HOLOTYPE HLA 24/11 CONFIGURATION A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE BRUGSANVISNING VERSION

Transkript

1 HOLOTYPE HLA 24/11 CONFIGURATION A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE BRUGSANVISNING VERSION Til in vitro-diagnostisk brug 0086 Præparerer DNA til sekventeringsanalyse på Illumina MiSeq

2 Indhold OPLYSNINGER OM FREMSTILLER... 7 SYMBOLFORKLARING... 7 INDHOLD AF HOLOTYPE HLA-24/11 CONFIGURATION A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE-KIT... 8 PRIMERÆSKE... 8 ÆSKE MED REAGENSER TIL PRÆPARERING AF BIBLIOTEK BRØNDS ADAPTORPLADE... 9 EXCEL WORKBOOK... 9 SOFTWARE OMIXON HLA TWIN FORSENDELSE OG OPBEVARING ADVARSLER OG FORSIGTIGHEDSREGLER KENDTE BEGRÆNSNINGER VED PRODUKTET SIKKERHEDSOPLYSNINGER YDEEVNEPARAMETRE TEKNISK BISTAND Telefonsupport: UDSTYR, REAGENSER OG FORSYNINGER TEKNISKE OG UDSTYRSMÆSSIGE ANBEFALINGER ANBEFALINGER FOR ASSOCIEREDE REAGENSER MiSeq-reagenskitkapacitet ANBEFALEDE FORSYNINGER JURIDISK MEDDELELSE TILSIGTET BRUG VIGTIG BEMÆRKNING FØR START ANBEFALING FOR ISOLERING AF GENOMISK DNA METODENS PRINCIP OVERSIGT OVER TRIN ORDLISTE/DEFINITIONER TRIN 1 HLA-AMPLIFICERING, PRÆPARERING AF MASTER MIX REAGENSLISTE PROTOKOL Master Mix: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 og DQA Master Mix: HLA-DRB Master Mix: HLA-DQB1 Set TRIN 2 HLA KLASSE I- OG II-AMPLIFICERING REAGENSLISTE PROTOKOL Master Mix tilsat Taq Polymerase: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 og DQA Master Mix tilsat Taq Polymerase: HLA-DQB1 set Klasse I-amplificering (HLA-A, B og C) Side 2 48

3 Klasse II-amplificering (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 og DQB1) Forventede amplikonstørrelser TRIN 3 KVANTITERING OG NORMALISERING AF AMPLIKON (MED PLADEFLUOROMETER) REAGENSLISTE PROTOKOL Amplikon-pooling Oprensning af PCR-produkter med ExoSAP-IT TRIN 4 PRÆPARERING AF BIBLIOTEK REAGENSLISTE PROTOKOL Master Mix til fragmentering Fragmenteringsprogram Master Mix til endereparation Endereparationsprogram Master Mix til ligering Ligeringsprogram Pooling og oprensning af bibliotek TRIN 5 UDVÆLGELSE AF BIBLIOTEKSSTØRRELSE REAGENSLISTE PROTOKOL TRIN 6 KVANTITERING AF BIBLIOTEK MED ET QPCR-INSTRUMENT REAGENSLISTE PROTOKOL qpcr Primer Mix qpcr Master Mix TRIN 7 SEKVENTERING PÅ ILLUMINA MISEQ REAGENSLISTE MiSeq-reagenskitkapacitet PROTOKOL TRIN 8 ANALYSE AF HLA-SEKVENTERINGSDATA AUTOMATISERET PROTOKOL It-opsætning og -konfiguration Protokol for analyse MANUEL SERVERPROTOKOL It-opsætning og -konfiguration Protokol for analyse MANUEL DESKTOPPROTOKOL It-opsætning og -konfiguration Protokol for analyse SUPPLERENDE FIGURER PLADEEKSEMPEL PÅ AMPLIKONPLADE, FORTYNDINGSPLADE, AMPLIKONKVANTITERINGSPLADE (FOR ET INDIVIDUELT LOCUS) OG REAKTIONSPLADE EKSEMPEL PÅ STANDARDKVANTITERINGSPLADE EKSEMPEL PÅ KAPA QPCR-BIBLIOTEKSKVANTITERINGSPLADE TILLÆG 1: PIPPIN PREP Side 3 48

4 PROGRAMMERING AF PIPPIN PREP KØRSEL AF PIPPIN PREP TILLÆG 2: AMPLIKONKVANTITERING MED ET QPCR-INSTRUMENT REAGENSLISTE PROTOKOL TILLÆG 3: BIBLIOTEKSKVANTITERING MED EN INTERKALERENDE DSDNA-FLUORESCENSFARVE REAGENSLISTE PROTOKOL Side 4 48

5 Dokumenthistorik vigtige bemærkninger og opdateringer Version Dato Forfatter Resumé af ændringer Godkendt af Udstedelsesdato V Tünde Vágó Første version Efi Melista Side 5 48

6 Ansvarsfraskrivelse Omixon har bestræbt sig på at sikre, at denne brugsanvisning (IFU) er korrekt. Omixon fraskriver sig ansvar for eventuelle unøjagtigheder eller udeladelser. Oplysningerne i denne brugsanvisning kan ændres uden varsel. Omixon påtager sig intet ansvar for eventuelle unøjagtigheder i denne brugsanvisning. Omixon forbeholder sig ret til til hver en tid uden varsel at foretage forbedringer i denne brugsanvisning og/eller de produkter, som er beskrevet i brugsanvisningen. Hvis du finder oplysninger i denne manual, som er ukorrekte, vildledende eller ufuldstændige, hører vi meget gerne dine forslag og kommentarer. Du bedes sende dem til support@omixon.com. Side 6 48

7 Oplysninger om fremstiller Firmanavn: Omixon Biocomputing Ltd Besøgsadresse: Fehérvári út 50-52/6 By: Budapest Postnummer: H-1117 Land: Ungarn Symbolforklaring LOT-/batchnummer Reference/katalognummer Se brugsanvisningen Indeholder reagens til N test Fremstiller. Datoen i forbindelse med dette symbol refererer til fremstillingsdatoen Anbefalet opbevaringstemperatur Udløbsdato Medicinsk anordning til in vitro-diagnostisk brug Erstatningskomponent Indeholder erstatningskomponent Side 7 48

8 Indhold af Holotype HLA-24/11 Configuration A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE-kit Dette afsnit beskriver indholdet af de forskellige Holotype HLA 24/11-produktkonfigurationer: Produkttype REF-NR. Reak. Holotype HLA 24/11 H62 24 Configuration A1 & CE Holotype HLA 24/11 H64 24 Configuration A2 & CE Holotype HLA 24/11 H66 24 Configuration A3 & CE Holotype HLA 24/11 Configuration A4 & CE H68 24 Bemærk, at primeræsken og æsken med reagenser til præparering af bibliotek er identisk i alle produktkonfigurationer. Komponenten 96-brønds indekseret adaptorplade er forskellig på indekssekvensniveauet i hver konfiguration. Se afsnittet om adaptorpladen med 96 brønde nedenfor for yderligere oplysninger. Primeræske Primeræsken indeholder specifikke brugsklare primeropløsninger til målrettet Long Range PCRamplificering af HLA-generne A, B, C, DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRB1, DRB3, DRB4 og DRB5. Den indeholder desuden to typer PCR-additiver (Enhancer 1 og Enhancer 2). Primer mix REF-NR. Reak. Vol/rør Antal rør Farvekode HLA-A P µl 1 Gul HLA-B P µl 1 Rød HLA-C P µl 1 Orange HLA-DRB1/DRB3 P µl 1 Grøn HLA-DRB4 P µl 1 Hvid HLA-DRB5 P µl 1 Lyserød HLA-DPA1 P µl 1 Sort HLA-DPB1 P µl 1 Lilla HLA-DQA1 P µl 1 Brun HLA-DQB1 (Set 3) P µl 1 Blå Enhancer 1 E µl 1 Klar Enhancer 2 E µl 1 Klar Side 8 48

