatur i minimum 48 timer, eller til reaktionerne kunne aflæses. Resultaterne fra testene analyseredes til at være positive eller negative, afhængig af hvilken farve opløsningerne i rørene havde (Billede 3.6). Ved indtastning af testresultaterne i BioMérieuxs online database, APIweb, fremkom identificerede eller sandsynlige organismer. 3.5 Fremgangsmåde ved DNA analyse Alle bakteriekolonier anvendt i API testen blev også testet ved DNA analyse. Derudover udvalgtes nogle bakteriekolonier, så samtlige prøvetyper og alle typer antibiotika var repræsenteret. Kolonier blev udvalgt således, at forskelligt udseende bakterier blev testet. Bakteriekolonien, der ønskedes identificeret, opsamledes direkte fra petriskålen med en steril pind og omrørtes i 250 µl vækstmedie uden agar (Billede 3.7). Bakteriekulturen blev omrystet i mindst 24 timer inden nedfrysning. Billede 3.7 Opsamling af bakteriekoloni. 3.5.1 Ekstraktion af DNA Der ekstraheredes DNA fra 178 bakteriekulturer på to plader med plads til 96 PCR rør. Bakteriekulturen optøedes og 30 µl pipetteredes til 0,2 ml PCR rør. Der tilsattes 85 µl 10 % 3M TES pufferopløsning per rør og pladen omrystedes i en time. 85 µl 6,25 M ammoniumacetat, NH 4Ac, tilsattes brøndene med multipipette og der centrifugeredes i 30 minutter. Vandfasen overførtes til tomme PCR rør og der fyldtes op med 80 µl isopropanol og bakteriekulturen inkuberedes i en fryser i en time. Prøverne optøede og vandfasen blev fjernet og bundfaldet rensedes med 70 % ethanol. Prøverne blev centrifugeret i 15 minutter og ethanol fjernedes. Overskydende ethanol fordampede, og efterfølgende blev der tilsat 50 µl TES buffer, hvorefter prøverne blev nedfrosset. DNA-koncentrationer måltes med Nano-drop, og tilstedeværelsen af DNA blev testet på en 1 % agarose gel. 3.5.2 Polymerasekædereaktion (PCR) Der blev lavet en grundblanding til prøverne bestående af 3 µl Taq puffer, 0,75 µl dntp, 0,75 µl F, 0,75 µl R, 0,75 µl BSA, 19,5 µl MQ og 1,5 µl Taq, per rør. Der fordeltes 27 µl af grundblandingen og 3 µl prø- 13

ve per PCR rør. De to plader af henholdsvis 96 rør kørtes på PCR maskinen og kvaliteten af PCR produkterne blev tjekket på en 1 % agarose gel. 3.5.3 DNA-sekventering DNA-sekventeringen vil blive foretaget ved normal automatisk sekventering af Macrogen i Korea (Macrogen, 2005). 3.6 Variansanalyse Der udførtes en ensidig variansanalyse for uafhængige prøver i online applikationen, VasserStats, for at finde statistisk signifikans indenfor grupper og mellem grupper (Lowry, 2010). Variansanalysen udførtes med statistisk signifikansniveau α=0,05 og nulhypotesen, H 0, at grupperne var ens, og der ikke forekom statistisk signifikans. Ligeledes blev antaget normalfordelt data. Der testedes for statistisk signifikans for følgende datasæt Antallet af bakterier på lokaliteterne. Relativ antibiotikaresistens fordelt på lokaliteter. Relativ antibiotikaresistens fordelt på prøvetyper. Antal af antibiotikaresistente bakterier fordelt på antibiotika. 14

4 Resultater I dette afsnit gennemgås kvaliteten af prøvetyperne og kontrol af sterilitet i petriskåle med agar. Samtidig præsenteres fordelingen i antallet af antibiotikaresistente bakterier på antibiotika, antallet af bakterier på de fem lokaliteter. Dernæst vises fordelingen af relativ antibiotikaresistens på både lokaliteter og prøvetyper. Endvidere fremgår resultaterne for pilotstudiet af roxithromycinresistens. Endeligt er resultater fra API 20 E tests og DNA analyse for bakterieidentifikation præsenteret. 