GAPDH PCR modul Manual

GAPDH PCR modul Manual Katalog nr. 166-5010EDU explorer.bio-rad.com Kopiering kun tilladt til undervisningsbrug Bemærk: Kittet indeholder temperaturfølsomme dele. Åbn derfor straks kassen og læg de pågældende dele til opbevaring ved den anbefalede temperatur. Oversat og bearbejdet af Birgit Sandermann Justesen Nærum Gymnasium, februar 2009 1/12

Indledning PCR er i dag en meget benyttet teknologi i forskning, i retsgenetiske analyser og i laboratorier. Blandt de mange anvendelsesmuligheder af PCR er også muligheden for at bruge PCR til at klone gener også i tilfælde, hvor man ikke kender genomet. Ved at designe primerne ud fra kendte beslægtede organismers DNA er det muligt at få amplificeret de gener, man ønsker. Metoden, der kaldes nested DNA, er en totrinsproces. I den første PCR-runde amplificeres de gener, der har sekvenser, der ligner det gen, der skal undersøges. I den anden runde PCR amplificeres mere specifikt de gener, der har interesse efter første runde. Overblik Teori: DNA, DNAreplikation, PCR, primerdesign, de generede primere, nedsted PCR For-forsøg: ekstration af genomdna fra forskelligt plantemateriale (Nukleinsyreekstraktion) Del 1: Klargøre til første PCR, PCR, elektroforese og analyse af resultaterne Del 2: Behandling af DNA med exonuclease, klargøre til PCR, PCR, elektroforese og analyse af resultaterne Afslutning: Opsamling og endelig tolkning af resultaterne Elevforudsætninger Kittet kræver et større overblik og er derfor designet til elever, der har enten molekylær biologi eller bioteknologi på A-niveau. Det forudsættes, at eleverne allerede har kendskab til og prøvet PCR-teknikken. Tjekliste I kittet Mængde Initial GAPDH PCR-primer 50µL 1 Nested GAPDHPCR-primers 50µL 1 PCR master mix 1,2mL 3 Plasmid control DNA 1 ml 1 Control Arabidopsis genomdna 1 Exonuclease I, 50µL 1 Molekylær vægt-lineal 1 Sterilt vand 2,5mL 1 PCR-rør 0,2mL 150 Adaptorer til PCR-rør 1,5ml 150 Farvede mikrocentrifugerør 120 Skumholdere til mikrocentrifugerørene 12 Nødvendigt udstyr Mikropipette 2-20µL 1 pr. gruppe Mikropipette 20-200µL 1 pr. gruppe Pipettespidser med aerosolbarriere til ovennævnte pipetter PCR-maskine Elektroforeseudstyr Udstyr det er rart at have Nyt ekstraheret plante DNA (fra kittet Nukleinsyreekstraktion ) 2/12

