Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits CE revision 5, Januar 2014

Transkript

1 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 1 af Anvendelse Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits CE revision 5, Januar 2014 Biofortuna HLA SSPGo Kits er kvalitative DNA-baserede reagenssæt til påvisning af enten HLA-alleler i lavopløsningssæt eller gruppespecifikke amplifikationer af alleler i 'mellem-/middelopløsningssæt'. Den normale definition af middelopløsning er tilfælde, hvor hovedparten af resultaterne er klart defineret på tocifferniveau; f.eks. DQB1*02, DQB1*05 etc. Højopløsning defineres normalt som tilfælde, hvor hovedparten af allelerne findes på fircifferniveauet f.eks. DQB1*02:01, DQB1*05:01 etc. Dette er et in vitro-diagnostisk produkt, der kun er beregnet til anvendelse af kvalificeret personale. 2. Introduktion HLA-molekyler spiller en vigtig rolle i immunitet og genkendelse af hhv. selv og ikke-selv, og derfor er HLAgenotypebestemmelse og HLA-matchning obligatorisk inden de fleste former for transplantation. Eftersom HLAantigener begrænser specificiteten af T-cellemedieret immunrespons, er HLA-genotypebestemmelse et nyttigt værktøj til diagnosticering af immunsygdomme eller immunrespons på patogener, vaccinationer eller medicinsk behandling. HLA-genotypebestemmelse kan også anvendes til understøttelse af sygdomsdiagnose, hvis visse HLAalleler har vist sig at være signifikant associeret med sygdomstilstande. De fleste HLA-gener er yderst polymorfiske, og DNA-genotypebestemmelse er normalt nødvendig for nøjagtig påvisning af HLA-antigener. PCR-genotypebestemmelse med SSP (Sequence-Specific Primers) 1 er en hurtig metode til HLA-genotypebestemmelse og er især egnet i situationer, hvor der er behov for middelopløsning. Biofortuna SSPsættene har alle fuldstændige tørrede reaktioner, herunder polymerase, så det eneste, brugeren skal gøre inden PCR, er at tilsætte DNA. Vi forsøger altid at holde sættene opdateret med de nyeste IMGT HLA-justeringer. Reagenssætopdateringer er tilgængelige på 3. Testbeskrivelse PCR SSP er baseret på princippet om, at det kun er primere, som har fuldstændig matchede 3 -terminaler til en målsekvens, der amplificeres. Forkert matchede primere giver ikke positive amplifikationsprodukter. 2 Et internt kontrolprimerpar, der amplificerer en bevaret region på et husholdningsgen, findes i alle PCR-reaktionsblandinger; det interne kontrolprimerpar er en indikator af PCR-reaktionens integritet. SSP-genotypebestemmelse anvender normalt flere reaktioner, som, når de analyseres sammen, indikerer genotypen. Visualisering af det amplificerede produkt kan opnås ved brug af agarosegelelektroforesesystemer, der separerer DNA-fragmenterne efter størrelse.

2 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 2 af Indhold i sættet Polypropylen-PCR-plader eller -strips, som består af mellem 8 og 96 PCR-brønde (afhængig af sættet). Hver brønd indeholder prædispenserede frysetørrede primere, polymerase, dntp er* og buffer. Hver plade eller strip leveres forseglet med et forseglingsark eller en forseglingshætte og er pakket enkeltvist i en foliepakke, der indeholder en pose med tørremiddel. PCR-forseglingsark eller hætter. 1 brugsvejledning. Analysecertifikat. Fortolkningstabeller og sikkerhedsdatablad kan hentes fra Biofortunas websted Kontakt den lokale distributør, hvis det ikke er muligt at hente ovenstående fra webstedet. *CleanAmp -dntp er er givet i licens af Trilink Biotechnologies Inc til brug i Biofortuna SSPGo-produkter. 