Indflydelse af optagelsesvej og partikelstørrelse på bioakkumuleringen af sølv hos Lumbriculus variegatus

Indflydelse af optagelsesvej og partikelstørrelse på bioakkumuleringen af sølv hos Lumbriculus variegatus Udarbejdet af: Anna Brinch, Julie Zwicky Burkal, Jeppe Hjelmsted Floor & Stine Rosendal Tangaa Vejleder: Henriette Selck Bachelorprojekt (B2); Miljøbiologi ENSPAC, RUC Forår 2011

Indhold 1 Forord 4 2 Resume 5 3 Abstract 6 4 Indledning 7 5 Problemformulering 8 5.1 Uddybning af problemformulering..................... 8 6 Teoretisk baggrund 10 6.1 Nano- og mikropartikler.......................... 10 6.2 Sølv..................................... 12 6.2.1 Toksicitet af sølv.......................... 12 6.2.2 Toksicitet af nano- og mikrosølv.................. 13 6.2.3 Sølvs skæbne i sediment...................... 14 6.3 Bioakkumulering.............................. 15 6.4 Optag af sølvnanopartikler......................... 16 6.5 Lumbriculus variegatus........................... 17 6.6 AAS Atomabsorptionsspektrofotometri................. 19 7 Materiale og metode 20 8 Datavurdering 27 9 Resultater 28 9.1 Sedimentkoncentrationer.......................... 28 9.2 Generelle observationer........................... 29 9.3 Undersøgelse af vækst........................... 29 9.4 Vægt på dag 0 for alle orm......................... 30 9.5 Indflydelse af sølvform på vækst...................... 30 9.6 Indflydelse af sølvform og tid på vækst.................. 30 9.7 Sølvakkumulering i L. variegatus..................... 31 9.8 Indflydelse af optagelsesvej (aktiv vs. passiv dag 5)........... 32 9.9 Indflydelse af tid (dag 5 og 15)....................... 34 9.10 Indflydelse af tid og sølvform på udskillelse................ 35 2

10 Diskussion 37 10.1 Måleusikkerheder.............................. 37 10.2 Sølvformer generelt............................. 37 10.3 Vægtresultater................................ 38 10.4 Sølvoptag.................................. 40 11 Konklusion 44 12 Perspektivering optimering af forsøgsdesign 45 Litteratur 48 13 Appendiks 54 13.1 Appendiks 1: Forsøgsdata......................... 54 13.2 Appendiks 2: Spiking af sediment..................... 55 13.3 Appendiks 3: Tørvægt/vådvægtsforhold og karbonindhold i sedimentet 58 13.4 Appendiks 4: AAS forberedelse af prøver................ 59 13.5 Appendiks 5: Kulturforhold for Lumbriculus variegatus......... 62 13.6 Appendiks 6: Pilotforsøg.......................... 64 14 Appendiks 7: Rådata 69 3

1 Forord Denne rapport er den afsluttende del af vores bachelormodul på Miljøbiologi, Institut for Miljø, Samfund og Rumlig Forandring (ENSPAC), Roskilde Universitet. Vi vil gerne rette en stor tak til vores vejleder Henriette Selck (Lektor, ENSPAC, Roskilde Universitet), for kyndig vejledning og engagement gennem hele processen. Hendes inputs og idéer har været uundværlige for vores projekt. Ligeledes vil vi gerne takke Linus Malmquist (Ph.D. studerende, ENSPAC, Roskilde Universitet) for hjælp og vejledning, især i forbindelse med laboratoriearbejdet og opstilling af kulturer. Derudover vil vi gerne takke: Anja Holden Damsholt (Laboratorietekniker, ENSPAC, Roskilde Universitet) for meget dedikeret hjælp i forbindelse med AAS-målinger. Anne Grete Winding (Laboratorieassistent, ENSPAC, Roskilde Universitet) for stor hjælp med klargøring- og spiking af sediment, samt AAS målinger. Yi Cong (Ph.D. studerende, ENSPAC, Roskilde Universitet) for hjælp i forbindelse med forberedelse af sølv til spiking. Gary Thomas Banta (Lektor, ENSPAC, Roskilde Universitet) for hjælp med vores statistiske analyser. Nanna Hartmann, Susanne Kruse & Signe Qualmann (Institut for vand og miljøteknologi, Danmarks Tekniske Universitet) for at donere en del af deres kultur af L.variegatus til os, samt vejledning i håndteringen af disse. Martin M. Larsen (QA Koordinator, Danmarks Miljøundersøgelser, Afdeling for Marin Økologi, Roskilde) for at tage tid ud af sin kalender til at måle en del af vores prøver på ICP-MS. Vi er meget taknemmelige for alles hjælp med tilblivelsen af dette projekt. 4

2 Resume Stigende anvendelse af nanosølvpartikler i den industrielle produktion medfører, at sølv i højere grad udledes til de akvatiske miljøer. Her vil de efter udledning ophobes i sedimentfasen, hvorved sedimentlevende organismer eksponeres. I dette projekt undersøger vi forskellen i akkumuleringen af sølv tilsat sediment på hhv. nano- (NP), mikro- (MP) og ionform (Ag + ) i den sedimentlevende oligochæt Lumbriculus variegatus (Müller). Vi finder at Ag MP tilsat sediment har en marginalt signifikant større effekt på akkumuleringsfaktoren (AF) end hhv. Ag + (p=0,046) og Ag NP tilsat sediment (p=0,071) efter 5 dage, men at denne effekt ikke er signifikant efter 15 dage. Vi undersøger desuden, hvorvidt optagevej (hhv. over tarmepithel og overfladeepithel) har indflydelse på bioakkumuleringen. Vores resultater viser, at der er ikke forskel i optaget over overflade- og tarmepithel. Derudover undersøger vi, hvorvidt optaget afhænger af eksponeringstiden, samt i hvilken udstrækning L. variegatus er i stand til at udskille de tre sølvformer efter endt eksponering. Vi finder, at tid ikke har en effekt på optag. I udskillelsesforsøget ses der en effekt af tid på hhv. kropsbyrde (p=0,001) og AF (p=0,023), da begge falder med tid, men denne effekt er ikke afhængig af sølvformen tilsat sedimentet. Til slut undersøger vi, hvorvidt eksponering af sølv tilsat sediment som NP, MP og Ag + påvirker væksten hos L. variegatus, samt om eksponeringstid har en indflydelse herpå. Vi finder en signifikant effekt af tid på væksten hos L. variegatus fra dag 0 til 15 (p=0,002), og at denne effekt ikke er afhængig af, hvilken form sølv er tilført sedimentet på. Dermed viser vores resultater, at Ag MP tilsat sediment muligvis er mere optageligt for L. variegatus. Vores forsøg indikerer derudover, at L. variegatus optager lige meget sølv uanset optagelsesvej, hvilket betyder at sølvs skæbne i både vand- og sedimentfasen er vigtig i forbindelse med udledning til et akvatisk miljø. 5