Ultracentrifuge Vortexer Enten ethidium-agarose elektroforeseudstyr eller fast-blast-agarose elektroforeseudstyr Teori xxx Lærerens forberedelse Teoretiske noter I dette forsøg skal eleverne lave to runder med PCR. For at amplificere en del af GAPC-genet fra genom DNA. Genom-DNA kan skaffes på 3 måder 1) GenomDNA udvundet ved ekstraktion af plantemateriale eller2) fra et forskningslaboratorium eller 3) ved at bruge det i kittet medfølgende Arabidopsis genom DNA. I den første PCR benyttes degenererede primere for at amplificere en større del af DNA stykkerne. I modsætning til normale primere, der er syntetiserede med en nucleotid på hver position har degenererede primere en eller flere positioner, hvor der er syntetiseret forskellige nukleotider. Start (initial) primeren ser sådan ud: GABTATGTTGTTGARTCTTCWGG Degenereringen ses i position 3, 15 og 21 Position IUB kode Baser 3 B G/T/C 15 R(purin) G/A 21 W(Weak) A/T Den reverse primer er dannet på samme måde. I anden PCR-runde i nested PCR benyttes mere specifikke primere til at amplificere et specifikt GAPCgen fra genom-poolen. Disse primere er ikke degenererede, men findes inde i sekvensen fra de første primere. Se fx: Initial primer Nested primer GABTATGTTGTTGARTCTTCWGG CTACTGGTGTCTTCACTGACAA Primerne binder ikke lige godt til alle plantearter, hvorfor der vil være forskellig PCR-effektivitet hos de forskellige arter. Det kan sagtens ske, at eleverne allerede efter første PCR-runde får fragmenter, der er gode nok til at klone. Det vil sige at der er nok DNA (der kan ses bånd på en gel), kvaliteten er god nok (der er et eller flere bånd) og fragmenterne har den forventede størrelse. Men for at være på den sikre side anbefales det på det kraftigste, at man gennemfører begge PCR-runder. Det kan dog stadig ske, at nogle elever selv efter to PCR-runder ikke har fået nok DNA. Hvis eleverne benytter det DNA, de selv har ekstraheret fra plantemateriale anbefales det, at de som kontrol benytter de Arabidopsis genom-dna, der følger med kittet. Derudover følger der med kittet plasmid DNA, der koder for target(mål)delen af GAPDHgenet fra Arabidopsis og hvis dette benyttes som skabelon i begge PCRrunder er man sikker på, at PCR en virker. Ved at lave disse forskellige kontrolforanstaltninger lærer eleverne noget om kontrollers betydning, men samtidig 3/12

kan kontrolreaktionen fungere som en slags klonbar PCRprodukt, hvis deres egne prøver ikke virker. Endelig anbefales det at man også arbejder med en negativ kontrol. Lærerens forberedelse 1. Fortynd 5x genom Arabidopsis DNA (25ng/µL) med sterilt vand til 5ng/µL. Det gøres ved at tage 20 µl DNA og blande med 80µL vand. Blandes godt. Hver gruppe har brug for 6µL. 2. Læreren kan evt. blande mastermixen med primere. Elevvejledningen lægger dog op til, at eleverne ud fra beregninger af molaritet selv blander deres mastermix med primere. Tidligst 30 minutter før forsøget blandes mastermixen. Hver gruppe skal bruge 120µL 2x mastermix med primere til 5 PCR reaktioner. Tilsæt 30µL specifikke primere (blå i første runde, gul nested primere i anden runde) til 1500µL BioRad2x mastermix bland godt 3. Før anden PCR-runde placeres exonuclease I på is 4. Fremstil 500bp molekylær vægtlinealen: Tilsæt 100µL 5x orange G Loading Dye til den medfølgende 500bp molekyl-vægt-lineal 5. Læreren eller elever gør klar til at lave elektroforese. Der støbes 1% agarosegel i TAE-buffer. Hver gruppe har brug for to geler. 6. Programmer PCR-maskinen Første PCR-runde initial GAPDHPCR: Start denaturering 95 o C i 5 minutter Derefter 40 cykler: Denaturering 95 o C i 1 minut Annealing 52 o C i 1 minut Extension 72 o C i 2 minutter Afslutnings extension 72 o C i 6 minutter Slut 15 o C uendeligt Anden PCRrunde nested GAPDHPCR: Start denaturering 95 o C i 5 minutter Derefter 40 cykler: Denaturering 95 o C i 1 minut Annealing 46 o C i 1 minut Extension 72 o C i 2 minutter Afslutnings extension 72 o C i 6 minutter Slut 15 o C uendeligt 4/12