5. Nødvendige reagenser og nødvendigt udstyr Egnede kalibrerede pipettorer og sterile pipettespidser, f.eks. P10-pipettor med 10-µl-filterspidser. DNA-isolationssæt/-udstyr. UV-spektrofotometer. Polypropylenrør. Sterilt vand af molekylær renhed. Der skal benyttes en termocykler med de følgende specifikationer: Termocykler med 96 brønde og opvarmet låg med en temperatur på 104 C til oliefri drift. Temperaturstigning på 1,0 C i sekundet. Temperaturområde på 4,0 C til 99,9 C. Temperaturnøjagtighed på ±0,25 C i området 35 C til 99,9 C. Temperaturkalibrering, som kan henføres til en referencestandard. Programmer termocykleren ved at anvende PCR-cyklusparametrene i afsnit 8 herunder. Bemærk: se brugermanualen fra fabrikanten for specifikke oplysninger om termocykleren. Termocyklere skal kalibreres i henhold til ASHIs (American Society of Histocompatibility and Immunogenetics) eller EFIs (European Federation of Immunogenetics) retningslinjer for akkreditering. Gelelektroforesereagenser (agarose, 0,5x TBE, 1000bp DNA -molekylærvægtsmarkør, 10 mg/ml ethidiumbromid). Gelelektroforeseudstyr (geltanke, strømforsyning, geldokumentationssystem med UV-transilluminator). Software til at hjælpe i den manuelle analyse af SSPGo kit testresultater og Arkiveringsmæssig data kan downloades fra Biofortuna hjemmeside Bemærk: Ændringer af de anførte forhold såsom termocyklerens temperaturstigningshastighed kan påvirke fortolkningen af testresultaterne. 6. Sikkerhed og advarsler Til in vitro-diagnostisk brug. Test må kun udføres af kvalificeret personale. Alle typebestemmelsesresultater skal verificeres af kvalificeret personale og skal bekræftes med en anden typebestemmelsesmetode, hvis de skal danne grundlag for en klinisk beslutning. Alle reagenser skal håndteres i henhold til god laboratorieskik. Præ- og post-pcr-områder skal holdes adskilt. Overfør ikke nogen form for post-pcr-materialer til præ-pcrområdet.

3 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 3 af 11 Advarsel om biologisk risiko: Alle blodprodukter skal behandles som potentielt smittefarlige. Advarsel om biologisk risiko: Ethidiumbromid er et potentielt karcinogen. Anvend altid handsker, kittel og beskyttelsesbriller ved brug af ethidiumbromid. Advarsel om biologisk risiko: Vær forsigtig ved brug af UV-kilder. Anvend altid handsker, kittel og beskyttelsesbriller. Se aldrig direkte ind i UV-lyskilden. Sikkerhedsdatablade findes på 7. Opbevaring og holdbarhed Biofortuna SSPGo-sættene skal opbevares ved 2-28 C. Når PCR-beholderne fjernes fra foliepakken, skal reagenserne rehydreres med DNA inden for 3 timer. Se pakken for oplysninger om udløbsdato. Anvend ikke produkterne efter den påtrykte dato. Anvend ikke sættene, hvis foliepakken er beskadiget, eller hvis der ikke er en pose med tørremiddel. Sørg for, at PCR-beholderen forsegles tæt efter tilsætning af DNA. Til dette må kun de medfølgende forseglingsark eller -hætter benyttes,, eftersom der ellers kan opstå fordampning under PCR-amplifikation. Vær særlig opmærksom på kanter og hjørner. Bemærkning (1): Ved behov kan de ikke-hydrerede PCR-plader og -strips, der er taget ud af pakken, opbevares ved en temperatur på op til 21 o C og en fugtighed på ikke over 60 % i op til 3 timer før tilsætning af DNA. Bemærkning (2): Når PCR-plader og -strips fra nyåbnede pakker er hydreret med DNA, kan de opbevares i op til 24 timer ved 2-8 C før PCR-trinnet, såfremt brøndene er godt forseglet, så der ikke opstår fordampning. 8. Brugsvejledning Krav til DNA-prøver Hver reaktion i testen er optimeret til at anvende mellem 50 og 100 ng DNA, men det er af afgørende betydning, at hver reaktion rehydreres med nøjagtig 10 µl væske. Derfor kan testen kun udføres med 10 µl DNA ved 5-10 ng/µl. Fortynd DNA et til den påkrævede koncentration, kun i sterilt vand af molekylær renhed. Forsigtig: Sørg for, at den endelige DNA-prøve ikke indeholder mere end 2,5 mm Tris/0,25 mm EDTA. Brug kun DNA, der er udtaget fra prøver indsamlet med citrat eller EDTA. Eftersom heparin kan hæmme PCR, anbefales det, at DNA ikke udtages fra hepariniserede blodprøver. Det er påvist, at hæmoglobin påvirker SSPGo HLA kits, når det forefindes i DNA-prøver i større mængder end 1 mg/dl. DNA kan udtages ved hjælp af alle de traditionelle udtagningsmetoder. Sørg for, at DNA-prøvens OD 260/280 ligger mellem 1,66 og 1,94, målt ved hjælp af UV-spektrofotometri. Præ-PCR-vejledning i. Tag en SSPGo-plade eller -strip ud af en forseglet pakke. ii. Notér analysens