9 Æske med reagenser til præparering af bibliotek Denne komponentæske indeholder reagenser til bibliotekspræparering (fragmentering, bluntending og adenylering af amplikonernes ender og ligering af indekserede adaptorsekvenser til dem) fra HLA-amplikoner. Reagens REF-nr. Reak. Vol/rør Antal rør Farvekode Fragmenteringsenzym (A) R µl 1 Gul Fragmenteringsbuffer (B) R µl 1 Rød Endereparationsenzym (C) R µl 1 Grøn Endereparationsbuffer (D) R µl 1 Orange Ligeringsenzym (E) R µl 1 Blå Ligeringsbuffer (F) R µl 2 Sort 96-brønds adaptorplade Produkttype Holotype HLA 24/11 Configuration A1 & CE (REF:H62) Holotype HLA 24/11 Configuration A2 & CE (REF:H64) Holotype HLA 24/11 Configuration A3 & CE (REF:H66) Holotype HLA 24/11 Configuration A4 & CE (REF:H68) Associeret reagens Den indekserede adaptorplade med 96 brønde indeholder brugsklare indekserede NGS-adaptorer (dobbeltstrengede DNA-oligonukleotider) i 5 μl opløsning til generering af individuelle NGSbiblioteker. Den indekserede adaptorplade med 96 brønde indeholder tilstrækkeligt med indekserede adaptorer til 24 individuelle NGS-biblioteksgenereringer og til downstreamprøveindentifikation. REFnr. Reak. Vol./ brønd Antal plader Adaptorplade A1 (i1-24) N µl 1 Adaptorplade A2 (i25-48) N µl 1 Adaptorplade A3 (i49-72) N µl 1 Adaptorplade A4 (i73-96) N µl 1 Excel Workbook Der medfølger en Excel Workbook til at understøtte Holotype HLA 24/11-protokollen med beregninger, pladelayout, journalføring, MiSeq Sample Sheet-generering og meget mere. Hvis du ikke har et eksemplar, kan du kontakte support@omixon.com. Side 9 48

10 Software Omixon HLA Twin Kontakt for Omixon HLA Twin-credits i forbindelse med dit køb af Holotype HLA 24/11-kittet. Vigtigt: Brug alle tre Omixon Holotype HLA 24/11-kitkomponenter og Omixon HLA Twin-softwaren i samme workflow for at danne et workflow til in vitro-diagnostisk brug. Se Advarsler og forsigtighedsregler for oplysninger om begrænsninger i anvendelsen af produktet. Erstatningskomponenter fås på særlig anmodning fra bruger. Bemærk, at Omixon leverer erstatninger for komponentæsker, ikke individuelle rør. Kontakt sales@omixon.com for yderligere oplysninger. Forsendelse og opbevaring Forsendes på tørispakninger i flamingokasse og skal efter modtagelse opbevares ved -20 C. Valider temperaturstyringen og monitoreringsprocessen for fryserne, og vedligehold det jævnligt. Uåbnede kit er stabile indtil kittets udløbsdato (beskrevet på kittets mærkat), når de opbevares ved -20 C. Efter åbning af produktet anbefales maksimalt fire (4) nedfrysninger/optøninger for at sikre produktets stabilitet. Åbnede kit er stabile i op til 3 måneder, når de opbevares ved -20 C. Advarsler og forsigtighedsregler Begrænsninger for produktbrug Den bedste ydeevne opnås ved at anvende Holotype HLA 24/11-kit-workflowet og Omixon HLA Twin-softwaren til HLA-typebestemmelse med NGS med de materialer, reagenser og det udstyr, som anbefales i afsnittet Udstyr, reagenser og forsyninger. Hvis der anvendes andre materialer end dem, der er angivet i afsnittet Udstyr, reagenser og forsyninger, skal de verificeres og valideres af brugeren. Reagenserne må ikke rekonstitueres eller fortyndes i andre volumener end dem, der er beskrevet i denne brugsanvisning. Brug ikke mindre reagens end beskrevet i denne brugsanvisning. Det kan føre til fejl i ydeevnen. Omixon kan ikke yde support til problemer, som skyldes, at de protokoltrin, der er beskrevet i denne brugsanvisning, ikke er fulgt. Anvend ikke i produktet, hvis der ses skader på komponenterne (rør eller plader, som er gået i stykker, løse hætter osv.). Side 10 48

11 Kendte begrænsninger ved produktet Der henvises til dokumentet Product Known Limitations Guide (Vejledning i kendte begrænsninger ved produktet) for oplysninger om kendte ambiguiteter og softwarebegrænsninger ved Holotype HLA-produktet. Vejledningen udsendes sammen med brugsanvisningen, men kan også findes på Omixons hjemmeside under MyHolotype/Support (Min holotype/support) og Services/HLA Twin Instructions for Use (Services/HLA Twin-brugsanvisning), eller den kan rekvireres ved at skrive til support@omixon.com. Sikkerhedsoplysninger Læs afsnittet Sikkerhedsoplysninger og Vigtige bemærkninger til alle reagenser eller kit, som er anført i afsnittet Udstyr, reagenser og forsyninger, før du går i gang. Når du arbejder med kemikalier, skal du altid bruge en passende kittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller. Du kan læse mere i de relevante sikkerhedsdatablade (SDS), som kan rekvireres hos den angivne produktleverandør. Du kan finde en oversigt over produktreagensernes kemiske bestanddele i SDS'erne til Holotype HLA 24/11-kittet, som kan rekvireres. Produktkomponenterne bortskaffes som almindeligt medicinsk affald. Ydeevneparametre De vigtigste ydeevneparametre, som er fastslået i henhold til produktvalideringen. HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1 Sensitivitet 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724% Specificitet 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775% Præcision 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724% Nøjagtighed 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572% Reproducerbarhed 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% Repeterbarhed 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% Teknisk bistand Hvis der ønskes generel teknisk bistand med denne protokol, kontaktes support@omixon.com Telefonsupport: USA +1 (617) Europa Resten af verden +1 (617) Side 11 48

12 Udstyr, reagenser og forsyninger Tekniske og udstyrsmæssige anbefalinger Thermocycler med 96-brøndsformat Pladefluorometer (eller andet instrument, som kan registrere fluorescens på plader med 96 brønde, til brug med Promega QuantiFluor dsdna-systemet) Pippin Prep (kat.nr. PIP0001) eller Blue Pippin (kat.nr. BLU0001) fra SAGE Science qpcr-instrument med 96- eller 384-brøndsplader Qubit-fluorometer (kat.nr. Q33216, Thermo Fisher Scientific) (valgfrit) Illumina MiSeq (kat.nr. SY ) 64-bit-computer med mindst 4 cores og 16 GB RAM Langsigtet dataopbevaring (ca. 2 TB data pr. MiSeq pr. år) Anbefalinger for associerede reagenser LongRange PCR-kit fra Qiagen (kat.nr , eller ) Der skal bruges 4,4 μl Taq Polymerase til hver prøve Kat.nr LongRange PCR-kit (20) indeholder 8 μl Taq Polymerase Kat.nr LongRange PCR-kit (100) indeholder 40 μl Taq Polymerase Kat.nr LongRange PCR-kit (250) indeholder 100 μl Taq Polymerase ExoSAP-IT fra Affymetrix (kat.nr , ML, X-1ML eller ML) Der skal bruges 4 μl ExoSAP-IT-enzym til hver poolet prøve Kat.nr indeholder 200 μl ExoSAP-IT Express-enzym Kat.nr ML indeholder 1 ml ExoSAP-IT Express-enzym Kat.nr X-1ML indeholder 4 ml ExoSAP-IT Express-enzym Kat.nr ML indeholder 10 ml ExoSAP-IT Express-enzym Bibliotekskvantiteringskit Illumina/Universal fra KAPA Biosystems (kat.nr. KK4824) Qubit dsdna BR Assay Kit (kat.nr. Q32850 eller Q32853) (valgfrit) Kat.nr. Q32850 indeholder 100 analyser Kat.nr. Q32853 indeholder 500 analyser QuantiFluor dsdna System fra Promega (kat.nr. E2670) Agencourt AMPure XP-beads fra Beckman Coulter (kat.nr. A63880, A63881 eller A63882) Til hver Holotype HLA-kørsel skal der bruges maksimalt 900 μl AMPure XP-beads Kat.nr. A63880 indeholder 5 ml AMPure XP-beads Kat.nr. A63881 indeholder 60 ml AMPure XP-beads Kat.nr. A63882 indeholder 450 ml AMPure XP-beads Gelkassette, 1,5 % agarose, uden farve med intern standard (Marker K/R2) til Pippin Prep/Blue Pippin (kat.nr. CDF1510 til Pippin Prep og BDF1510 til Blue Pippin) Absolut alkohol (vandfri alkohol (etanol) Sterilt vand (DNase- og RNase-frit) Natriumhydroxid 1 TE Buffer (ph 8,0) MiSeq-reagenskit fra Illumina Side 12 48