4.1 Kvalitet af prøvetyper Blåmuslingerne var fra alle lokaliteter af varierende størrelse, dog især store ved hospitalet. Størrelsen af ulkene varierede. Mavesækkene indeholdt typisk små snegle, krabber og tanglopper. For samtlige lokaliteter viste fiskene ingen tegn på sygdom, med undtagelse af replikat 1 og 3 fra hospitalet, hvor levernes farve afveg fra replikat 2, der ikke synligt var inficeret med parasitter (Billede 4.1). I replikat 3 var der levende parasitter i alle organer. Kvaliteten af sedimenterne varierede mellem de forskellige lokaliteter (Tabel 4.1). Vandfasen var klar for GEUS lade, badevigen og Frederik VII s Ø, hvorimod den var mørk og uklar ved hospitalet. Prøverne fra hospitalet var ildelugtende og indeholdt både hår, plastre og hygiejnebind. Sedimenterne for GEUS lade og Frederik VII s Ø blev siet for at gøre sedimentet mere finkornet og fri for større skaller. Billede 4.1 Levere fra ulke ved hospitalet. Tabel 4.1 Beskrivelse af sedimentkvaliteten på lokaliteterne Lokalitet Beskrivelse Hospital Sort, olieret, finkornet. Indeholdt plastre, hygiejnebind og hår GEUS lade Primært skaller og sand Badevig Fint, gråt sand Frederik VII s Ø Primært skaller og sand 4.2 Sterilitetskontrol Efter 72 timer observeres bakterier i samtlige sterile kontroller uden antibiotika med undtagelse af mediet for sediment ved Frederik VII s Ø (Appendiks 5). I prøverne fra fisk og muslinger ved badevigen gror bakterier på medierne med Benzylpenicillin, Amoxicillin og Roxithromycin. I mediet til sedimenter for lokaliteterne hospitalet, GEUS lade og badevigen forekommer der bakterier ved Roxithromycin. Hertil skal det påpeges, at data for antibiotikaresistens er fundet efter 48 timer. Her var antallet af bakterier lavere på de sterile kontroller der taltes efter 48 timer. 4.3 Databehandling Der er beregnet 95 % konfidensintervaller på baggrund af standardafvigelser for resultaterne i afsnittene 4.4, 4.5, 4.6 og 4.7. Generelt forekommer store konfidensintervaller for denne type data. Ved brug af ensidig variansanalyse er antaget normalfordelte data for resultaterne i afsnittene 4.4, 4.5, 4.6 og 4.7. Ved sammenligning af median og middelværdi for enkelte datasæt, ses dog ingen normalfordelte data. Enkelte steder er subreplikater udtaget fra databehandlingen, da disse er en eller flere størrelsesordener forskellige fra de øvrige subreplikater (Appendiks 6A-C). 15

CFU 10 7 /g prøve CFU 10 7 /g prøve CFU 10 7 /g prøve CFU 10 7 /g prøve 4.4 Fordeling af antibiotikaresistente bakterier på antibiotika I det følgende præsenteres resultater for antallet af antibiotikaresistente bakterier fordelt på antibiotika for bakterier i henholdsvis muslingers hepatopancreas, ulkes mavetarmsystem og sediment. Antallet angives i kolonidannende enheder, CFU, per gram prøve. Data er fra hospitalet og Frederik VII s Ø. Fordelingen ved de øvrige lokaliteter er angivet i Appendiks 7. Figur 4.1 Resistente bakterier i blåmuslingers hepatopancreas i CFU 10 7 /g prøve ved hospitalet, fordelt på antibiotika med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Figur 4.2 Resistente bakterier i blåmuslingers hepatopancreas i CFU 10 7 /g prøve ved Frederik VII s Ø, fordelt på antibiotika med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. For bakterier i blåmuslingers hepatopancreas forekommer flest benzylpenicillinresistente bakterier, efterfulgt af amoxicillinresistente bakterier. Antallet af Ciprofloxacinresistente bakterier er flere størrelsesordener lavere end for Benzylpenicillin og Amoxicillin. Tendensen gør sig gældende for både hospitalet og Frederik VII s Ø, med små 95 % konfidensintervaller ved Frederik VII s Ø (Figur 4.1, Figur 4.2). 1 1 2 Figur 4.3 Resistente bakterier i ulkes mavesække og tarme CFU 10 7 /g prøve ved hospitalet, fordelt på antibiotika med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Tallene 1-2 refererer til signifikant forskellige grupper. Figur 4.4 Resistente bakterier i ulkes mavesække og tarme i CFU 10 7 /g prøve ved Frederik VII s Ø, fordelt på antibiotika med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Der er flest amoxicillinresistente bakterier i ulkes mavesække og tarme sammenlignet med antallet af benzylpenicillinresistente bakterier for begge lokaliteter. Igen er antallet af ciprofloxacinresistente bakterier flere størrelsesordener lavere (Figur 4.3, Figur 4.4). Ved hospitalet er antallet af ciprofloxacinresistente bakterier signifikant forskellig fra bakterier resistente for Benzylpenicillin og Amoxicillin (Appendiks 8). 16