3 Abstract An increasing use of nano silver particles in industrial production leads to a higher degree of silver discharged into the aquatic environment. Here it will accumulate in the sediment phase, whereby sedimentfeeding organisms are exposed. In this project we investigate the difference in the accumulation of silver added to sediment as nano- (NP), micro-(mp) and ions (Ag + ) respectively in the sediment oligochæt Lumbriculus variegatus (Müller). We find that Ag MP added to sediment has a marginally significant greater effect on the accumulation factor (AF) than when silver is added to sediment as Ag + (p=0.046) and Ag NP(p=0.071) respectively, but this effect is not significant after 15 days. We also examine whether the route of uptake (gut epithelia and surface epithelia) has an influence on bioaccumulation. Our results show that there is no difference in the uptake via surface and gut epithelia. In addition, we investigate whether the uptake is dependent on exposure time and the extent to which L. variegatus are able to secrete the three silver forms after exposure. We find that time has no effect on uptake. The excretion experiment shows that there is an effect of time on body burden (p=0.001) and AF (p=0.023), since both decrease with time, but this effect is not dependent on the form of which silver was added to the sediment. Finally, we investigate whether exposure of silver added to sediment as NP, MP and Ag + affect the growth of L. variegatus, and if the time of exposure has an influence on this. We find a significant effect of time on the growth of L. variegatus from day 0 to 15 (p=0.002) and that this effect is not dependent on the form of which silver is added to the sediment. Thus, our findings suggest that Ag MP added to sediment may be accumulated to a greater extend by L. variegatus. In addition, our studies indicate that L. variegatus accumulates the same amount of silver regardless of the route of uptake, which means that silver s fate in both water and sediment phase is important during release to an aquatic environment. 6

4 Indledning Sølv har gennem tiden været anvendt i mange forskellige sammenhænge, blandt andet i forbindelse med fotografi, smykker og elektronik (Luoma, 2008; Chen & Schluesener, 2008),men det er især sølvs antibakterielle egenskaber, som giver stoffets dets store nytteværdi (Chen & Schluesener, 2008; Fabrega et al., 2011). Netop på grund af denne antibakterielle egenskab, er der gennem de seneste år set en stigende interesse for sølv og dets anvendelse inden for nanoteknologi (Luoma, 2008; Krysanov et al., 2009). Fordelen ved at benytte nanopartikler frem for større partikler af samme materiale er, at nanopartiklerne har en lille masse og volumen i forhold til overfladeareal, hvilket giver dem langt flere egenskaber (Nel et al., 2006; Wijnhoven et al., 2009). Nanosølv er blandt andet hyppigt anvendt inden for medicinalindustrien, men det findes også i en lang række forbrugerprodukter såsom elektronik, kosmetik og tekstiler (Wijnhoven et al., 2009; EPA, 2010). I 2010 var der omkring 1300 produkter på markedet, som indeholdt nanopartikler, og af disse indeholdt omkring 300 produkter sølvnanopartikler. Dette gør sølv til det hyppigst anvendte nanomateriale i forbrugerprodukter, og det forventes at disse tal fortsat vil stige (PEN, 2011). Grundet øget brug af sølv og nanosølv i industrien, er de miljømæssige konsekvenser ved anvendelsen af sølv også af voksende interesse. Den naturlige koncentration af sølv i miljøet er normalt lav, men menneskelige aktiviteter har bidraget til at øge denne koncentration, eksempelvis gennem udledning fra vandrensningsanlæg til det akvatiske miljø (Ratte, 1999). Koncentrationen af sølv i det akvatiske miljø ligger mellem 0,03 og 500 ng/l (Luoma, 2008). Det er vist, at hvis koncentrationen af sølv i vandfasen ligger mellem 25 og 100 ng/l vil koncentrationen af sølv i sedimentet samme sted være mellem 0, 5 10µg/g tørvægt (Luoma, 2008). Når sølv udledes til miljøet, vil hovedparten forblive i jorden ved udledningskilden eller i slammet fra rensningsanlæggene. Den resterende del vil enten transporteres via luften eller udledes direkte til det akvatiske miljø (WHO, 2002). I det akvatiske miljø vil sølv typisk binde sig til partikler i vandfasen, for dernæst at synke til bunds og adsorberes i sedimentet (Call et al., 2006; Luoma, 2008). Sølv vil ved udledning opføre sig forskelligt, afhængigt af flere faktorer, hvor blandt andet iltforhold og tilgængelige partikler i sedimentet spiller en stor rolle (ASTSDR, 1990). Forekomsten af sølv i sedimentet bevirker, at en lang række bentiske organismer eksponeres for sølv, dels gennem indtagelsen af sedimentpartikler via deres fødesøgningsstrategi, dels gennem overfladeoptag fra det omgivende porevand (Ratte, 1999). Toksicite- 7