produktlotnummer. iii. Sørg for, at alle de frysetørrede pellets (PCR -reagenser) er på bunden af plade-/rørbrøndene, før forseglingen eller hætten fjernes. Hvis det ikke er tilfældet, skal der bankes let for at få pellets til bunden af røret. Bemærk, at den første reaktion for hvert testlocus altid er blegt lyserød i forhold til resten af sættet. (Rød, når det er hydreret).visse PCR-plader indeholder en lilla NTC-integralreaktion (uden skabelonkontrol) i den sidste brønd på pladen. iv. Anvend sterilt udstyr til at afpipettere 10 µl DNA-opløsning i hver reaktion på pladen eller strippen. Se bemærkningen under Krav til DNA-prøver i afsnit 8. Hvis pladen indeholder en lilla NTC-integralreaktion

4 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 4 af 11 (uden skabelonkontrol), skal der afpipetteres 10 µl prøvefortyndingsopløsning (uden DNA) i den. Se BEMÆRKNING OM NTC (NO TEMPLATE CONTROL) i afsnit 8. v. Sørg for, at DNA'et har kontakt med de tørre reagenser i hver reaktion inden termocykling. vi. Forsegl reagenserne med det leverede forseglingsark eller PCR-rørhætterne. Sørg for, at forseglingen er så tæt som mulig for at forhindre fordampning. Vær særlig opmærksom på kanter og hjørner. vii. Anbring bakken eller strippene direkte i termocykleren. Sørg for, at beholderne er sat helt ned i blokken, og at låget er helt komprimeret. I modsat fald kan det forårsage fejl i den enkelte PCR på grund af PCRfordampning og kondens. viii. Kør PCR-programmet (se PCR-parametre). BEMÆRKNING OM RESUSPENSION: Når PCR-brøndene fjernes fra foliepakkerne, skal reagenserne straks rehydreres med DNA. Se Bemærkning (1) og Bemærkning (2) for yderligere oplysninger. BEMÆRKNING OM NTC (NO TEMPLATE CONTROL): Visse reagenssæt indeholder en NTC (No Template Control) som den sidste reaktion på pladen. Denne reaktion indeholder lilla farvestof for at adskille den fra resten af reaktionerne. NTC er beregnet til at påvise PCR-kontaminering eller genomisk DNA-kontaminering, som kan forekomme i det vand, der anvendes til at resuspendere DNA'et. Hvis der er PCR-kontaminering, observeres der amplikon(er) i forskellig størrelse. BEMÆRKNING OM PCR-PLADE/-STRIP-HØJDEPROFIL: Det anbefales, at højdeprofilen på plader og strips er ens, hvis de skal anvendes i samme PCR-maskine. Forskellige højdeprofiler kan forårsage dårlig kontakt med PCR-maskinens opvarmede låg. Dette kan resultere i dårlig eller mislykket PCR-amplifikation. PCR-parametre Følgende PCR-parametre bør anvendes. Sørg for at anvende temperaturstigninger på 1 C i sekundet, og aktivér det opvarmede låg. Se brugermanualen fra fabrikanten af termocykleren for en fuldstændig vejledning. Termocyklere skal kalibreres i henhold til ASHIs (American Society of Histocompatibility and Immunogenetics) eller EFIs (European Federation of Immunogenetics) retningslinjer for akkreditering. Denaturer 94 C 5 minutter Denaturer 96 C 15 sekunder Bind 66 C 50 sekunder 10 cykler Udvid 72 C 30 sekunder Denaturer 96 C 15 sekunder Bind 64 C 50 sekunder 20 cykler Udvid 72 C 30 sekunder HOLD ved 15 C i højst 72 timer, før gelerne køres. Ved behov kan PCR-pladen opbevares ved 2-8 C i op til 24 timer, før gelerne køres. Det skal altid sikres, at pladerne er godt forseglede. Gelelektroforese Disse instruktioner gælder for horisontal agarosegelelektroforese: Forbered en 2%-agarosegel i 0,5x TBE-buffer. Når gelen er afkølet til ca. 60 C, skal der tilsættes ethidiumbromid, så der opnås en endelig koncentration på 0,5 µg/ml. Støb gelen, og isæt mikrotiterformatkamme (f.eks. 12 x 8 brønde med 9 mm afstand). Når gelen er støbt, skal kammene fjernes. Dæk derefter gelen med 0,5x TBE-buffer. Sæt hele PCR-produktet i rækkefølge i 2 % agarosegelen. Notér positionen for hver reaktion. En 1000 bp-stige anbefales som hjælp til bestemmelse af størrelse. Kør gelen i 20 minutter ved 10V/cm. Se brugermanualen fra fabrikanten af elektroforesesystemet for specifikke oplysninger om udstyret. Gelfotoet skal fremstilles med et UV-geldokumentationsystem med UV-transilluminator.