CFU 10 7 /g prøve CFU 10 7 /g prøve CFU 10 7 /g prøve CFU 10 7 /g prøve CFU 10 7 /g prøve Figur 4.5 Resistente bakterier i sediment i CFU 10 7 /g prøve ved hospitalet, fordelt på antibiotika med 95 % konfidensinterval. Data er for 108 timer. Figur 4.6 Resistente bakterier i sediment i CFU 10 7 /g prøve ved Frederik VII s Ø, fordelt på antibiotika med 95 % konfidensinterval. Data er for 108 timer, beregnet ud fra data fra 96 og 120 timer. Ved hospitalet forekommer flest amoxicillinresistente bakterier fra sediment i forhold til antallet af benzylpenicillinresistente bakterier. Der er ingen ciprofloxacinresistente bakterier ved hospitalet (Figur 4.5). Antallet af benzylpenicillinresistente bakterier er ved Frederik VII s Ø flere størrelsesordener højere end for Amoxicillin og Ciprofloxacin (Figur 4.6). 4.5 Antal bakterier på lokaliteterne For at kende fordelingen af bakterieantallet på de fem lokaliteter anvendes bakterieprøver fra henholdsvis blåmuslinger, ulke og sediment uden tilsætning af antibiotika (Appendiks 9). 1 1 1 1 2 1 1 2 1 Figur 4.7 Antal bakterier i kontrolprøver fra blåmuslingers hepatopancreas på lokaliteterne, angivet i CFU 10 7 /g prøve med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Tallene 1-2 refererer til signifikant forskellige grupper. Figur 4.8 Antal bakterier i kontrolprøver fra ulkes mavesække og tarme på lokaliteterne, angivet i CFU 10 7 /g prøve med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Figur 4.9 Antal bakterier i kontrolprøver i sediment på lokaliteterne, angivet i CFU 10 7 /g prøve med 95 % konfidensinterval. Data er for 108 timer. Tallene 1-2 refererer til signifikant forskellige grupper. Der er ingen data fra lossepladsen. Antallet af bakterier fra blåmuslingers hepatopancreas og ulkes mavetarmbakterier stiger fra hospitalet mod Frederik VII s Ø (Figur 4.7, Figur 4.8). Eneste afvigelse i stigningen forekommer ved GEUS lade for blåmuslinger. Antallet af bakterier i blåmuslinger og ulke for GEUS lade er beregnet på baggrund af data fra 36 og 60 timer, da disse ikke blev talt efter 48 timer (Appendiks 6C). Antallet af bakterier ved Frederik VII s Ø er signifikant forskellig fra antallet af bakterier ved de øvrige lokaliteter (Appendiks 17

% kontrol 10), med en estimeret værdi på 200.000 CFU 10 7 /g prøve. Antallet af bakterier er estimeret, da pladerne var overgroede og det ikke var muligt at tælle bakteriekolonierne. Antallet af mavetarmbakterier fra ulke ved Frederik VII s Ø er 89.000 CFU 10 7 /g prøve (Appendiks 9). For antallet af bakterier i sediment forekommer ligeledes en stigende tendens fra hospitalet mod Frederik VII s Ø, hvor antallet af bakterier dog er større ved badevigen end for Frederik VII s Ø. Antallet af bakterier ved badevigen er signifikant forskellig fra de resterende lokaliteter (Figur 4.9). Hertil skal nævnes, at antallet af bakterier i replikat 3 er estimeret til at være 95.500 CFU 10 7 / g prøve, da det ikke var muligt at tælle bakteriekolonierne (Appendiks 6D). 