13 MiSeq-reagenskitkapacitet Tid Timer Illumina MiSeqreagenskit Std 500 Cycle (MS ) Std 300 Cycle (MS ) Micro 300 Cycle (MS ) Nano 500 Cycle (MS ) Nano 300 Cycle (MS ) 24/11- prøver ~39 24 ~24 24 ~19 20 ~28 8 ~17 4 Anbefalede forsyninger 1,5 ml mikrocentrifugerør 1,5 ml low bind-mikrocentrifugerør 2,0 ml low bind-mikrocentrifugerør (Eppendorf DNA LoBind kat.nr anbefales) 0,5 ml tyndvæggede rør til Qubit-instrument (Qubit Assay-rør kat. nr. Q32856 anbefales) Justerbare pipetter (1, μl kapacitet) Justerbare 8-kanalspipetter (1,0 100 μl kapacitet) 96-brøndsplader, som er kompatible med thermocycler Optiske 96-brøndsplader, som er kompatible med pladefluorometer 96-brøndsplader, som er kompatible med qpcr-instrument Pladeforseglinger til generel brug Pladeforseglinger, som er kompatible med thermocyclere (testet til long range PCR) Optiske pladeforseglinger, som er kompatible med qpcr-instrument (valgfrit) Magnetisk holder, som er kompatibel med 2 ml mikrocentrifugerør Kølerack med 96 brønde (2 stk.) 50 ml koniske rør 50 ml beholdere Side 13 48

14 Juridisk meddelelse Holotype HLA 24/11 IFU og alt indhold tilhører Omixon Biocomputing Limited ( Omixon ) og er kun beregnet til kundens kontraktlige brug med hensyn til de produkter, som er beskrevet heri, og ikke til andre formål. Dokumentet og dets indhold må ikke anvendes eller distribueres til andre formål og/eller på anden måde kommunikeres, videregives eller gengives uden forudgående skriftlig tilladelse fra Omixon. Omixon giver med dette dokument ikke nogen licens i henhold til sit patent, sit varemærke, sin copyright eller sine sædvaneretlige rettigheder eller tilsvarende rettigheder tilhørende tredjeparter. Omixon HLA Twin ( Software ) gives i licens til kunden i henhold til vilkårene og betingelserne i Omixon HLA Twin EULA ( Hvis du ikke kan acceptere vilkårene og betingelserne deri, giver Omixon dig ikke licens til softwaren, og du må ikke bruge eller installere softwaren. Instruktionerne i dette dokument skal følges nøje og udtrykkeligt af kvalificeret og tilstrækkeligt uddannet personale for at sikre korrekt og sikker brug af de produkter, som er beskrevet heri. Hele dette dokument skal læses grundigt igennem og være forstået, før produkterne tages i brug. HVIS ALLE INSTRUKTIONERNE IKKE LÆSES OG OVERHOLDES UDTRYKKELIGT OG FULDT UD, KAN DET RESULTERE I SKADER PÅ PRODUKTERNE, SKADER PÅ PERSONER, HERUNDER BRUGERNE ELLER ANDRE, OG SKADER PÅ ANDEN EJENDOM. OMIXON PÅTAGER SIG IKKE NOGET ANSVAR FOR SKADER, DER SKYLDES FORKERT BRUG AF DE PRODUKTER, SOM ER BESKREVET HERI (HERUNDER DELE HERAF ELLER SOFTWAREN) ELLER BRUG AF PRODUKTERNE, SOM LIGGER UDEN FOR DE UDTRYKKELIGE SKRIFTLIGE LICENSER ELLER TILLADELSER, SOM ER GIVET AF OMIXON I FORBINDELSE MED KUNDENS ERHVERVELSE AF PRODUKTERNE. TIL IN VITRO-DIAGNOSTISK BRUG 2017 Omixon Biocomputing Ltd. Alle rettigheder forbeholdes. Tilsigtet brug Holotype HLA 24/11 Configuration A1 & CE /A2 & CE /A3 & CE/ A4 & CE-produktet (kaldet Holotype HLA) er en kombination af in vitro-diagnostiske analysereagenser og dataanalysesoftware (Omixon HLA Twin ) og er beregnet til identifikation og definition af humane leukocytantigener (HLA) klasse I og II og til brug ved HLA-typebestemmelse med Illumina MiSeq Next Generation Sequencing-platformen. Holotype HLA giver human histokompatibilitetsinformation om HLA klasse I (A, B og C)- og klasse II (DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRB1, DRB3, DRB4 og DRB5)-loci med humant genomisk DNA. Omixon HLA Twin softwaren, der følger med Holotype HLA-produktet, er beregnet til at fortolke og matche sekventeringsdata, som er genereret på Illumina MiSeq-systemet, hvorved der opnås en meget nøjagtig, single-pass HLA-typebestemmelse på allelniveau med en meget lav ambiguitet på 2-feltsniveau. Side 14 48

15 Holotype HLA-produktet er beregnet til in vitro-diagnostisk brug af professionelt sundhedspersonale, f.eks. laboratorieteknikere og læger, som er uddannet i HLA-typebestemmelse, på diagnostiske laboratorier, som enten er EFI- eller ASHI-akkrediteret, eller som kan arbejde i henhold til EFI- eller ASHI-specifikationerne. Vigtig bemærkning før start Anbefaling for isolering af genomisk DNA Humant genomisk DNA skal præpareres med gennemprøvede, kommercielt tilgængelige DNApræpareringskit for at sikre ensartet præparering. Uanset metode er nøjagtig bestemmelse af koncentration og renhed nødvendig for robuste analyser. DNA'et skal være fri for kontaminanter, som påvirker senere amplificerings-, bibliotekspræparerings- og sekventeringstrin (f.eks. alkohol, salte, detergenter, formaldehyd og heparin). Blod må ikke indsamles i hepariniserede rør, og blodprøver fra patienter, som gennemgår heparinbehandling, og lipæmiske eller hæmolyserede prøver må ikke anvendes. Klargjort genomisk DNA kan anvendes med det samme, hvis det er klargjort i nukleasefrit vand, eller opbevares i længere tid ved -20 C eller derunder. Vi anbefaler, at der anvendes vand til gdna-præparering, da EDTA i TE-buffer kan hæmme long range PCR-reaktioner. Gentagen nedfrysning-optøning bør undgås for at mindske nedbrydning. En koncentration på ng/µl DNA anbefales kraftigt til at give et input på ng genomisk DNA pr. PCR-amplificering. Vi anbefaler kraftigt, at der anvendes en fluorescensbaseret kvantiteringsmetode til at bestemme gdna-koncentrationen. En absorbansratio på 260 nm/280 nm og 260 nm/230 nm værdier på 1,7-2 anbefales kraftigt. Til amplificering af HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA- DPB1, HLA-DQA1 og HLA-DQB1 skal der bruges 1,0-1,5 µg gdna til hver prøve. Metodens princip I mange år har man på HLA-området arbejdet hen mod en metode, som nøjagtigt kan identificere den omfattende polymorfisme i HLA-generne og deres genprodukter. Da PCR kombineret med andre teknologier (Sanger-sekventering, SSOP, SSP, Luminex) kom til, havde man en formel for at forbedre påvisningen af HLA-polymorfismer betydeligt, men dog med flere begrænsninger, som fortsat hæmmer vores evne til at karakterisere HLA-generne fuldt ud. Teknologier, som er udviklet i de senere år og tilsammen kaldes Next Generation Sequencing (NGS), har givet nye muligheder, som gør det muligt at karakterisere HLA-generne fuldstændigt på haploid vis. NGS har to distinkte egenskaber, 1) klonal sekventering af DNA-fragmenter og 2) meget stort output. NGS gør det muligt at fase polymorfismer og dermed eliminere alle ambiguiteter, og samtidig kan der HLAtypebestemmes på tre til fire feltniveauer uden refleksiv testning, og dermed introduceres der en potentiel totalløsning på HLA-typebestemmelsesproblemet. Den protokol, der beskrives her, Side 15 48