ten af sølv varierer i forhold til, hvilken organisme der eksponeres, men også afhængigt af sølvform. Det skyldes, at toksiciteten menes at afhænge af tilgængeligheden af aktive, frie sølvioner (Ratte, 1999; Call et al., 2006; Wijnhoven et al., 2009). Studier har vist, at koncentrationen af biotilgængelige, frie sølvioner i miljøet generelt er for lav til at udgøre en risiko for de organismer der lever her (Luoma, 2008). Nanosølv har her mulighed for at udgøre en større risiko, da nanosølv på grund af anderledes fysiske og kemiske egenskaber har vist sig, at have et større potentiale til at udlede frie aktive sølvioner og på den måde være mere toksiske (Miao et al., 2009; Wijnhoven et al., 2009). Det er derfor vigtigt at undersøge hvorvidt sølv på nanoform optages og bioakkumuleres i større grad end sølv på eksempelvis ionform, da dette vil medføre en højere toksicitet af netop nanosølv. 5 Problemformulering Afhænger bioakkumuleringen af sedimentassocieret sølv i den ferskvandslevende oligochæt Lumbriculus variegatus Müller af formen (hhv. nano, mikro- og ionform) hvorpå sølv tilføres sedimentet og har optagelsesvejen (overfladeepithel vs. tarmepithel) betydning for denne akkumulering? 5.1 Uddybning af problemformulering I dette projekt ønsker vi at undersøge, hvorvidt optagelsen af sølv hænger sammen med den størrelse, hvorpå metallet tilsættes sedimentet, samt om forskellige optagelsesveje har indflydelse på mængden af sølv der bioakkumuleres. Der vil specielt være fokus på om nanosølvs skæbne i sedimentet tillader det at blive bioakkumuleret i højere grad end det er tilfældet for sølv på mikro- og ionform. Dette gøres via et eksponeringsforsøg med den sedimentlevende organisme L. variegatus, som eksponeres for sediment spiket med sølvpartikler på henholdsvis nano-, mikro- og ionform. Koncentrationen af sedimentassocieret sølv vil være den samme for alle tre sølvformer, således at optaget af sølv kan sammenlignes udelukkende på baggrund af formen (partikelstørrelsen) sølv tilsættes på. Undersøgelsen af optagelsesvejene for sølv foregår ved to forskellige forsøgsopstillinger, af fem dages varighed: Én hvor L. variegatus får mulighed for aktivt at optage metallet gennem føde over tarmepitelet, samt passivt gennem porevand over overfladeepitelet. 8

Én hvor L. variegatus udelukkende optager sølv passivt over overfladeepithelet, hvilket sikres ved at L. variegatus inden forsøgsstart deles med skalpel, hvorefter kun haledelen bliver eksponeret. Vi vil ligeledes undersøge hvorvidt tid har betydning for bioakkumulering og udskillelse af sølv i de tre grupper. Dette gøres ved at køre et sideløbende forsøg, hvor L. variegatus udsættes for samme sedimentassocierede sølv som i forsøget med optagelsesveje. Dette gøres ved to forskellige forsøgsopstillinger: Én hvor L. variegatus får mulighed for både at optage metallet gennem føde over tarmepitelet, samt gennem porevand over overfladeepitelet i en periode på 15 dage. Én hvor L. variegatus modtager samme behandling som ovenstående, men overføres til rent sediment på dag 15, og derefter får mulighed for at udskille i 6 dage. Når vi gennem rapporten bruger begreberne aktivt optag eller aktive gruppe refererer vi til den gruppe af organismer der forud forsøget ikke er blevet skåret over, og dermed er i stand til at optage sølv over både tarmepithel og overfladeepithel. Begreberne passive gruppe eller de passive refererer til den gruppe af organismer der umiddelbart inden forsøgets start er blevet delt, og hvor kun haledelen er brugt i forsøget, og de derfor ikke er i stand til at indtage føde. Til sidst skal det nævnes, at der ved sølvform eller form menes formen, hvorpå sølv er tilsat sedimentet. 9

6 Teoretisk baggrund 6.1 Nano- og mikropartikler Nanomaterialer kan være kube- eller kugleformede, optræde som aflange rør eller stave, findes som overflader eller mangesidede partikler, se figur 1 (Chen & Schluesener, 2008). Fælles for dem alle er, at de er karakteriseret ved at have minimum én dimension i størrelsesordenen 1-100 nm (Borm et al., 2006; Miao et al., 2009; EPA, 2010). For at kunne karakteriseres som en nanopartikel, skal alle tre dimensioner af objektet rangere mellem 1-100 nm (Luoma, 2008). Figur 1: Forskellige strukturer af nanomaterialer: a) nanooverflade, b) kugleformet, c) rør/stave. (Pedersen & Nielsen, 2007) Grundet deres lille størrelse og dermed store overfladeareal i forhold til volumen, menes nanopartikler at være meget reaktive og mobile (Nel et al., 2006; Baun et al., 2008; Chen & Schluesener, 2008; Miao et al., 2009; Wijnhoven et al., 2009), hvilket muligvis medfører, at de kan bevæge sig over cellemembraner (Borm et al., 2006; Krysanov et al., 2009; Baun & Hartmann, 2010). Deres store overfladeareal i forhold til masse øger sandsynligheden for at atomerne befinder sig på overfladen (Cha et al., 2008), hvilket menes at bidrage til nanopartiklernes unikke kemiske, biologiske og fysisk-kemiske egenskaber (Nel et al., 2006; Cha et al., 2008; Miao et al., 2009; Wijnhoven et al., 2009) Studier har vist, at de specifikke egenskaber som karakteriserer nanopartikler, ændres når disse kommer i kontakt med et givent medie som eksempelvis ferskvand eller sediment (Krysanov et al., 2009; EPA, 2010). Nanopartiklerne kan aggregere eller agglomerere, hvorved der dannes klynger af partikler (Franklin et al., 2007). Aggregater er defineret som stærkt bundne partikler, der tilsammen udgør en helhed, mens agglomerater er defineret som mere løst bundne partikler, der er let adskillige og ofte deler sig til aggregater under behandling og anvendelse (Borm et al., 2006). Forskellen på enkelte nanopartikler og de aggregater/agglomerater der dannes, er primært deres størrelse, da aggregater og agglomerater, er større end de enkelte partikler. Dette med- 10