4.6 Relativ antibiotikaresistens For at kunne sammenligne forekomsten af antibiotikaresistens mellem henholdsvis lokaliteter og prøvetyper, er antibiotikaresistensen præsenteret relativt, som procent af kontrolprøverne (Appendiks 11). Rådata for de enkelte lokaliteter er angivet i Appendiks 6A-E. 4.6.1 Fordeling af antibiotikaresistente bakterier på lokaliteter Der forekommer, for bakterier i blåmuslingers hepatopancreas, den største relative benzylpenicillinresistens ved hospitalet, efterfulgt af lossepladsen og badevigen. Ved GEUS lade er benzylpenicillinresistensen en størrelsesorden mindre og ved Frederik VII s Ø forekommer næsten ingen resistens (Figur 4.10). Den relative amoxicillinresistens i bakterier fra blåmuslingers hepatopancreas er faldende fra hospitalet mod Frederik VII s Ø. Hospitalet og Frederik VII s Ø tilhører to signifikant forskellige grupper (Figur 4.11; Appendiks 12A). Der forekommer for Ciprofloxacin næsten ingen resistens hos bakterier fra blåmuslingers hepatopancreas. Forekomsten af resistens varierer mellem lokaliteterne, dog ses den højeste forekomst af resistens ved hospitalet og den laveste ved Frederik VII s Ø (Figur 4.12). 1 2 Figur 4.10 Benzylpenicillinresistente bakterier i blåmuslingers hepatopancreas som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Figur 4.11 Amoxicillinresistente bakterier i blåmuslingers hepatopancreas som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Tallene 1-2 refererer til signifikant forskellige grupper. Figur 4.12 Ciprofloxacinresistente bakterier i blåmuslingers hepatopancreas som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Den største relative benzylpenicillinresistens forekommer ved hospitalet og lossepladsen, efterfulgt af badevigen for bakterier i ulkes mavesække og tarme. Den laveste forekomst af resistens forekommer ved GEUS lade og Frederik VII s Ø (Figur 4.13). 18

% kontrol % kontrol % kontrol Forekomsten af amoxicillinresistente mavetarmbakterier fra ulke er faldende fra hospitalet mod Frederik VII s Ø. Forekomsten ved henholdsvis hospitalet og Frederik VII s Ø er signifikant forskellige (Figur 4.14; Appendiks 12B). Den relative ciprofloxacinresistens hos bakterier fra ulkes mavesække og tarme er meget lav. Resistensen forekommer størst ved lossepladsen, efterfulgt af hospitalet. Ciprofloxacinresistensen er mindre ved Frederik VII s Ø og badevigen, mens der slet ikke forekommer resistens for Ciprofloxacin ved GEUS s lade i ulkes mavetarmbakterier (Figur 4.15). 1 2 Figur 4.13 Benzylpenicillinresistente bakterier i ulkes mavesække og tarme som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Figur 4.14 Amoxicillinresistente bakterier i ulkes mavesække og tarme som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Tallene 1-2 refererer til signifikant forskellige grupper. Figur 4.15 Ciprofloxacinresistente bakterier i ulkes mavesække og tarme som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. For bakterier i sediment forekommer den største benzylpenicillinresistens ved badevigen, efterfulgt af Frederik VII s Ø. Der forekommer næsten ingen resistens ved hospitalet og GEUS lade (Figur 4.16). Figur 4.16 Benzylpenicillinresistente bakterier i sediment som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 108 timer. Der er ingen data fra lossepladsen. Figur 4.17 Amoxicillinresistente bakterier i sediment som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 108 timer. Der er ingen data fra lossepladsen. Figur 4.18 Ciprofloxacinresistente bakterier i sediment som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 108 timer. Der er ingen data fra lossepladsen. 19