16 benytter denne teknologi og kombinerer long range PCR-amplificering af HLA-gener med sekventering på Illumina MiSeq-platformen. Mere specifikt amplificeres HLA-generne A, B, C, DPA1, DQA1 og DQB1 i hele deres kodningslængde, inklusive elementer i de utranslaterede 5 og 3 regioner, mens DRB1, DRB3 og DRB4 amplificeres fra intron 1 til intron 4, og DRB5 og DPB1 amplificeres fra intron 1 til den utranslaterede 3 region. Amplikonerne behandles derefter gennem en serie trin, som: 1. Fragmenterer amplikonerne til en størrelse, som passer til sekventering på Illumina-platformen 2. Blund-end'er og adenylerer enderne af de fragmenterede amplikoner 3. Ligerer adaptorsekvenser, som anvendes i hele processen på MiSeq, for at opsamle, amplificere og sekventere DNA'et. Adaptorerne inkluderer også et indeks, som er en kort sekvens, der er unik for hver adaptor og fortæller, hvor biblioteket kommer fra (prøve/locus). Efter pooling af de indekserede biblioteker, valg af størrelse og kvantitering, sættes prøven på MiSeq til sekventering. Hele processen tager 3-5 dage, alt efter hvilken flowcelle der er valgt på Illumina-platformen. Nedenstående figur viser en oversigt over trinene i protokollen: Side 16 48

17 Oversigt over trin PRÆPARERING AF GDNA PRÆPARERING AF MASTER MIX HLA KLASSE I- OG KLASSE II- AMPLIFICERING HÅNDTERINGSTID: 0T 45, SAMLET TID: 0T 45 HÅNDTERINGSTID: 0H 50, SAMLET TID: 6H 50 KVANTITERING OG NORMALISERING AF AMPLIKON PRÆPARERING AF BIBLIOTEK HÅNDTERINGSTID: 0H 40, SAMLET TID: 0H 40 HÅNDTERINGSTID: 0T 55, SAMLET TID: 3T VALG AF BIBLIOTEKSSTØRRELSE KVANTITERING AF BIBLIOTEK HÅNDTERINGSTID: 0T 15, SAMLET TID: 1T HÅNDTERINGSTID: 0T 15, SAMLET TID: 1T 15 SEKVENTERING PÅ ILLUMINA MISEQ ANALYSE AF HLA SEKVENTERINGSDATA HÅNDTERINGSTID: 0T 20, SAMLET TID: 23T HÅNDTERINGSTID: 0T 0, SAMLET TID: 6T Side 17 48

18 Ordliste/definitioner Amplikonplade Alternativt navn for en amplificeringsplade Amplikonkvantiteringsplade 96-brøndsplade, som er kompatibel med pladefluorometeret, hvor de fortyndede amplikoner kvantiteres Amplificeringsplade PCR-plade med 96 brønde, der bruges til at amplificere HLA-loci Slutbibliotek Bibliotek, der indeholder alle prøvebiblioteker, som er klar til at blive sekventeret i en enkelt MiSeq-kørsel Reaktionsplade Plade, hvor de sekventielle reaktioner, som fragmenterer, endereparerer og ligerer de indekserede adaptorer til prøvebibliotekerne, udføres Reagensplade Plade, som bruges til at alikvotere de forskellige reagenser, der bruges til at præparere bibliotekerne Prøvebibliotek Et bibliotek, som er klargjort ved at kombinere (poole) alle HLA-loci for en given prøve Poolet amplikonplade Plade, som indeholder et prøvebibliotek (alle loci kombineret) pr. brønd Standardkvantiteringsplade 96-brøndsplade, som er kompatibel med pladefluorometeret, hvor DNA-standarderne placeres for at muliggøre amplikonkvantitering Side 18 48

19 Trin 1 HLA-amplificering, præparering af Master Mix Varighed: ~45 minutter Formålet med dette trin er at præparere locusspecifikke Master Mix til at amplificere de ønskede HLA-loci hver for sig. De loci, der amplificeres med denne protokol, er HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA- DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 og HLA-DQB1. Bemærk: De Master Mix, der præpareres i dette trin, omfatter alle reagenser, som er nødvendige til amplificering, undtagen Taq Polymerase. Reagensliste Element Opbevaring Leveret af HLA-A Primer Mix -20 C Omixon HLA-B Primer Mix -20 C Omixon HLA-C Primer Mix -20 C Omixon HLA-DRB1/DRB3 Primer Mix -20 C Omixon HLA-DRB4 Primer Mix -20 C Omixon HLA-DRB5 Primer Mix -20 C Omixon HLA-DPA1 Primer Mix -20 C Omixon HLA-DPB1 Primer Mix -20 C Omixon HLA-DQA1 Primer Mix -20 C Omixon HLA-DQB1 Set 3 Primer Mix -20 C Omixon Enhancer 1-20 C Omixon Enhancer 2-20 C Omixon LongRange PCR Buffer (10 ) -20 C Qiagen dntp'er (10 mm pr. stk.) -20 C Qiagen Sterilt H2O -20 C Qiagen Protokol 1.1 Tag alle primer mix, Enhancer 1 og 2, dntp'er og Long-Range PCR Buffer (10 ) frem, og optø ved stuetemperatur. 1.2 Præparer den kombinerede Enhancer: Tilsæt 132 μl Enhancer 2 til Enhancer 1-røret. Mærk Enhancer 1-røret som Kombineret Enhancer. Gem den resterende Enhancer 2 til DRB4 Long-Range PCR-reaktionen. 1.3 Præparer en Master Mix til hver Primer Mix i henhold til nedenstående tabeller: Side 19 48

20 Master Mix: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 og DQA1 Reagens Volumen/prøve/locus Volumen/24 prøver/locus Primer Mix 2 µl 51 µl LongRange PCR Buffer (10 ) 2,5 µl 63,8 µl dntp Mix (10 mm pr. stk.) 1,25 µl 31,9 µl Sterilt H2O 13,85 µl 353,2 µl Samlet volumen 19,6 µl 499,9 µl Master Mix: HLA-DRB4 Reagens Volumen/prøve/locus Volumen/24 prøver/locus Primer Mix 2 µl 51 µl LongRange PCR Buffer (10 ) 2,5 µl 63,8 µl dntp Mix (10 mm pr. stk.) 1,25 µl 31,9 µl Enhancer 2 0,6 µl 15,3 µl Sterilt H2O 13,25 µl 337,9 µl Samlet volumen 19,6 µl 499,9 µl Master Mix: HLA-DQB1 Set 3 Reagens Volumen/prøve/locus Volumen/24 prøver/locus Primer Mix 2 µl 51 µl LongRange PCR Buffer (10 ) 2,5 µl 63,8 µl dntp Mix (10 mm pr. stk.) 1,25 µl 31,9 µl Kombineret Enhancer 5,6 µl 142,8 µl Sterilt H2O 7,85 µl 200,2 µl Samlet volumen 19,2 µl 489,7 µl 1.4 Vortex hver Master Mix, og centrifuger den ned i 1 sekund. Anbring alle Master Mix på is. 1.5 Fortynd alle gdna'er til en koncentration på ng/μl (mindste volumen er 55 μl). Bemærk: Holotype HLA inkluderer reagenser til 24 reaktioner plus yderligere volumen til pipetteringstab og mislykket amplificering. Side 20 48