5 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 5 af 11 Bemærk: Utilstrækkelig elektroforese kan medføre, at store amplikoner på over 600bp smelter sammen med kontrolamplikonet. Sørg for, at elektroforesen er tilstrækkelig til at visualisere sådanne amplikoner. For lang elektroforese kan medføre, at små amplikoner tabes til foranliggende brønde på en gel. 9. Fortolkning SSPGo-sæt er designet, så resultaterne kan bestemmes manuelt ved hjælp af de fortolkningstabeller, der findes på Kontakt den lokale distributør, hvis det ikke er muligt få adgang til ovenstående websted. Fortolkningstabellerne kan inkludere bemærkninger vedrørende specifikke lots, der kan være relevante for fortolkningen. Fastgør gelfotoet på den relevante fortolkningsformular ved at matche sæt- og lotnumre. Undersøg gelfotoet. Hver reaktion skal indeholde et positivt kontrolbånd. Se fortolkningstabellerne, eftersom dette kan have forskellig størrelse i de enkelte SSPGo-produkter. Interne kontrolbånd kan virke meget svagere, hvis der er allelspecifikke bånd. Hvis der et allelspecifikt bånd, men ikke et kontrolbånd, skal dette stadig tolkes som et positivt resultat. Ignorer alle bånd under 70bp, eftersom disse er ikke-inkorporerede primere. Tæl de positive reaktioner. Positive reaktioner indikeres af bånd med den forventede størrelse, som det er angivet i fortolkningstabellerne. Vær opmærksom på, at der kan være mere end én produktstørrelse i en given reaktion disse er multiplekse reaktioner, som er angivet i fortolkningstabellerne. Sammenlign de positive reaktioner med fortolkningstabellerne. Et positivt resultat i en reaktion indikerer forekomsten af mindst én af de alleler, der er angivet for det i fortolkningstabellen. Enhver allel kan amplificeres i flere rør hvis allelen er til stede, bør der være en positiv reaktion i alle de relevante reaktioner. Kontrolbånd Allelspecifikt bånd Retning på elektroforese Fig. 1 Eksempler på positive reaktioner, der indikeres ved forekomsten af allelspecifikke bånd og kontrolbånd (reaktion 1-3); negative reaktioner, der indikeres ved forekomsten af kontrolbånd, men ingen allelspecifikke bånd (reaktion 4-7); og en mislykket reaktion, der indikeres ved mangel på bånd (reaktion 8). Sørg for, at reagenssættets lotnummer svarer til lotnummeret i fortolkningstabellen. Software til at hjælpe i den manuelle analyse af SSPGo kit testresultater og Arkiveringsmæssig data kan downloades fra Biofortuna hjemmeside Kvalitetssikring og -kontrol Hver SSPGo-lot kvalitetskontrolleres, inden produktet forlader Biofortuna. Prøver af hver sætlot kontrolleres mod et defineret panel af humane DNA-prøver for at sikre korrekt ydeevne. Hver reaktion valideres mod mindst 47 karakteriserede DNA-cellelinjeprøver. Biofortuna anbefaler, at laboratoriet foretager en intern validering af alle nye typebestemmelsesprodukter inden brug sammen med kliniske prøver. Kun uddannet og kvalificeret personale bør foretage diagnostisk typebestemmelse, og resultaterne bør kontrolleres af et andet uddannet medlem af personalet. 11. Kliniske data Der blev foretaget et studie af udstyr til in vitro-diagnostik på fem testcentre med henblik på at sammenligne resultaterne fra SSPGo HLA Typing Kits med resultaterne fra det prædikative udstyr, ʽOne Lambdaʼ Labtype SSO.