Elevvejledning Det gen, der skal analyseres skal studeres i dette forsøg koder for GAPDH dvs. glycerolaldehydfosfatdehydrogenase, - et af glykolysens enzymer. GAPDH er et meget vigtigt enzym i glykolysen (Læs selv om glykolysen i din biokemibog) og det udtrykkes konstant og samtidig er det livsvigtigt for cellens overlevelse. Eftersom der er rigeligt med GAPDH i cellerne og det er muligt at oprense enzymet ved man også meget om enzymet proteinstruktur og dets funktion. GAPDH består af 4 underenheder der holdes sammen af ikke-kovalente bindindinger. I nogle tilfælde er alle fire underenheder ens, i andre tilfælde er der små forskelle. Hver underenhed har et aktivt område, hvor der kan bindes en NAD + co-faktor. Selvom der er GAPDH i alle organismer er det ikke ensbetydende med, at organismernes genetiske kode for GAPDH er ens, idet mængde og størrelsen af fx introns kan variere. I første PCR runde bruges der en primer, der stammer fra nærtbeslægtede organismer, som Arabidopsis (også en plante) og denne primer vil nok virke, men ikke optimalt. Men der amplificeres dog en del Dna og i anden PCRrunde kan man være mere specifik med hensyn til at fange det DNA, der koder for GAPDH. Materialer pr. gruppe: BioRad 2x master-mix 120 µl Blå initial primer 4 µl gdna fra planter (tidligere forsøg) 2 1x Arabidopsis gdna (fortyndet til 5ng/µL) 6 µl Kontrol pgap plasmid DNA 6 µl 2-20 µl mikropipette spidser til mikropipetten PCR-rør 5 PCR-adaptorer 5 Mikrocentrifugerør 1 Holder til rørene Tusch isbad Første PCR-runde (Initial PCR) Bemærkning: Såfremt læreren fremstiller mastermixen springes punkt 3 over. 1. Gruppen starter med planlægningen af første PCR-runde. I startrunden skal der laves PCR på Arabidopsis gdna (gdna=genomdna), på pgap plasmid DNA (positiv kontrol), på mindst én plantes gdna samt på en negativ kontrol, som består af sterilt vand i stedet for DNA. Tegn en tabel så I har styr på, hvad der står på de pågældende rør, hvilken skabelon, der er benyttet og hvilke primere, der har været brugt. Mærke på PCR-røret Skabelon Primere 5/12

2. Tidligst 30 minutter før PCR-reaktionen skal starte, fremstiller I jeres mastermix. Mastermix er er en blanding bestående af alle de reagenser, der er nødvendige for PCR nemlig Taq polymerase, dntp, buffer og salt. Mastermixen er dog først klar til brug, når der også er tilsat primere. I kittet er der en 2x mastermix (klar væske). Denne vil, når den blandes i PCRrørene med en tilsvarende mængde DNA-skabelon (jeres prøver, der skal køres PCR på) opnå den rette koncentration; 1x. Vi skal nu beregne, hvor meget mastermix, der skal bruges: Hver PCR-prøve kræver 40µL. Dvs. hver prøve skal bruge 20µL 2xMMIP (dvs 2x mastermix initial primere) plus 20µL DNA-skabelon. Hvis I således regner med at køre 5 prøver skal I i alt bruge 5 x 20µL 2xMMIP. Dertil skal I nu beregne, hvor megen initial-primer, der skal tilsættes: Primeren leveres i en koncentration på 100µM og den er blå. Til selve PCR en kræves kun en koncentration på 2µM. Beregn nu hvor meget initial-primer, der skal tilsættes 2xMMIP: Formel: M 1 x V 1 /M 2 =V 2 Vi har altså: Mængde initial-primer i µl= (koncentration af primer i µm)x(volumen af 2xMMIP i µl) (given primer-koncentration i µm) Tidligst 30 minutter før starten på PCR tilsætter I den beregnede mængde initial-primer til den afmålte mængde 2xMMIP (mastermix) i et skruelågsmikrocentrifugerør. Bland grundigt ved at knipse på røret eller brug en vortexer. Den færdige blanding er blå Stil det på is! Note: Initial-primerne sætter sig fast udenfor selve target-området. (Se mere i jeres teoribøger om dette) 3. Mærk 5 PCR-rør med jeres initialer og følgende numre: 1 Negativ kontrol (sterilt vand) 2 Arabidopsis gdna 3 Positiv kontrol pgap plasmid 4 Plante 1 gdna 5 Plante 2 gdna 4. Stil rørene i en PCR-adaptor, luk hvert rør og stil PCR-adaptorerne med PCR-rørene på is. 6/12