21 Trin 2 HLA klasse I- og II-amplificering Varighed: ~6 timer 50 minutter Formålet med trin 2 er at amplificere HLA-lociene. HLA klasse I- og II-amplificeringer er optimeret med to separate sæt PCR-betingelser. Når PCR-reaktionerne er udført, verificeres amplificeringen med agarosegelelektroforese (valgfrit). Reagensliste Hurtigt tip Agarosegelelektroforese anbefales, men er ikke nødvendig for at udføre Holotype HLA-protokollen. Når amplikonerne er kvantiteret (trin 3), betragtes enhver koncentration over 50 ng/μl som en vellykket amplificering. Agarosegelelektroforese er et vigtigt kvalitetskontroltrin og bør ikke springes over uden tilstrækkelig erfaring med hele Holotype HLA-protokollen. Element Opbevaring Leveret af HLA-A Master Mix -20 C Trin 1 HLA-B Master Mix -20 C Trin 1 HLA-C Master Mix -20 C Trin 1 HLA-DRB1/DRB3 Master Mix -20 C Trin 1 HLA-DRB4 Master Mix -20 C Trin 1 HLA-DRB5 Master Mix -20 C Trin 1 HLA-DPA1 Master Mix -20 C Trin 1 HLA-DPB1 Master Mix -20 C Trin 1 HLA-DQA1 Master Mix -20 C Trin 1 HLA-DQB1 Set 3 Master Mix -20 C Trin 1 Taq Polymerase -20 C Qiagen gdna 4 C Bruger Sterilt H2O 20 C Bruger Protokol 2.1 Tag Taq Polymerase frem, centrifuger den ned, tilsæt den til hver Master Mix i henhold til nedenstående tabeller, og skyl pipettespidserne grundigt ved at pipettere: Side 21 48

22 Master Mix tilsat Taq Polymerase: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 og DQA1 Reagens Volumen/prøve/locus Volumen/24 prøver/locus Master Mix fra trin 1 19,6 µl 499,9 µl Taq Polymerase 0,4 µl 10,2 µl I alt 20 µl 510,1 µl Master Mix tilsat Taq Polymerase: HLA-DQB1 set 3 Reagens Volumen/prøve/locus Volumen/24 prøver/locus Master Mix fra trin 1 19,2 µl 489,7 µl Taq Polymerase 0,8 µl 20,4 µl I alt 20 µl 510,1 µl 2.2 Vortex alle Master Mixes med Taq Polymerase kort, og centrifuger dem ned. Alikvoter 20 μl af hver Master Mix med Taq Polymerase i separate brønde på 96-brønds PCR-plader. Bemærk: Klasse I- og II-amplificering er optimeret med to forskellige PCRprogrammer, så klasse I- og klasse II-Master Mix må ikke være på samme plade. 2.3 Tilsæt 5 μl af hvert fortyndet gdna til den relevante brønd på pladerne, som blev klargjort i det foregående trin. Bland ved pipettering. Forsegl dem med termisk forsegling, og efterse hver enkelt brønd. Centrifuger alle amplificeringsplader ned i en centrifuge. 2.4 Anbring amplificeringspladerne i thermocyclere, og kør programmerne for klasse I- og klasse II-amplificering i henhold til nedenstående tabeller: Klasse I-amplificering (HLA-A, B og C) Antal cyklusser Temperatur Tid 1 95 C 3 minutter 95 C 15 sekunder C 30 sekunder 68 C 5 minutter 1 68 C 10 minutter 1 4 C Side 22 48

23 Klasse II-amplificering (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 og DQB1) Antal cyklusser Temperatur Tid 1 95 C 3 minutter 93 C 15 sekunder C 30 sekunder 68 C 9 minutter 1 68 C 10 minutter 1 4 C Bemærk: Amplificeringen kan kontrolleres ved at køre 2 μl fra hvert amplikon i en 2 % standardagarosegel ved 250 V i 30 minutter (valgfrit). Forventede amplikonstørrelser HLA-locus Forventet amplikonstørrelse (kb) HLA-A, B og C ~3 HLA-DRB1/DRB3 ~4,3 HLA-DRB4 ~4,2 HLA-DRB5 ~5 HLA-DPA1 ~5,5 HLA-DPB1 ~6,6 HLA-DQA1 ~5,5 HLA-DQB1 (Set 3) ~6,5 Sikkert stoppunkt. Amplikoner kan opbevares ved 4 C natten over eller -20 C i længere tid. Side 23 48

24 Trin 3 Kvantitering og normalisering af amplikon (med pladefluorometer) Varighed: ~40 minutter Kvantitering og normalisering af amplikoner anbefales for at sikre præcist input i bibliotekspræpareringstrinet (valgfrit). Amplikonkoncentrationen måles med QuantiFluor dsdnasystemet, som indeholder en fluorescerende DNA-bindende farve og DNA-standard til sensitiv kvantitering af små mængder dobbeltstrenget DNA (dsdna). Se bilag 2 for nærmere oplysninger om, hvordan amplikonkvantitering udføres med en qpcr-maskine. Reagensliste Hurtigt tip Amplikonkvantitering anbefales, men er ikke nødvendig for at udføre Holotype HLA-protokollen. Amplikonnormalisering kræver ikke præcis måling af amplikonkoncentration. Et estimat af amplikonkoncentrationer, som er baseret på erfaring eller agarosegelelektroforese, kan anvendes i stedet. Amplikonkvantitering er et vigtigt kvalitetskontroltrin og bør ikke springes over uden konsistent erfaring med hele Holotype HLA-protokollen. Element Opbevaring Leveret af Klasse I-amplificeringsplade 4 C Trin 2 Klasse II-amplificeringsplade 4 C Trin 2 Lambda DNA Standard (100 ng/μl) 4 C Promega QuantiFluor dsdna Dye (200 ) 4 C Promega 20 TE Buffer (ph 7,5) 4 C Promega Sterilt H2O 20 C til 25 C Bruger ExoSAP-iT Express -20 C Affymetrix Side 24 48

25 Protokol 3.1 Præparer DNA-standarder ved seriefortynding af Lambda DNA-standarden (100 ng/μl), som følger med QuantiFluor-kittet, i henhold til nedenstående fortyndingstabel: Mærkat på rør Input-DNA Volumen DNA (μl) Volumen 1x TE (μl) Slutkonc. (ng/μl) Standard 1 Lambda DNA 7,5 µl 492,5 µl 1,5 ng/µl Standard 2 Standard µl 250 µl 0,75 ng/µl Standard 3 Standard µl 250 µl 0,38 ng/µl Standard 4 Standard µl 250 µl 0,19 ng/µl Standard 5 Standard µl 250 µl 0,09 ng/µl Standard 6 Standard µl 250 µl 0,05 ng/µl Blank Blank 0 µl 250 µl 0 ng/µl 3.2 Præparer amplikonkvantiteringspladerne (se Supplerende figurer). Alikvoter 99 μl 1x TEbuffer til brøndene på en optisk 96-brøndsplade til det samlede antal amplikoner, der skal kvantiteres. 3.3 Tilsæt 1 μl amplikoner fra de tilsvarende brønde på amplikonpladerne til individuelle brønde på amplikonkvantiteringspladerne. Bland ved pipettering. 3.4 Præparer 1 QuantiFluor Dye-arbejdsopløsning med følgende formel: 0,5 μl QuantiFluor Dye (200X) + 99,5 μl 1 TE-buffer. Præparer tilstrækkelig 1 QuantiFluor Dye-arbejdsopløsning, så hver prøve (samlede antal prøver på amplikonplader) og standard (14 i alt) modtager en alikvot på 100 μl. 3.5 Præparer en standardkvantiteringsplade og amplikonkvantiteringsplader. Alikvoter 100 μl 1 QuantiFluor Dye-arbejdsopløsning til brønde på den optiske 96-brønds plade, som skal være standardkvantiteringspladen, og til amplikonkvantiteringspladerne fra trin Brug de standarder, som blev klargjort ovenfor, og tilsæt 100 μl af hver standard, in duplo, til individuelle brønde på standardkvantiteringspladen (14 brønde i alt). Bland ved pipettering. 3.7 Vortex godt for at blande, og centrifuger ned. 3.8 Kør standardkvantiteringspladen på pladefluorometeret og derefter amplikonkvantiteringspladerne. 3.9 Beregn koncentrationen af DNA på amplikonkvantiteringspladerne ved hjælp af RFU-data, som er genereret af pladefluorometeret. Se fanen Dilution (Fortynding) i den medfølgende arbejdsbog for at få hjælp til beregningerne. Side 25 48