6 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 6 af 11 Locustypebestemmelsen, der blev udført for SSPGo-testen, gav testresultater for HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPB1, DPA1, og HLA-DQA1*05, DQB1*02, DQ8. De kliniske resultater for SSPGo HLA Typing Kits udviste en samlet overensstemmelse på 98,3-100 % med det prædikative udstyr (SSO-metode) med ikke under 95 % konfidens for genotypebestemmelse af klasse I og II HLAalleler, der er testet fra DNA, som er udtaget fra fuldblod med 5-10 ng/μl. Med undtagelse af tre (3) bekræftede uoverensstemmende resultater af genotypebestemmelse, blev der opnået 100 % overensstemmelse for prøver fra 3 lots i hvert testsæt på forskellige kliniske teststeder i USA og Storbritannien. Sted-til-sted-reproducerbarhed for SSPGo HLA Typing kits blev opnået af tre steder ved brug af et repræsentativt panel bestående af 8 SSPGo PCR-reaktioner over for leverede DNA-prøver formuleret med 4 ng/μl og 11 ng/μl, svarende til yderpunkterne for testsættets koncentrationsområde. I alt 958/960 individuelle reaktioner, der var ligeligt fordelt mellem tre eksterne steder, stemte overens med DNA-prøverne, hvilket resulterede i en samlet overensstemmelse på 99,7 % (0,995 LCL). Et enkelt sted/en enkelt operator opnåede lot-til-lot-reproducerbarhed for tre lots i et repræsentativt SSPGo HLA Test kit ved brug af et DNA-koncentrationsområde på 5-10 ng/μl. Lot-til-lot-reproducerbarheden for SSPGo HLA Type-testen var 100 % overensstemmende med det prædikative udstyr med hensyn til 130/130 DNA-prøver, der blev testet på tre (3) lots fra de repræsentative SSPGo HLA Type tests med i alt 390 tests. Der blev opnået overensstemmende SSPGo HLA positiv verificering for klasse I og II alleler i sammenlignende test med LABType SSO-testede kliniske prøver. Interne SSPGo HLA-tests gav resultater, der stemte overens med DNAreferenceprøver, undtagen med hensyn til utilgængelige prøver såsom visse sjældne HLA-DPB1-alleler og sjældne HLA-B-alleler samt allelgrupper såsom B*59:01, B*78 og B*83:01. De følgende sjældne allelgrupper var ikke bekræftet. B*59, B*78, B*83, DPB*21:01, DPB*26:01:02, DPB*27:01, DPB*28:01, DPB*29:01, DPB*31:01, DPB*34:01, DPB*35:01:01, DPB*39:01, DPB*45:1, DPB*46:01, DPB*51:01, DPB*55:01, DPB*59:01, DPB*63:01, DPB*81:01, DPB*85:01 og DPB*105: Referencer 1) Bunce M et al Tissue Antigens Nov;46(5): ) Saiki RK et al. Nature Nov;324(6093):163-6.

7 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 7 af Fejlfindingsguide til SSPGo Problem Mulig årsag Løsning Ingen amplifikation i nogen reaktion Der er anvendt en forkert DNA-koncentration Mål DNA-mængden ved at måle ved OD 280, og sørg for, at der tilsættes i alt ng DNA til en volumen på 10 µl pr. reaktion. Der er en forekomst af PCRhæmmere i DNA-prøven Brug ikke hepariniseret blod.undgå DNA-prøver, der indeholder mere end 1 mg/dl hæmoglobin. Der er en DNA-prøve af dårlig kvalitet Mål DNA-kvaliteten. OD 260/280 -forholdet bør være 1,66-1,94 med UV-spektrofotometri. Sørg for, at DNA'et er helt resuspenderet i opløsningen inden brug. Reagenserne er ikke helt resuspenderet Termocykleren er ikke sat korrekt op Sørg for, at DNA-prøverne fortyndes i vand af molekylær renhed og som ikke indeholder mere end 2,5 mm Tris/0,25 mm EDTA. Sørg for, at pellet er helt rehydreret ved tilsætning af DNA. Sørg for, at der anvendes 10 µl DNA-opløsning pr. reaktion. Sørg for, at PCR-programmet er angivet korrekt i henhold til brugsanvisningen. Sørg for, at termocyklerens opvarmede låg er aktiveret, og lukket tilstrækkeligt. Se brugermanualen til termocykleren for yderligere oplysninger. Elektroforeseproblemer Sørg for, at der er strøm til elektroforesetanken kontrollér strømforsyningen, og rens