fører en ændring i både opførsel og specifik koncentration af det givne materiale (Borm et al., 2006). Derudover medfører aggregering, at en stigende mængde af nanopartikler i et akvatisk miljø vil bundfældes og dermed ende i sedimentet (Fabrega et al., 2011). Hvilke faktorer, der er afgørende for aggregering og agglomerering i en given opløsning, er endnu uklart (Gilbert et al., 2007), men nogle af de faktorer, der spiller ind, er ph og overfladeladning (Franklin et al., 2007; Gilbert et al., 2007; Baun et al., 2008). Ved lav ph bliver de frie binding sites på nanopartiklen optaget af frie protoner, hvilket forhindrer agglomerering og aggregering (Subramaniam et al., 1999). Ligeledes vil partikler med ens ladning frastøde hinanden og dermed ikke samles i bundter (Gilbert et al., 2007). Raten for agglomerering er højere i sediment end i akvatisk medie (Krysanov et al., 2009), og den generelle opfattelse er, at aggegrater er mindre skadelige end enkelte nanopartikler (EPA, 2010). Mikropartikler er partikler med en størrelse på mikroskala, det vil sige alt fra 100 nm til flere mikrometer i minimum én dimension (Desai et al., 1996). De oftest anvendte mikropartikler har en størrelse på 2 3, 5 µm (Kim et al., 2008) og kan, ligesom nanopartikler, findes i flere forskellige former med forskellige egenskaber. Det er blandt andet påvist at større, sfæriske sølvmikropartikler er meget hydrofile, mens blomsterlignende sølvmikropartikler er mere hydrofobe (Song et al., 2007). Dette kan meget vel have indflydelse på partiklernes biotilgængelighed og toksicitet i forskellige akvatiske miljøer, da meget hydrofile partikler vil befinde sig i vandfasen, mens meget hydrofobe partikler vil søge mod sedimentfasen. Den generelle opfattelse er, at mikropartikler besidder de samme kvaliteter som nanopartikler, men at nanopartikler, grundet deres mindre størrelse, muligvis besidder en bredere vifte af egenskaber (Desai et al., 1996). 6.2 Sølv Sølv har gennem tiden haft stor menneskelig og samfundsmæssig nytteværdi, på grund af sine anti-bakterielle, -fungi og -virale effekter, som blandt andet har været udnyttet i forbindelse med lagring af fødevarer samt i medicinsk øjemed (EPA, 2010; Eisler, 1996). I miljøet forekommer sølv naturligt blandt andet som årer i forskellige bjergarter, som frigives når klipperne eroderes af vejret (Wijnhoven et al., 2009; Panyala et al., 2008). Dertil kommer menneskeskabte udledninger af sølv, såsom ved udvinding, afbrænding af fossile brændstoffer og spildevand fra en lang række industrier (Wijnhoven et al., 2009). I naturen optræder sølv på flere forskellige former, hvoraf de hyppigst forekomne er metallisk sølv, sølvsalte (hvor sølv optræder på ionform), sølvkomplekser og kolloidt sølv (Panyala et al., 2008). Sølv er et metal i gruppe 11 i det periodiske system og har derfor en enkelt valenselektron i sin yderste skal. Fælles 11

for metallerne i denne gruppe er, at de alle er i stand til at afgive op til tre elektroner og dermed optræde i fire forskellige oxidationstrin. For sølv er oxidationstrinene: Ag 0, Ag 1+, Ag 2+ og Ag 3+ (Andersen & Mønsted, 2006; ASTSDR, 1990). Metallisk sølv er uopløseligt i vand, men når sølvsalte, såsom sølvnitrat og sølvklorid dannes, vil disse være vandopløselige (WHO, 2002). Frie sølvioner optræder hyppigst som monovalente ioner i miljøet, eftersom Ag +2 og Ag +3 er forholdsvis ustabile i det akvatiske miljø (Smith & Carson, 1977, citeret i (WHO, 2002)). 6.2.1 Toksicitet af sølv Når sølv findes på ionform er det efter kviksølv, det mest toksiske metal for akvatiske organismer (Luoma, 2008), hvilket er illustreret på figur 2. Figur 2: Toksicitet af forskellige metaller på ionform, fra mest til mindst toksisk (Luoma, 2008) Dette stemmer også overens med et forsøg udført af (Penttinen et al., 2008), hvor toksiciteten af kobber, cadmium, bly og chrom undersøges i L. variegatus og samme toksicitetsrækkefølge observeres. Den toksiske effekt af sølv er størst, når det optræder som biotilgængelige sølvioner (Luoma, 2008; Call et al., 2006; Ratte, 1999). Ratte (1999) har eksempelvis gennem sin research fundet frem til at toksiciteten i højere grad er relateret til den anvendte sølvform end til den totale koncentration af sølv. Sølv har tendens til at danne komplekser, typisk med klorider og sulfater adsorberet til partikler i vandfasen (ASTSDR, 1990; Luoma, 2008), når det udledes til miljøet. Denne tendens er med til at nedsætte de miljømæssige risici ved udledningen af sølv, fordi disse sølvholdige komplekser ser ud til at være mindre biotilgængelige og have lavere toksicitet end sølv på ionform. For eksempel vil sølv i et anoxisk miljø binde sig til svovl og danne stærke komplekser, der er fundet meget lidt toksiske (Newman, 2010; Luoma, 2008). Hvorvidt sådanne reaktioner også vil have indflydelse på toksiciteten af nanosølv, er endnu ikke klarlagt. Til gengæld ser sølv ud til at bibeholde sin høje toksicitet overfor bakterier, uanset om det er sølv på metallisk-, ion- eller nanoform (Luoma, 2008). 12