26 3.10 Fortynd DNA på amplikonpladerne med sterilt H2O, så slutkoncentrationen af DNA er ca. 67 ng/μl. Hvis DNA-koncentrationen er 150 ng/μl eller større: Tilsæt 25 μl H2O Hvis DNA-koncentrationen er ng/μl: Tilsæt 10 μl H2O Hvis DNA-koncentrationen er mindre end 100 ng/μl: Tilsæt ikke H2O Amplikon-pooling 3.11 Pool alle loci for hver prøve til en enkelt poolet amplikonplade. Kombiner de angivne volumener for hvert locus som i følgende tabel for at opnå et slutvolumen på 35 μl: HLA-locus A B C DRB1/DRB3 DRB4 DRB5 DPA1 DPB1 DQA1 DQB1 set 3 Poolet volumen 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3.12 Tilsæt 4 μl ExoSAP-iT Express til hvert prøvebibliotek. Skyl pipettespidserne ved pipettering. Forsegl pladen med en termisk forsegling, og centrifuger ned Anbring pladen med poolede amplikoner i en thermocycler, og kør følgende program: Oprensning af PCR-produkter med ExoSAP-IT Antal cyklusser Temperatur Tid 1 37 C 4 minutter 1 80 C 1 minut 1 4 C Sikkert stoppunkt. Amplikoner kan opbevares ved 4 C natten over eller -20 C i længere tid. Side 26 48

27 Trin 4 Præparering af bibliotek Varighed: ~3 timer På dette trin præpareres de poolede amplikoner til sekventering på Illumina MiSeq. Amplikonerne er enzymatisk fragmenteret, enderne er repareret og adenyleret, og indekserede adaptorer er ligeret til enderne. Bibliotekerne pooles derefter efterfulgt af et enkelt oprensnings- og koncentrationstrin, som udføres med AMPure XP-beads. Reagensliste Bemærk: Omixon anbefaler volumener, som er større end nødvendigt til 24 prøver, da mange af enzymerne og bufferne er viskøse, hvilket resulterer i et stort pipetteringstab. Element Opbevaring Leveret af Poolet amplikonplade 4 C Trin 3 Fragmenteringsenzym (A) -20 C Omixon Fragmenteringsbuffer (B) -20 C Omixon Endereparationsenzym (C) -20 C Omixon Endereparationsbuffer (D) -20 C Omixon Ligeringsenzym (E) -20 C Omixon Ligeringsbuffer (F) -20 C Omixon Adaptorplade -20 C Omixon AMPure XP-beads 4 C Beckman Coulter 80 % etanol (frisktilberedt) 20 C til 25 C Bruger Sterilt H2O 20 C til 25 C Bruger Protokol 4.1 Tænd thermocycleren. Kontrollér, at det opvarmede låg varmer op. Bemærk: Husk at vortexe fragmenteringsenzymet (A) før brug. 4.2 Præparer Master Mix til fragmentering i henhold til nedenstående tabel: Side 27 48

28 Master Mix til fragmentering Reagens Volumen pr. bibliotek (μl) Anbefalede volumener til 24 biblioteker (μl) Farvekode Fragmenteringsenzym (A) 2 µl 55,2 µl Gul Fragmenteringsbuffer (B) 2 µl 55,2 µl Rød Samlet volumen 4 µl 110,4 µl 4.3 Præparer en reagensplade: Anbring en ny 96-brønds PCR-plade på et PCR-kølerack, og alikvoter den samme mængde Master Mix til fragmentering i hvert brønd i en enkelt kolonne. Bemærk: Fragmenteringsreaktionen er designet til at give DNA i en størrelse, der passer til sekventering på Illumina MiSeq. Det er vigtigt at holde reagenserne kolde, indtil reaktionen er startet i thermocycleren, for at forhindre for stor fragmentering. Det anbefales at anvende multikanalspipetter for at minimere mulighederne for for stor fragmentering. 4.4 Centrifuger den poolede amplikonplade i 10 sekunder, og anbring den på is eller en køleblok. 4.5 Præparer en reaktionsplade: Anbring en frisk 96-brønds PCR-plade på en PCR-køleblok. 4.6 Tilsæt 4 μl Master Mix til fragmentering fra reagenspladen til brøndene på reaktionspladen svarende til prøverne på den poolede amplikonplade. Det anbefales at anvende multikanalspipetter. 4.7 Overfør 16 μl af hvert amplikon fra pladen med poolede amplikoner til den tilsvarende brønd på reaktionspladen ved hjælp af en multikanalspipette. Bland ved pipettering. 4.8 Tildæk pladen med en termisk forsegling, og centrifuger i 10 sekunder. 4.9 Inkuber reaktionspladen i en thermocycler med følgende program: Fragmenteringsprogram Antal cyklusser Temperatur Tid 1 37 C 10 minutter 1 70 C 15 minutter 1 4 C Sikkert stoppunkt. Biblioteker kan opbevares ved 4 C natten over eller -20 C i længere tid Præparer Master Mix til endereparation i henhold til nedenstående tabel: Side 28 48

29 Master Mix til endereparation Reagens Volumen pr. bibliotek (μl) Anbefalede volumener til 24 biblioteker (μl) Farvekode Sterilt H2O 1,25 µl 34,8 µl Endereparationsenzym (C) 1,25 µl 34,8 µl Grøn Endereparationsbuffer (D) 2,5 µl 69,6 µl Orange Samlet volumen 5 µl 139,2 µl 4.11 Alikvoter den samme mængde Master Mix til endereparation til en enkelt ubrugt kolonne på reagenspladen Centrifuger reaktionspladen (med de fragmenterede prøver) i 10 sekunder. Tilsæt 5 μl Master Mix til endereparation fra reagenspladen til hver brønd på reaktionspladen. Det anbefales at anvende multikanalspipetter. Bland ved pipettering Tildæk pladen med en termisk forsegling, og centrifuger i 10 sekunder Inkuber reaktionspladen i en thermocycler med følgende program: Endereparationsprogram Antal cyklusser Temperatur Tid 1 20 C 30 minutter 1 70 C 5 minutter 1 4 C Sikkert stoppunkt. Biblioteker kan opbevares ved 4 C natten over eller -20 C i længere tid Tag den indekserede adaptorplade frem, og optø ved rumtemperatur, efter at endereparationsprogrammet er startet i thermocycleren. Når adaptorpladen har rumtemperatur, centrifugeres den i 3 minutter ved 3000 rpm Træk forsigtigt forseglingen af adaptorpladen. Du må ikke ryste adaptorpladen, når forseglingen er fjernet, for at forhindre krydskontaminering Overfør hele volumenet fra hver brønd fra reaktionspladen (25 μl) til den tilsvarende brønd på adaptorpladen. Side 29 48