elektroderne. Kør gelen i 0,5X TBE-buffer. Sørg for, at der anvendes frisk ethidiumbromid med den koncentration på 0,5 µg/ml. Kontrollér, at der er tilstrækkelig UV-illuminering ved gelfotografering. Se brugermanualen fra fabrikanten af geltanken og strømforsyningen for yderligere oplysninger. Pladerne er ikke forseglet korrekt. Utilstrækkeligt forseglede plader kan forårsage fordampning under PCR. Biofortuna leverer anbefalede forseglingsark i sættet. Yderligere forseglingsark kan bestilles hos den lokale distributør.sørg for, at der er tilstrækkelig forsegling over alle brøndene. Vær især opmærksom på brønde tæt på kanterne af PCR-pladen eller -strippen. Tilfældige udfald af Gelfejl Sørg for, at alle brøndene er sat i gelen i korrekt

8 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 8 af 11 Problem Mulig årsag Løsning kontrol- og/eller allelspecifikke amplikoner. rækkefølge, og at den samme mængde PCR-reaktion er tilsat i hver brønd. Kalibrer pipettorerne som beskrevet i fabrikantens brugermanual. Kontrollér, at brøndene er formet korrekt i gelen. Vær forsigtig ved fjernelse af kamme, eftersom der er risiko for at beskadige bunden af brøndene. Sørg for, at aragosen er helt opløst inden støbning af gelen. Sørg for, at gelen ikke kører for langt, eftersom små amplikoner kan falde af enden. Sørg for, at gelen er lang nok til, at båndene kan separeres. Problemer med termocykleren Brug frisk ethidiumbromidopløsning. Fejl, især omkring kanterne på analysen, kan skyldes utilstrækkelig stramning af låget. Dette kan forårsage fordampning og kondens i PCR-reaktionen halvvejs oppe på PCR-brønden og kan føre til PCR-fejl. Sørg for at følge fabrikantens vejledning ved vedligeholdelse og kalibrering af termocykleren. Fordampningsproblemer Sporadiske fejl på grund af DNA-problemer Kontrollér, at PCR-parametrene er korrekte i henhold til instruktionerne. Sørg for, at der er tilstrækkelig forsegling over alle brøndene. Vær især opmærksom på brønde tæt på kanterne af PCR-pladen eller -strippene. Sørg for, at det opvarmede låg er aktiveret, og at der er opnået tilstrækkelig komprimering via låget. Sørg for at anvende Biofortuna-forseglingsark (medfølger). Yderligere forseglingsark kan bestilles hos den lokale distributør. Der er ingen DNA: Sørg for, at der er DNA i alle brønde. Forkert mængde: Sørg for, at der tilsættes 10 µl DNAopløsning til hver reaktion. Der er tilsat for meget DNA: Koncentrationer over 200 ng eller mindre end 20 ng kan forårsage PCR-fejl. Kontaminanter i DNA'et kan forårsage sporadiske eller udbredte fejl ved amplifikation. Udtværet gelfoto DNA Kontrollér DNA-koncentration og -renhed. Hvis der

9 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 9 af 11 Problem Mulig årsag Løsning tilsættes for meget DNA til PCR-reaktionerne, kan det resultere i udtværede gelfotos. Degraderet renhed eller lav grad af renhed kan være årsagen. Anskaf en frisk DNA-prøve. Svag amplifikation DNA-koncentrationsproblem Kontrollér, at DNA-koncentrationen hverken er for høj eller for lav. Gå efter ng DNA pr. reaktion i 10 µl. Problemer med termocykleren Sørg for at følge fabrikantens vejledning ved vedligeholdelse og kalibrering af termocykleren. Gelfejl Kontrollér, at PCR-parametrene er korrekte i henhold til instruktionerne. Sørg for, at den samme mængde reaktion blev tilsat i hver brønd, mellem 5 µl og 10 µl. Ikke-specifik amplifikation Amplifikationsmønsteret kan ikke fortolkes DNA-koncentrationsproblem Reaktionerne er isat i forkert rækkefølge Der blev identificeret en ny allel Forkert fortolkning af et artefakt som et specifikt bånd Reaktionerne er isat i forkert rækkefølge Enkeltstående PCR-fejl Der mangler små amplikoner Kalibrer pipettorerne som beskrevet i fabrikantens