6.2.2 Toksicitet af nano- og mikrosølv Toksiciteten og biotilgængeligheden af nanopartikler, og i særdeleshed sølvnanopartikler, afhænger både af størrelse, aggregering og miljømæssige forhold. Nanopartiklernes overfladeegenskaber, reaktivitet og biotilgængelighed vil ændre sig alt efter hvordan de er fremstillet, samt til hvilket miljø de udledes (EPA, 2010). Det menes, at sølvnanopartikler afgiver sølvioner når de udledes til det akvatiske miljø (Miao et al., 2009), samt at toksiciteten af sølvnanopartikler afhænger af mængden af sølvioner, der frigives ved kontakt med vand (Wijnhoven et al., 2009; EPA, 2010). Én sølvnanopartikel indeholder 20-25.000 sølvatomer (Chen & Schluesener, 2008), og det kan derfor ikke udelukkes, at sølvnanopartikler er mere toksiske end metallisk sølv, da de sandsynligvis kan afgive flere frie sølvioner pr. enhed (Wijnhoven et al., 2009). Det er bevist, både in vitro og in vivo, at sølv, og især sølv på nanoform, er giftigt for både terrestriske og akvatiske organismer (Lee et al., 2007; EPA, 2010; Griffit et al., 2008). Lee et al. (2007) påviste via et in vivo forsøg med embryoner fra zebrafisk, at toksiciteten af sølvnanopartikler steg med stigende koncentration. Det menes derudover, at sølvnanopartikler er i stand til at reagere med thiol-grupper i celleproteiner og enzymer, hvilket kan medføre en nedsætning af den naturlige forsvarsmekanisme mod dannelsen af reaktive oxygentyper (ROS) i cellen (Nel et al., 2006; Miao et al., 2009). Dette kan medføre, at en mindre mængde ROS omdannes til oxygen (Lesser, 2006) og ROS vil dermed akkumuleres i organismen, hvilket kan resultere i celledød (Chen & Schluesener, 2008). Det menes, at sølvnanopartikler besidder de samme egenskaber som sølvmikropartikler, men at nanopartikler, i kraft af deres mindre størrelse, har flere egenskaber (Desai et al., 1996; Karlsson et al., 2009). Eksempelvis har Cha et al. (2008) påvist, at sølvnanopartikler i højere grad inducerer apoptose i leverceller fra mus end sølvmikropartikler, hvilket kan indikere at sølv på nanoform er mere toksisk end sølvmikropartikler. Griffit et al. (2008) har desuden udført et forsøg med en række akvatiske organismer (zebrafisk, dafnier og alger), hvor det blev undersøgt hvordan toksiciteten af metalliske nanopartikler heriblandt sølvnanopartikler afhang af partikelkompositionen og arten, der eksponeres. Her blev det observeret, at sølv, sammen med kobber, var de mest toksiske nanometaller for de anvendte forsøgsorganismer. Forsøgsresultaterne indikerede desuden, at mere end 90 % af nanosølvet blev transporteret væk fra vandsøjlen i løbet af de første 48 timer efter spiking. 6.2.3 Sølvs skæbne i sediment Når sølv udledes til naturligt sediment kan der opstå en række reaktioner, som ændrer biotilgængeligheden og toksiciteten af sølv (Yoo et al., 2004). Disse reaktioner er 13

bestemt af det organiske indhold (Yoo et al., 2004; Luoma & Rainbow, 2008), mængden af tilgængelige sulfider (Yoo et al., 2004), samt iltforhold i sedimentet (Luoma & Rainbow, 2008). I et oxisk miljø vil jernoxider og magnesiumoxider danne stærke ligander med høj affinitet for metaller (Luoma, 2008). Metaller i sedimentet vil da binde sig til disse ligander og dermed ikke være bioltilgængelige for de sedimentlevende organismer (Luoma & Rainbow, 2008). Organisk materiale har en evne til at isolere metaller og dermed gøre dem mindre tilgængelige for optag (Luoma & Rainbow, 2008). Hvorvidt et metal sætter sig på organisk materiale eller på de tilgængelige oxider, varierer fra metal til metal. For eksempel har Cu 2+ en stærkere affinitet overfor organisk materiale end Co 2+, hvor Co +2 har en højere affinitet for magnesiumoxider end Cu 2+ (Luoma & Rainbow, 2008). Under anoxiske forhold er mængden af Acid Volatile Sulfides (AVS) i sedimentet en vigtig faktor for biotilgængeligheden af sølv (Berry et al., 1999; Yoo et al., 2004; Luoma & Rainbow, 2008). AVS er beskrevet som den mængde sulfider, der er i stand til at binde sig til de metaller, der befinder sig i sedimentet (De jonge et al., 2010). Metaller i komplekser med AVS menes ikke at være biotilgængelige (Yoo et al., 2004; Luoma & Rainbow, 2008). Den pulje metaller der er i stand til at sætte sig på de tilstedeværende sulfider, menes, sammen med AVS, at spille en vigtig rolle for toksiciteten i sedimentet (Yoo et al., 2004; De jonge et al., 2010). For sølv gælder det, at 1 mol sulfid kan binde 2 mol sølv (Yoo et al., 2004). Således vil sølv ikke have toksiske effekter, medmindre mængden af sølv er mere end 2 gange større end mængden af AVS, da sølv i mindre mængder end dette, ikke vil danne biotilgængelige komplekser. Dog har undersøgelser vist at oligochæten Tubifex tubifex (Müller) er i stand til at bioakkumulere små mængder sølv, selvom forholdet mellem sølv og AVS har været mindre (De jonge et al., 2010). Det tyder altså på, at høje mængder AVS i sedimentet kan nedsætte bioakkumuleringen af en metallisk kontaminant, men ikke fjerne den helt. Processen hvor metaller binder sig til AVS er en reversibel proces, så hvis eksempelvis AVS-bundet sølv udsættes for ilt, vil sølvet frigives fra AVS og i stedet binde sig til de førnævnte oxider. Formen hvorpå sølv er bundet i sedimentet, er altså også afhængig af de aktuelle iltforhold (Luoma & Rainbow, 2008). 14