30 Bemærk: Hvis hele adaptorpladen IKKE skal bruges, er det muligt kun at bruge det nødvendige antal adaptorer. Afskær pladeforseglingen mellem de brønde, der skal bruges, og de brønde, der ikke skal bruges. Træk forsigtigt forseglingen af adaptorpladen, og lad forseglingen sidde på de brønde, der ikke skal bruges. a. Overfør 25 μl fra hver endereparerede prøve fra reaktionspladen til en brønd på adaptorpladen, og bland godt med en pipette. b. Overfør hele volumenet af hver prøve fra adaptorpladen til den oprindelige brønd på reaktionspladen. c. Forsegl adaptorpladen igen, og læg den tilbage på -20 C. Brug reaktionspladen i stedet for adaptorpladen til de resterende trin i manualen Præparer Master Mix til ligering. Præparer tilstrækkeligt med Master Mix til ligering til hver prøve. Master Mix til ligering Reagens Volumen (μl) Anbefalede volumener til 24 biblioteker (μl) Farvekode Ligeringsenzym (E) 2,5 µl 63,2 µl Blå Ligeringsbuffer (F) 30 µl 757,5 µl Sort Samlet volumen 32,5 820,7 µl 4.19 Alikvoter Master Mix til ligering til en ubrugt kolonne på reagenspladen. Det anbefales at anvende multikanalspipetter Tilsæt 32,5 μl Master Mix til ligering til hver brønd på reaktionspladen. Det anbefales at anvende multikanalspipetter. Bland ved pipettering Tildæk pladen med en termisk forsegling, og centrifuger i 10 sekunder Inkuber reaktionspladen i thermocycleren med følgende program: Ligeringsprogram Antal cyklusser Temperatur Tid 1 25 C 10 minutter 1 70 C 10 minutter 1 4 C Sikkert stoppunkt. Biblioteker kan opbevares ved 4 C natten over eller -20 C i længere tid. Side 30 48

31 Pooling og oprensning af bibliotek 4.23 Lad AMPure XP-beads opnå rumtemperatur. Sørg for, at de er homogene (ingen klumper eller pellets). Præparer frisktillavet 5 ml 80 % etanol (4 ml EtOH + 1 ml H2O) Opret et bibliotek ved at kombinere en alikvot fra hvert poolede amplikon, nu et prøvespecifikt bibliotek, i et enkelt 2,0 ml low bind-mikrocentrifugerør. I. Til 16 eller flere prøver Beregn mængden for hvert prøvebibliotek, der skal pooles som et enkelt bibliotek med et samlet volumen på 900 μl. Divider 900 μl med antallet af prøvebiblioteker. Det er det alikvotvolumen, der skal tages fra hvert prøvebibliotek og pipetteres til biblioteket. II. Til færre end 16 prøver Overfør 60 μl af hvert prøvebibliotek til et bibliotek Tilsæt 900 μl AMPure XP-beads til biblioteksrøret, men undgå at berøre biblioteket med pipettespidsen. Bland grundigt ved at vortexe og centrifugere kort. Beadsene må ikke separere. Inkuber biblioteket i 10 minutter ved rumtemperatur. Bemærk: Hvis der er mindre end 900 μl bibliotek i slutpoolen, skal du tilsætte en tilsvarende mængde AMPure XP-beads. Forholdet mellem slutpool og AMPure XPbeads skal være 1: Anbring biblioteksrøret på en magnetisk holder, og inkuber i 10 minutter Hold røret på magnetholderen, og fjern og kassér forsigtigt supernatanten fra biblioteksrøret uden at røre ved beadsene Hold røret på magnetholderen, og tilsæt ~1,5 2 ml frisktillavet 80 % etanol til biblioteksrøret. Det volumen etanol, der tilsættes, skal kunne dække beadsene. Bemærk: Påfør etanolet på siden af røret uden beads Inkuber biblioteksrøret ved rumtemperatur i 30 sekunder, og fjern og kassér derefter forsigtigt supernatanten Gentag trin 4.28 og Centrifuger hurtigt biblioteksglasset ned, og sæt det tilbage i magnetholderen med låget åbent. Fjern overskydende etanol med en pipette. Rør ikke ved beadsene. Bemærk: Sørg for, at beadpelleten ikke indeholder overskydende etanol. Det kan være nødvendigt at rotere røret på magnetholderen for at fjerne etanolet uden at forstyrre beadpelleten Lad beadsene lufttørre i 5-8 minutter på magnetholderne, indtil beadpelleten er tør Tag biblioteksrøret af magnetholderen, og eluer biblioteket med 31 μl sterilt vand. Lad ikke pipettespidsen berøre beadsene, da de vil sætte sig fast på den. Side 31 48

32 4.34 Vortex biblioteket for at resuspendere beadsene helt. Centrifuger kort, hvis der er nogle små dråber tilbage på sidevæggene. Sørg for, at beadsene forbliver suspenderet Inkuber biblioteket i 2 minutter ved rumtemperatur Anbring biblioteksrøret på magnetholderen i 2 minutter Opsaml biblioteket: Hold røret med slutbiblioteket på magnetholderen, og opsaml 31 μl af supernatanten i et nyt 1,5 ml low bind-mikrocentrifugerør. Sikkert stoppunkt. Biblioteker kan opbevares ved -20 C i længere tid. Side 32 48

33 Trin 5 Udvælgelse af biblioteksstørrelse Varighed: ~1 time Trin 5 tager biblioteket fra trin 4 og udvælger fragmentstørrelser ved hjælp af Pippin Prep. Pippin Prep kan automatisk vælge et interval af DNA-fragmentstørrelser og eluere dem til et opsamlingskammer. Bemærk: Blue Pippin kan anvendes i stedet for Pippin Prep. Se tillæg 1 for brugsanvisning til Pippin Prep. Reagensliste Element Opbevaring Leveret af 1,5 % agarosegelkassette, uden farve 20 C til 25 C Sage Science Pippin-stamopløsning/marker mix (mærket K) 4 C Sage Science Poolet bibliotek 4 C Trin 4 Bemærk: Marker K anvendes med Pippin Prep. Blue Pippin anvender Marker R2. Protokol 5.1 Bring Marker K-stamopløsning på rumtemperatur. 5.2 Kombiner 31 μl af poolen med 10 μl Marker K-stamopløsning. 5.3 Bland ved at vortexe og centrifugere ned. 5.4 Konfigurer Pippin Prep til at indsamle DNA-fragmenter på mellem 650 og 1300 bps. Sæt 40 μl prøven i prøveporten, og kør. Kørselstiden er minutter. 5.5 Opsaml hele indholdet (ca. 40 μl) fra elueringsporten på Pippin Prep, og overfør det til et nyt 1,5 ml ml low bind-mikrocentrifugerør. Det er det størrelsesselekterede bibliotek. Sikkert stoppunkt. Biblioteker kan opbevares ved -20 C i længere tid. Side 33 48

34 Trin 6 Kvantitering af bibliotek med et qpcr-instrument Varighed: ~1 time 15 minutter Det er nødvendigt at kvantitere det størrelsesselekterede bibliotek for at bruge outputtet fra Illumina MiSeq-sekventeringsinstrumentet optimalt. Koncentrationen af det størrelsesselekterede bibliotek kan måles nøjagtigt med qpcr. Du kan også vælge at anvende Qubit dsdna BR-kittet og en Qubit-maskine til at måle bibliotekskoncentrationen. Se tillæg 3 for denne protokol. Reagensliste Element Opbevaring Leveret af 10 Illumina Primer Premix -20 C KAPA Biosystems 2 KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix -20 C KAPA Biosystems Std 1 (20,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 2 (2,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 3 (0,20 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 4 (0,02 pm) -20 C KAPA Biosystems Illumina DNA-standarder -20 C KAPA Biosystems Sterilt H2O 20 C til 25 C Bruger 1 TE Buffer (ph 8,0) 20 C til 25 C Bruger Størrelsesselekteret bibliotek 4 C Trin 5 Protokol 1 Præparer qpcr Primer Mix ved hjælp af 10 Illumina Primer Premix og 2 KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix: Bemærk: KAPA SYBR FAST qpcr-kitreagenser (qpcr Master Mix, Primer Premix og ROX-opløsninger) kombineres, når kittet tages i brug. Denne kombinerede opløsning er stabil til mindst 30 frys/tø-cyklusser. Følg KAPA-dokumentationen for at fastslå, om ROX anbefales til dit qpcr-instrument. qpcr Primer Mix Reagens Volumen (ml) 10 Illumina Primer Premix 1 ml 2 KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix 5 ml Samlet volumen 6 ml 2 Præparer qpcr Master Mix. Side 34 48