brugermanual. Brug frisk ethidiumbromidopløsning. Kontrollér, at DNA-koncentrationen hverken er for høj eller for lav. Gå efter ng DNA pr. reaktion i 10 µl. Kontrollér placeringen af PCR og gelspor. Undgå, at der overføres materiale fra tilstødende brønde ved ikke at overfylde brøndene og ved at sørge for, at gelen har sat sig, inden kammene fjernes. Der kan være tidligere ikke-sekventerede alleler til stede sammen med et nyt amplifikationsmønster. Hvis der anvendes gamle fortolkningsark, skal der hentes en ny justeringsopdatering fra Hvis denne ikke dækker det nye mønster, skal det kontrolleres med et andet Biofortuna-sæt, eller det skal forsøges at identificere sekvensen ved sekvensbaseret typebestemmelse. Kontrollér de specifikke fortolkningstabeller for korrekt båndstørrelse. Kontrollér, om alle specifikke amplifikationer har den korrekte størrelse, eller om et artefakt (carry-over, primer-dimer) er blevet misfortolket som en amplifikation. Kontrollér placeringen af PCR og gelspor. Kontrollér, at alle interne positive kontroller er til stede. Genfortolk uden manglende reaktioner. Hvis der udføres for lang elektroforese, kan små amplikoner falde af enden af gelen, løbe forbi ethidiumbromidfronten eller spredes til den

10 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 10 af 11 Problem Mulig årsag Løsning foranliggende gelbrønd. Anvend elektroforeseforhold, der er passende til laboratoriets gelsystem. Der blev identificeret en ny allel i prøven Der kan fra tid til anden observeres nye alleler, som kan forårsage et amplifikationsmønster, som ikke svarer til eksisterende alleler. Kontakt venligst den lokale distributør for nærmere oplysninger. 14. Revisionshistorik Revision: Fra version 4 til revision 5 Revisionsdato: 21. januar 2014 Afsnit Afsnit 4: Indhold i sættet Afsnit 5: Nødvendige reagenser og nødvendigt udstyr Revisionsbeskrivelse Tilføjelse af pladeforsegling i sættene Opdaterede specifikationer for termocykler med 96 brønde Opbevaringsforhold for sæt opdateret til 2-28 o C Håndtering af ikke-hydrerede PCR-plader og -strips Håndtering af hydrerede PCR-plader og -strips Afsnit 8: Brugsvejledning Fortynding af DNA i sterilt vand af molekylær renhed Tilføjelse vedrørende stoffer, der kan påvirke sættet, og opdatering af retningslinjer vedrørende DNA's renhed Opdateret OD 260/280 -måling Tilføjelse vedrørende position af frysetørret pellet, før prøve tilsættes Tilføjelse vedrørende udvidede temperaturforhold for produktopbevaring Tilføjelse af bemærkning om varighed af gelelektroforese Afsnit 9: Fortolkning Kommentar vedrørende bemærkninger om specifikke lots Korrekt match af sættets lotnummer med lotnummeret på fortolkningstabellen. Afsnit 11: Kliniske data Afsnit 17: Revisionshistorik Tilføjelse af hele dette afsnit Tilføjelse af hele dette afsnit

11 DOT109v8: Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits. CE Revision 5 Side 11 af Symbolforklaring X Antal test P Repræsentant i EU Se brugsanvisningen i M V H Fabrikationssted In vitro-diagnostik Udløbsdato 2: s 28: Opbevaringstemperatur g Lotnummer Distribueret af Global Trade Item Number 16. Kontaktoplysninger hos fabrikant Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough, CH62 3RJ, UK Tlf.: +44 (0) info@biofortuna.com Web: Oversættelser Francaise: Deutsch: Español: Italiano: České: Danske: Έλληνες: Magyar: Norske: Polska: Português: Россию: Slovenskému: Türk: Svenska: Traductions disponibles Übersetzungen verfügbar Traducciones disponibles Traduzioni disponibili Překlady k dispozici Tilgængelige oversættelser διαθέσιμες μεταφράσεις Fordítások Oversettelser tilgjengelig Dostępne tłumaczenia Traduções disponíveis Переводы доступны Preklady k dispozícii Çeviriler mevcut Översättningar tillgängliga