6.3 Bioakkumulering Følgende afsnit er skrevet ud fra (Spacie & Hamelink, 1985) med mindre andet er angivet. Når man skal vurdere den kemiske eksponering for en organisme i et forurenet miljø kan bioakkumulering være en god indikator heraf (Luoma & Rainbow, 2005). Bioakkumulation er ophobning af kontaminanter i organisk væv og biomagnifikation er, når dette foregår op igennem de trofiske niveauer i fødekæden (Ratte, 1999). Når graden af bioakkumulering skal beskrives, benyttes en række begreber såsom biokoncentrationsfaktoren (BCF) og bioakkumuleringsfaktoren (BAF). BCF er en værdi der beskriver koncentrationen af en kontaminant i en organisme i forhold til koncentrationen i vandfasen og er primært baseret på laboratorieforsøg. BAF beskriver en given kontaminants evne til at akkumulere i en given organisme og anvendes primært i feltstudier hvor man ikke kan kontrollere eksponeringsvejen. BAF beregnes som forholdet mellem koncentrationen i organismen og koncentrationen i dens omgivelser (vand eller føde). Et andet relevant begreb er biota-sediment akkumuleringsfaktoren (BSAF), der anvendes som forsøgsparameter når bioakkumulering af sedimentbindende organiske kontaminanter skal undersøges. Den beskriver forholdet mellem koncentrationen af et organisk stof i det organiske materiale i sedimentet og koncentrationen i vævet i organismen (Beckingham & Ghosh, 2010). Optag i organismen kan ske ad forskellige veje (Ratte, 1999). De fleste stoffer optages ved passiv diffusion over semipermeable membraner eksempelvis i fordøjelseskanalen (Ratte, 1999). Raten hvormed et stof diffunderer over en membran afhænger blandt andet af koncentrationsgradienter, samt af forskellige fysiske faktorer såsom overfladeareal, membrantykkelse, kontaminantens størrelse og polaritet. Ved adsorption, bindes stoffet til overfladen ved hjælp af enten kovalente, elektrostatiske eller molekylære kræfter, og dette vil som regel være et af de første skridt i en bioakkumuleringsproces. Adsorption har kun en lokal effekt, da partiklerne ikke nødvendigvis kommer ind i organismen, hvilket betyder at adsorptionen ikke bidrager direkte til toksiciteten af en kontaminant. Forskellige processer kan have indflydelse på både biotilgængeligheden og bioakkumuleringsraten af et givent stof eller metal. Adsorption af kontaminanter til sedimentet er en af disse processer, som medfører at upolære stoffer vil binde sig i den organiske del af sedimentet, hvorved optag af kontaminanten fra vandfasen reduceres. Organismer, der indtager sediment som fødestrategi, vil dermed være ekstra tilbøjelige til at optage upolære kontaminanter fra sedimentfasen (Rainbow et al., 2009). 15

6.4 Optag af sølvnanopartikler Cellulært optag af nanopartikler afhænger af fysisk-kemiske egenskaber, såsom partikelstørrelse, partikelform, molekylærvægt og overfladespænding (Nam et al., 2009). Derudover afhænger optagelsen af nanopartikler i celler også af deres overfladeegenskaber, da studier har vist, at partikler med en upolær overflade i højere grad optages end partikler med en polær overflade (Nam et al., 2009). Nanopartikler kan optages i celler via forskellige mekanismer (Nam et al., 2009; Geiser et al., 2005; Lee et al., 2007), blandt andet via endocytose (Karlsson et al., 2009; Singh et al., 2007). Endocytose er en proces hvor plasmamembranen indkapsler ekstracellulært materiale i vesikler, hvorved det optages i cellen (Nam et al., 2009). Observationen af frie partikler på begge sider af cellemembranen, tyder imidlertid på, at cellulært optag af nanopartikler også sker gennem andre mekanismer (Karlsson et al., 2009) heriblandt adhæsion (Geiser et al., 2005) og diffusion (Lee et al., 2007; Geiser et al., 2005). Når sølvnanopatikler først er optaget i cellen, kan de bidrage til at ændre cellemembranens egenskaber, og derved forårsage skader i cellen. I et forsøg med E. coli, groet på agarplader tilsat sølvnanopartikler, er det påvist, at nanosølv kan ændre permeabiliteten af cellemembranen så den ikke længere er i stand til at regulere transporten ind og ud af cellen (Sondi & Salopek-Sondi, 2004). Derudover er det vist, at sølvnanopartikler er i stand til at reagere med DNA og påvirke essentielle processer i bakterier, herunder respiration og celledeling og til sidst forårsage celledød (Morones et al., 2005). Cytotoksiciteten af sølvnanopartikler har vist sig at hænge sammen med patikelstørrelsen. (Liu et al., 2010) har i et forsøg, hvor fire modeller for humane celler eksponeres for tre forskellige størrelser sølvnanopatikler (hhv. 5, 20 og 50 nm) vist, at den mindste partikelstørrelse var mest toksisk for cellen. Eftersom sølvpartiklens størrelse kan have indflydelse på raten for frigivelsen af sølvioner, konkluderes det, at det er mængden af disse ioner, der afgør toksiciteten af nanosølvpartikler for cellen (Liu et al., 2010). Optag i organismen kan også ske via fødevejen, hvilket blandt andet ses hos L. variegatus, der indtager partikler fra sedimentfasen uden selektiv regulering. Optag af partikler kan derudover ske passivt gennem det omsluttende medie og porevand (Hartmann, 2011). Generelt menes det, at optag af nanopartikler i sedimentlevende organismer højst sandsynligt foregår over tarmepithelet (Klaine et al., 2008; Hartmann, 2011), hvorefter translokation af nanopartiklerne til andre steder i organismen er mulig (Rosenkranz et al., 2009). Alt optag kræver dog transport af partikler over cellemembranen, eventuelt via adhæsion eller ved ødelæggelse af denne (cell membrane disruption) (Hartmann, 2011). 16

6.5 Lumbriculus variegatus Lumbriculus variegatus (Oligochaeta, Lumbriculidae) er en ferskvandslevende orm, som lever i akvatiske habitater mange steder i Europa og Nordamerika (Gerhardt, 2007). L. variegatus er blandt andet fundet i små vandløb (Cook, 1984), tørvemoser (Healey, 1987), søer samt i udkanten af vandhuller (Brinkhurst & Gelder, 1991) hvor de lever i sedimentet. I naturlige populationer varierer størrelsen af L. variegatus fra 0,5 til 45 mm (Cook, 1984) med en tykkelse på 1-1,5 mm (Drewes, 1999). L. variegatus lever med hovedet nedgravet i sedimentet, mens halen forbliver i vandfasen (Penttinen et al., 1996). Hovedenden hos L. variegatus kan fysiologisk karakteriseres ved at være mere afrundet end haleenden, som modsat tynder langsomt ud og ender i en form for spids. Hoved og hale, samt den morfologiske udformning hos L. variegatus er vist på figur 3. Figur 3: Et eksemplar af L. variegatus. Hovedet ses til venstre i billedet og halen til højre. L. variegatus er en nedbryder, hvilket betyder at dens fødestrategi er at indtage sediment og optage indholdet af organisk materiale herfra. Det organiske materiale består ofte af nedbrudte dyre- og planterester, og mængden og kvaliteten af det organiske materiale kan variere meget fra én sediment type til en anden (Leppänen & Kukkonen, 1998a). Da mængden af organisk materiale er varierende, har mange sediment-ædende organismer, i særdeleshed oligo- og polychæter, specialiseret sig i at indtage meget store mængder sediment i forhold til deres størrelse, og flere af disse kan indtage sediment i en størrelsesorden svarende til deres egen kropsvægt i løbet af en enkelt dag (Lopez & Levinton, 1987). Når sedimentet er indtaget, og så meget som muligt af det organiske materiale er blevet ekstraheret, udskilles de uorganiske, samt resterne af de organiske partikler, som fækalier, der lægger sig som små, aflange korn på sediment-overfladen (Leppänen & Kukkonen, 1998a). 17