5. Tag den færdigblandede blå mastermix og knips på røret og giv det evt. en kort centrifugering for at få indholdet ned i bunden 6. Tilsæt 20µL færdigblandet blå mastermix til hvert af de 5 mærkede rør Blå mastermix 7. Skift pipettespids og tilsæt 15µL sterilt vand til hvert rør sterilt vand 8. Tilsæt 5µL negativ kontrol til det første rør. Sug forsigtigt op og ned med pipetten for at blande godt. Skift spids og tilsæt 5µL Arabidopsis gdna til rør nr. 2 bland Skift spids og tilsæt 5µL positiv kontrol til rør 3 bland Skift spids og tilsæt 5µL plante 1 gdna til rør 4 - bland Skift spids og tilsæt 5µL plante 2 gdna til rør 5 bland DNA-prøver 9. Når alle grupper er klar stilles rørene i PCR-maskinen 10. Start PCRreaktionen: Første PCR-runde initial GAPDHPCR: Start denaturering 95 o C i 5 minutter Derefter 40 cykler: Denaturering 95 o C i 1 minut Annealing 52 o C i 1 minut Ekstension 72 o C i 2 minutter Afslutnings-ekstension 72 o C i 6 minutter Slut 15 o C uendeligt 7/12

Hvis der er overskydende gdna stilles det straks i fryseren 11. Gør klar til elektroforese. Støb en 1% agarosegel i TAE-buffer 12. Tag prøverne ud af PCR-maskinen 13. Mærk 5 mikrocentrifugerør som før og tilsæt 5µL 5x Orange Loading Dye til hvert rør. 14. Afpipetter 20µL fra hvert af de respektive rør til de nye rør. Sug op og ned med pipetten for at blande. Vigtigt! De resterende 20µL i PCR-rørene skal bruges til anden PCR-runde! 15. Sæt 10µL 500bp molekyl-vægt-lineal i første brønd og derefter 20µL af hver prøve i de næste brønde. Noter rækkefølgen. Kør elektroforesen Bemærk: Båndene i molekyl-vægt-linealen er: 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 og 5000bp 16. Studer resultatet og noter det. Bemærk: pgap-plasmidkontrollen skulle gerne vise et bånd ved ca 1kb. For plante gdna er det relativt normalt, at der ses flere bånd eller modsat kun yderst svage bånd. Der kan dog sagtens stadig være gode muligheder for amplificering i anden PCR-runde. 17. Den del af prøverne, der skal arbejdes videre med, stilles i køleskabet! 8/12

Anden PCR-runde (Nested PCR) 1. I skal nu planlægge jeres nested-pcr eksperiment. Der vil blive udført nested- PCR på de prøver, der indeholdt gdna (gdna=genomdna). Derudover laves der såvel en positiv kontrol som en negativ kontrol. Som i første del laver I en oversigtstabel over indholdet i de forskellige rør: Mærke på PCRrøret skabelon Fortyndingsfaktor Primere 2. Tidligst 30 minutter før PCR-reaktionen skal starte, fremstiller I jeres mastermix. Mastermix er er en blanding bestående af alle de reagenser, der er nødvendige for PCR nemlig Taq polymerase, dntp, buffer og salt. Mastermixen er dog først klar til brug, når der også er tilsat primere. I kittet er der en 2x mastermix (klar væske). Denne vil, når den blandes i PCRrørene med en tilsvarende mængde DNA-skabelon (jeres prøver, der skal køres PCR på) opnå den rette koncentration; 1x. Vi skal nu beregne, hvor meget mastermix, der skal bruges: Hver PCR-prøve kræver 40µL. Dvs. hver prøve skal bruge 20µL 2xMMNP (dvs 2x mastermix nested primere) plus 20µL DNA-skabelon. Hvis I således regner med at køre 5 prøver skal I i alt bruge 5 x 20µL 2xMMNP. Dertil skal I nu beregne, hvor megen nested-primer, der skal tilsættes: Primeren leveres i en koncentration på 25µM og den er gul. Til selve PCR en kræves kun en koncentration på 0,5µM. Beregn nu hvor meget nested-primer, der skal tilsættes 2xMMNP: Formel: M 1 x V 1 /M 2 =V 2 Vi har altså: Mængde nested-primer i µl= (koncentration af primer i µm)x(volumen af 2xMMNP i µl) (given primer-koncentration i µm) Tidligst 30 minutter før starten på PCR tilsætter I den beregnede mængde gul nested-primer til den afmålte mængde 2xMMNP (mastermix) i et skruelågsmikrocentrifugerør. Bland grundigt ved at knipse på røret eller brug en vortexer. Den færdige blanding er gul Stil det på is! Note: nested-primerne arbejder på selve target-området. (Se mere i jeres teoribøger om dette) 9/12