Amoxicillinresistensen hos sedimentbakterier forekommer generelt lav, med de største forekomster ved GEUS lade og hospitalet, efterfulgt af badevigen. Der forekommer næsten ingen resistens ved Frederik VII s Ø (Figur 4.17). Der forekommer ingen ciprofloxacinresistens hos sedimentbakterier på nogle af lokaliteterne, med undtagelse af Frederik VII s Ø, hvor der ses en meget lille forekomst af resistens (Figur 4.18). Der er ingen signifikant forskellige grupper for hverken benzylpenicillinresistente, amoxicillinresistente eller ciprofloxacinresistente sedimentbakterier (Appendiks 12C). Data fra Frederik VII s Ø er beregnet ud fra resistens efter 96 og 120 timer (Appendiks 6E). 4.6.2 Fordeling af antibiotikaresistente bakterier på prøvetyper Der er mest antibiotikaresistens for mavetarmbakterier i fisk sammenlignet med bakterier fra muslinger og sediment ved hospitalet og lossepladsen (Figur 4.19 (a-b)). Ved hospitalet er der næsten ingen resistens for hverken Benzylpenicillin eller Amoxicillin for sedimentbakterier (Figur 4.19 (a)). Forekomsten af amoxicillinresistens fra fisk er signifikant forskellig fra resistensen i muslinger og sediment (Appendiks 13). Ved GEUS lade og badevigen forekommer størst resistens for både Benzylpenicillin og Amoxicillin for bakterier fra muslingers hepatopancreas. Benzylpenicillinresistensen er omtrent den samme for muslinger og fisk ved begge lokaliteter (Figur 4.19 (c-d)). Der forekommer næsten ingen resistens i sedimentbakterier for hverken Benzylpenicillin eller Amoxicillin ved GEUS lade (Figur 4.19 (c)). Ved badevigen er der ligeledes næsten ingen resistens for Amoxicillin i sedimentbakterier. Amoxicillinresistensen i sedimentbakterier er signifikant forskellig fra resistensen i muslingers hepatopancreas (Figur 4.19 (d)). Ved Frederik VII s Ø forekommer den største benzylpenicillinresistens hos sedimentbakterier. Samtidig forekommer ingen amoxicillinresistente bakterier i sedimentet. Der forekommer næsten ingen resistens for Benzylpenicillin og Amoxicillin hos bakterier fra ulke og blåmuslinger (Figur 4.19 (e)). a b c 1 2 1 d 1 2 e Figur 4.19 (a-e) Antibiotikaresistente bakterier som % af kontrolprøver for Benzylpenicillin (blå) og Amoxicillin (grøn) med 95 % konfidensinterval. Bogstaverne M, F og S refererer til henholdsvis musling, fisk og sediment. Data for fisk og muslinger er for 48 timer. Data for sediment er for 108 timer. Tallene 1-2 refererer til signifikant forskellige grupper. (a) Hospital, (b) Losseplads, (c) GEUS lade, (d) Badevig, (e) Frederik VII s Ø. Der er ingen sedimentdata fra lossepladsen. 20

4.7 Pilotstudie af Roxithromycinresistens Der er mest roxithromycinresistens ved Frederik VII s Ø for både blåmuslinger og sediment. Her forekommer samtidig de største 95 % konfidensintervaller (Figur 4.20, Figur 4.22). For bakterier i blåmuslinger skyldes det store konfidensinterval, at der ikke forekommer resistens i tredje replikat. Usikkerheden skyldes for sedimentbakterier, at resistensen i replikat 3 er flere størrelsesordener lavere end replikat 1 og 2. I bakterier fra blåmuslingers hepatopancreas er resistensen nogenlunde konstant ved de øvrige lokaliteter (Figur 4.20). Der forekommer mindst roxithromycinresistens ved hospitalet for sedimentbakterier, efterfulgt af badevigen og GEUS lade (Figur 4.22). To af de tre subreplikater i replikat 3 ved lossepladsen er estimeret til 1.300 CFU 10 7 / g prøve, da det ikke var muligt at tælle bakteriekolonierne (Appendiks 6B). For ulkes mavetarmbakterier er roxithromycinresistensen størst ved lossepladsen, efterfulgt af hospitalet. Resistensen er faldende fra lossepladsen mod Frederik VII s Ø, hvor der næsten ikke forekommer resistens (Figur 4.21). Figur 4.20 Roxithromycinresistente bakterier i blåmuslingers hepatopancreas som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 48 timer. Figur 4.21 Roxithromycinresistente bakterier i ulkes mavesække og tarme som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. For lossepladsen er data for 24 timer, resterende data er for 48 timer. Figur 4.22 Roxithromycinresistente bakterier i sediment som procent af kontrolprøver, fordelt på lokaliteter med 95 % konfidensinterval. Data er for 108 timer. Der er ingen data fra lossepladsen. 21