Når L. variegatus holdes i kultur reproducerer de sig udelukkende aseksuelt ved en proces kaldet architomi (Gerhardt, 2007). Flere pulserende sammentrækninger af kropsvæggen medfører en deling af organismen, således at der dannes to eller flere dele (Christensen, 1984). Hurtigt efter delingen, som sker uden blodtab, dannes der en beskyttende hinde omkring åbningen og således lukkes hver af enderne af, og ormen påbegynder dannelsen af henholdsvis nyt hoved, ny hale eller begge dele (Lesiuk & Drewes, 1999). Op til to dage før, samt under og efter delingen, standser L. variegatus sin indtagelse af føde. Indtagelsen af føde genoptages først når organismen har regenereret et fuldt udviklet hoved eller en fungerende hale (Leppänen & Kukkonen, 1998a). Det tager omkring 6-7 døgn for L. variegatus at regenerere et hoved og 2-3 døgn at regenerere en hale (Leppänen & Kukkonen, 1998c). Reproduktionen menes at være både størrelses- og temperaturafhængig, samt afhængig af fødetilgængelighed. Ormene skal have nået en vis størrelse før de begynder at dele sig (Leppänen & Kukkonen, 1998a, 1998b), og det er vist at reproduktionsraten formindskes ved meget lav temperatur, samt ved lavt indhold af føde i sedimentet (Leppänen & Kukkonen, 1998a). L. variegatus som forsøgsorganisme De akvatiske oligochæter anses for at være gode forsøgsorganismer, når bioakkumulation af forskellige miljømæssige kontaminanter skal undersøges. Det skyldes, at disse organismer, som nævnt, lever i både sediment- og vandfasen af deres habitat og således udsættes for både sedimentbundne kontaminanter gennem deres føde, samt vandopløselige kontaminanter via direkte kontakt med overfladeepithelet (Hirsch, 1998; Leppänen & Kukkonen, 1998b; Ingersoll et al., 2003; Gerhardt, 2007; Vink, 2009). De seneste år er især L. variegatus blevet anvendt i forbindelse med laboratorieforsøg (Hirsch, 1998; Ingersoll et al., 2003; Sardo et al., 2011; OECD, 2007). Årsagen til dette, udover ovenstående, er, at L. variegatus er meget nem at holde i kultur (jvf. appendiks 6), medgørlig i forbindelse med forsøg, der involverer langtidseksponering i sediment uden behov for yderligere føde, samt udviser høj tolerance overfor en lang række sedimentbunde kontaminanter, heriblandt både metaller og diverse kemikalier (Hirsch, 1998; Ingersoll et al., 2003; OECD, 2007). 18

6.6 AAS Atomabsorptionsspektrofotometri AAS benyttes til bestemmelse af mængden af forskellige kemikalier i en prøve. AAS bygger på simple principper omkring absorption af lysenergi og er specielt anvendelig til metaller (Simonsen, 1997). Alle atomer absorberer energi i form af lysfotoner, ved en specifik bølgelængde (Harris, 2010), som for sølv er 328,1 nm (Michailova & Rezepina, 1970). Når et givent atom bliver tilført en mængde energi, kan det opnå et eksciteret stadie med en højere energi. Hvis denne energi tilføres i form af lys, vil en del af dette lys blive absorberet i processen (Harris, 2010). AAS s sammenligner det lys der sendes gennem prøven, med det lys der kommer ud efter det har passeret, hvorved den absorberede mængde lys detekteres (Harris, 2010). Eftersom den absorberede mængde lys er direkte proportional med koncentrationen af metallet i prøven, kan denne beregnes herfra (Harris, 2010). Før en AAS-måling foretages, skal det undersøgte metal omdannes til ionform, hvilket sker ved at opløse det i HNO 3. Herefter tilføres opløsningen AAS-maskinen, hvorved det givne metal omdannes til atomform gennem forstøvning via flamme (Flamme atomabsorptionspektrofotometri (FAAS)) eller høj temperatur (Grafitovns- atomabsorptionspektrofotometri (GFAAS)). Den anvendte temperatur eller flammetype er specifik for det enkelte metal (Simonsen, 1997) samt afhængig af, hvor store koncentrationer der skal måles. Man bruger FAAS ved målinger af høje koncentrationer, hvor GFAAS bruges ved mere følsomme målinger, da den kan måle helt ned til ng-skalaen og derved har en lavere detektionsgrænse. 19