35 qpcr Master Mix Reagens Volumen (μl) qpcr Primer Mix 228 µl Sterilt H2O 76 µl Samlet volumen 304 µl 3 Præparer en seriel fortynding af det størrelsesselekterede bibliotek. a. Præparer en 1:1000-fortynding ved at tilsætte 1 μl størrelsesselekteret bibliotek til 999 μl 1 TE-buffer (ph 8,0), idet pipettespidsen skylles grundigt. Vortex, og centrifuger ned. b. Præparer en 1:2000-opløsning ved at tilsætte 100 μl af 1:1000-fortyndingen til 100 μl 1 TE-buffer (ph 8,0). Vortex, og centrifuger ned. 4 Præparer en qpcr-kvantiteringsplade på en frisk PCR-plade, som er kompatibel med dit qpcr-system. 5 Alikvoter 16 μl qpcr Master Mix in triplo til standard 1-4, 1:1000-opløsningen og 1:2000- opløsningen (se Supplerende figurer). 6 Alikvoter 4 μl standard 1-4, 1:1000-opløsningen og 1:2000-opløsningen til de tilsvarende brønde. 7 Forsegl qpcr-kvantiteringspladen, og centrifuger den i 10 sekunder. Bemærk: Undgå at lave bobler i qpcr-kvantiteringspladebrøndene. Centrifuger efter behov for at fjerne bobler. 8 Sæt 1:1000- og 1:2000-triplikaterne som målrettede prøver, og definer standarderne (punkter: 4, startkoncentration: 20 pm, fortynding: 1:10). Kør følgende program på qpcrmaskinen for at bestemme DNA-koncentrationen i det størrelsesselekterede bibliotek: Antal cyklusser Temperatur Tid 1 95 C 5 minutter 25 (ingen smeltekurve) 95 C 30 sekunder 60 C 90 sekunder (dataopsamling) 9 For at konvertere qpcr-resultatet fra pm- til nm-koncentration skal du indtaste Quantity mean (Kvantitetsgennemsnit)-resultaterne for de to biblioteksreplikater på Omixon Workbook-fanen Library Quantitation (Kvantitering af bibliotek). 10 Brug volumenerne fra arbejdsbogen til at fortynde 10 μl af det størrelsesselekterede bibliotek til en koncentration på 2 nm med sterilt H2O i et nyt 1,5 ml low bindmikrocentrifugerør. Opbevar det resterende størrelsesselekterede bibliotek ved -20 C. Sikkert stoppunkt. Biblioteker kan opbevares ved -20 C i længere tid. Hvis biblioteket skal opbevares i længere tid, anbefales rekvantificering af biblioteket kraftigt, før det køres på MiSeq. Side 35 48

36 Trin 7 Sekventering på Illumina MiSeq Varighed: ~24 timer Illumina MiSeq er et automatisk NGS-instrument, som kan sekventere det størrelsesselekterede bibliotek, der blev klargjort i de tidligere trin. Demultipleksing af de indekserede prøver udføres automatisk, når sekventeringskørslen er afsluttet. Hurtigt tip Du kan bruge en 1 % PhiX-tilsætning som yderligere kontrol til at monitorere sekventeringsreaktionen. Se Illumina-dokumentationen på PhiX-kontrollen for yderligere oplysninger. Reagensliste Element Opbevaring Leveret af Reagenspatron -20 C Illumina HT1-20 C Illumina PR2 4 C Illumina MiSeq-flowcelle 4 C Illumina Bibliotek ved 2nM 4 C Trin 6 NaOH 1 N eller 2 N 20 C til 25 C Bruger Sterilt H2O 20 C til 25 C Bruger MiSeq-reagenskitkapacitet Tid Timer Illumina MiSeqreagenskit Std 500 Cycle (MS ) Std 300 Cycle (MS ) Micro 300 Cycle (MS ) Nano 500 Cycle (MS ) Nano 300 Cycle (MS ) 24/11- prøver ~39 24 ~24 24 ~19 20 ~28 8 ~17 4 Side 36 48

37 Protokol 7.1 Præparer MiSeq i henhold til Illumina-standardprotokollerne. 7.2 Præparer et 1 nm denatureret bibliotek: Kombiner 10 μl frisk klargjort 0,2 N NaOH og 10 μl af det størrelsesselekterede bibliotek fortyndet til 2 nm i et nyt 1,5 ml low bindmikrocentrifugerør. Vortex, og centrifuger ned. Inkuber dette 1 nm denaturerede bibliotek ved rumtemperatur i 5 minutter. 7.3 Præparer et 20 pm denatureret bibliotek: Tilsæt 980 μl afkølet HT1 til 20 μl af det 1 nm denaturerede bibliotek. Vortex, og centrifuger ned. 7.4 Præparer et 9 pm denatureret bibliotek: Tilsæt 550 μl afkølet HT1 og 450 μl af det 20 nm denaturerede bibliotek til et nyt 1,5 ml low bind-mikrocentrifugerør. Vortex, og centrifuger ned. 7.5 Overfør 600 μl af det 9 pm denaturerede bibliotek til prøveindsættelsesbeholderen på MiSeq-reagenspatronen. Hurtigt tip Det tilrådes at anvende den medfølgende arbejdsbog til at oprette det prøveark, der kræves af Miseq. Side 37 48

38 Trin 8 Analyse af HLA-sekventeringsdata Illumina MiSeq behandler det poolede 9 pm bibliotek og genererer sekventeringsdata som fastqfiler. Se HLA Twin-manualen for oplysninger om korrekt installation af HLA Twin og om fortolkning af genotypeanalysen af dine sekventeringsdata. For implementering af den automatiserede protokol og problemer i forbindelse med installation eller analyse af data kontaktes support@omixon.com. Automatiseret protokol It-opsætning og -konfiguration 1. Installer HLA Twin Server på serveren. Installer HLA Twin Client på en klientcomputer der kan være flere HLA Twin-klienter, som er koblet på serveren. Kontakt Omixon Support (support@omixon.com) for oplysninger om brugerdefineret installation til automatisering. Protokol for analyse 1. Start HLA Twin Client, og log ind. 2. Dataene er allerede behandlet eller under behandling. Gennemgå resultaterne ved hjælp af trafiklyssystemet i HLA Twin. 3. Eksporter genotyperesultaterne og/eller konsensussekvenserne som ønsket. Manuel serverprotokol It-opsætning og -konfiguration Installer HLA Twin Server på serveren. Installer HLA Twin Client på en klientcomputer. Protokol for analyse Start HLA Twin Client, og log ind. Vælg MiSeq-dataene i fastq- eller fastq.gz-format, og start Holotype HLA-typebestemmelseskørslen. Når Holotype HLA-typebestemmelsen er afsluttet, gennemgås resultaterne ved hjælp af trafiklyssystemet i HLA Twin. Eksporter genotyperesultaterne og/eller konsensussekvenserne som ønsket. Side 38 48

39 Manuel desktopprotokol It-opsætning og -konfiguration Installer HLA Twin Desktop. Protokol for analyse 1 Start HLA Twin, og log ind. 2 Vælg MiSeq-dataene i fastq- eller fastq.gz-format, og start Holotype HLA-typebestemmelseskørslen. 3 Når Holotype HLA-typebestemmelsen er afsluttet, gennemgås resultaterne ved hjælp af trafiklyssystemet i HLA Twin. 4 Eksporter genotyperesultaterne og/eller konsensussekvenserne som ønsket. Side 39 48

40 Supplerende figurer Pladeeksempel på amplikonplade, fortyndingsplade, amplikonkvantiteringsplade (for et individuelt locus) og reaktionsplade Eksempel på standardkvantiteringsplade Side 40 48

41 Eksempel på KAPA qpcr-bibliotekskvantiteringsplade Side 41 48