3. Først skal ikke-inkorporerede primere fra første runde fjernes ved hjælp af exonuclease I. Brug en ny pipettespids hver gang når I pipetterer 1µL exonuclease I til hvert Første-runde-PCR-rør, der indeholder gdna (dvs. rør 2, 4 og 5). Bland godt. 4. Inkuber i 15 minutter ved 37 o C 5. Inaktiver enzymet ved derefter at inkubere i 15 minutter ved 80 o C. Hvorfor er det nødvendigt at inaktivere exonucleasen? 6. Mærk et mikrocentrifugerør til hvert af de exonuclasebehandlede første-runde-pcr-rør. exo Arabidopsis gdna exo plante 1 gdna exo plante 2 gdna 37 o C vandbad 80 o C vandbad 7. PCR en fra første runde skal nu fortyndes. Tilsæt 98µL sterilt vand til hvert af mikrocentrifugerørene sterilt vand 8. Skift pipettespids og tilsæt 2µL af de respektive exonucleasebehandlede PCR-prøver til de tilsvarende mærkede mikrocentrifugerør. Luk låget exonucleasebehandlede PCR-prøver 10/12

9. Knips på røret eller brug en vortexer. Centrifuger efterfølgende kort for at få alt ned i bunden af røret. 10. Mærk 5 nye PCR-rør ift. jeres skema og stil disse i PCR-adaptorer og derefter på is. IS x 5 11. Tilsæt 20µL gul MMNP til hvert PCR-rør 12. Idet I følger jeres skema, tilsætter I 20µL skabelon til hvert af de respektive prøver (fortyndet første-runde-pcr, Arabidopsis gdna, pgapplasmid DNA og sterilt vand) til de tilsvarende PCR-rør gul MMNP 13. Stil PCR-rørene i PCR-maskinen. Kør programmet Anden PCRrunde nested GAPDHPCR: Start denaturering 95 o C i 5 minutter Derefter 40 cykler: Denaturering 95 o C i 1 minut Annealing 46 o C i 1 minut Ekstension 72 o C i 2 minutter Afslutnings ekstension 72 o C i 6 minutter Slut 15 o C uendeligt 14. Tag prøverne ud af termalcykleren/pcr-maskinen prøver 15. Tilsæt 5µL 5x loading dye til 5 nye PCR-rør og afpipetter 20µL fra hvert af de respektive rør til de nye rør. Sug op og ned med pipetten for at blande. Vigtigt! De resterende 20µL i PCR-rørene skal bruges til ligering og transformation og fryses derfor. 11/12

16. Sæt 10µL 500bp molekyl-vægt-lineal i første brønd og derefter 20µL af hver prøve i de næste brønde. Noter rækkefølgen. Kør elektroforesen. Bemærk: Båndene i molekyl-vægt-linealen er: 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 og 5000bp 17. Tolk resultatet. De fragmenter af GAPC der er blevet amplificeret varierer i størrelse fra art til art. Den forventede størrelse er 0,5-2,5 kb. Der ses af og til dubletter dvs to DNA fragmenter på samme størrelse hos nogle plantearter. Dette skyldes sandsynligvis, at to homologe GAPC-gener er blevet amplificeret. 12/12