7 Materiale og metode Forsøget er designet så det er muligt at undersøge, hvorvidt bioakkumulering af sølv hos L. variegatus, afhænger af formen hvorpå dette tilsættes sedimentet, samt om forskellige optagelsesveje har indflydelse på denne bioakkumulering. Inspiration til forsøgsdesign kommer fra Yi Cong (Ph.D. studerende ved Roskilde Universitet, Danmark), som har udført et forsøg, hvor Nereis diversicolor blev eksponeret for sedimentassocierede sølvnanopartikler, sølvmikropartikler og sølvioner (Cong et al., 2011). Samme sølvformer og spikingsmetode er anvendt til dette forsøg. Forsøgsopstilling og eksponeringstid er designet ud fra kendskab til L. variegatus, andre forsøg udført med denne organisme (Leppänen & Kukkonen, 1998a, 1998b, 1998c; Hirsch, 1998) samt OECD-guideline 225 (2007) der beskriver hvordan sedimenteksponeringsforsøg med L. variegatus skal udføres. Derudover er forsøget designet ud fra ønsket om at undersøge, hvorvidt der er forskel på det passive og aktive sølvoptag hos L. variegatus, samt om der er forskel i udskillelsen af sølv tilsat sedimentet på forskellige former efter endt eksponering. Kulturer De i forsøget anvendte eksemplarer af L. variegatus stammer oprindeligt fra Napier University, Edinburgh, Skotland. Vi har fået ormene fra Danmarks Tekniske Universitet (DTU), Institut for vand og miljøteknologi, hvor de har været i kultur siden 2009. L. variegatus er sidenhen, i forbindelse med dette bachelorprojekt, blevet indført som kultur på Roskilde Universitet. Organismerne holdes i kultur i to 9,5 L glasakvarier, hver tilsat 5 L kunstigt ferskvandsmedie (0,118 g/l MgSO 4 7H 2 O, 0,096 g/l NaHCO 3, 0,004 g/l KCl og 0,06 g/l CaSO 4 2H 2 O i MilliQ vand (18.2 Ω, Millipore), se appendiks 5 for eksakt opskrift), samt ublegede papirservietter klippet i strimler. Kulturene opbevares ved 17 C i 24 timers lys og iltes via luftpumpe, gennem silikoneslanger, partikelfilter (0,2 µm PTFE Acrodisc CR) og pasteurpipette af glas. Mediet skiftes en gang om ugen, hvor kulturene samtidigt får tilført 0,5-0,7 g fint mortet TetraMin R fiskefoder. Pilotforsøg I perioden d. 17.-24. marts 2011 udførtes et pilotforsøg med L. variegatus med henblik på, at undersøge regenereringstiden af henholdsvis hoved og hale, hos orme, udsat for manipuleret opdeling med skalpel. De opdelte orme blev observeret indtil haleenderne havde dannet et hoved, og de igen var i stand til at æde og fordøje. Samtidig blev L. variegatus undervejs undersøgt i stereolup for at følge udviklingen af det nye hoved, samt for at lære mere om dens generelle morfologi. Resultatet af pilotforsøget viste, 20

at L. variegatus var i stand til at æde og fordøje igen inden for 6 døgn. Pilotforsøget forefindes i appendiks 6. Endeligt forsøg gennemgang af forsøgsmetode Synkronisering af orme 17 dage inden forsøgsopstart udtages 357 forholdsvis store eksemplarer af L. variegatus fra de to kulturer. Ormene opdeles med skalpel og overføres til et nyt 9,5 L glasakvarium indeholdende 5 L medie og nye papirstrimler. Dette akvarium står under samme forhold som kulturene i syv dage, hvor de på syvendedagen får tilført 0,7 g TetraMin R og derefter står i yderligere 10 dage inden de er synkroniserede og klar til forsøget. Klargøring af sediment Til forsøget anvendes ukontamineret sediment indhentet ved Munkholmbroen ved Holbæk i september/oktober 2010. Sedimentet sigtes til <250 µm med demineraliseret vand og står i 48 timer for at bundfælde. Efter 48 timer hældes overfladevandet forsigtigt fra og 15 L kunstigt ferskvandsmedie tilsættes, hvorefter sediment og medie blandes grundigt. Sedimentet står efterfølgende i 24 timer for endnu en gang at bundfælde. Efter 24 timer hældes overfladevandet fra og sedimentet er klar til brug. Der udtages 5 prøver til måling af baggrundskoncentrationen af sølv i sedimentet, som bestemmes vha. AAS (GFAAS, GTA 120, Varian, Australia). Derudover udtages 6 prøver til bestemmelse af tørvægt/vådvægtforholdet (dw/ww) og mængden af organisk materiale i sedimentet. Baggrundskoncentration De 5 prøver overføres til petriskåle, overdækkes med parafilm med lufthuller og frysetørres i 24 timer inden brug. Herefter afvejes 0,3 g tørt sediment fra hver prøve, og dette overføres til 5 teflonrør. Den eksakte vægt noteres, da denne anvendes til at beregne koncentrationen af sølv i prøven. Der tilføres 1,5 ml MilliQvand, samt 1,5 ml HNO 3 til 6 teflonrør, hvoraf de 5 indeholder det afvejede sediment og den sidste anvendes som blank. Den blanke benyttes som reference i forhold til de sølvkoncentrationer der måles på GFAAS. De 6 teflonrør omrystes forsigtigt og der tilføres låg. Herefter stilles de 6 rør i den dertilhørende karrusel, fastgøres og sættes i mikroovn (6 min 250 W, 6 min 400 W, 6 min 650 W, 6 min 250 W ). Efter endt program, afkøles de 6 rør i ca. 25 min. Herefter flyttes de til stinkskab, hvor der meget forsigtigt tilføres 7,5 ml NH 4 OH til alle 6 rør. Til sidst overføres opløsningerne, gennem filter, til 6 stk. 25 ml volumetriske flasker og omrystes grundigt. Koncentrationen i opløsningerne måles nu på GFAAS, som bygger på princippet omkring absorption af lys. For mere detaljeret beskrivelse af GFAAS, samt klargøring af prøver, se appendiks 4. 21

Baggrundskoncentrationen af sølv er under detektionsgrænsen for den anvendte AAS og vi antager derfor, at vi kan sætte startkoncentrationen af sølv i sedimentet til < 2 µg/g dw. Indhold af organisk materiale og bestemmelse af dw/ww De 6 prøver af vådt sediment afvejes, overføres til digler og sættes i varmeskab ved 105 C i 24 timer. Herefter bestemmes dw/ww forholdet. Dernæst sættes de 6 prøver i muffelovn ved 550 C i 2 timer, hvorefter indholdet af organisk materiale bestemmes. Beregninger til bestemmelse af dw/ww forholdet og indholdet af organisk materiale kan findes i appendiks 3. Dw/ww forholdet i det anvendte sediment er 0,75 og indholdet af organisk materiale i sedimentet er 0,55 %. Spiking af sediment Sedimentet opdeles i fire grupper: en kontrolgruppe, en nanosølvgruppe (Ag NP), en mikrosølvgruppe (Ag MP) og en sølviongruppe (Ag + ). Sølvnitrat anvendes til den sidstnævnte gruppe, da det i opløsning dissocierer til ionerne Ag + og NO 3. Vi ønsker en nominel sølvkoncentration i alle tre grupper på 400 µg Ag/g dw sediment og der skal derfor tilsættes ca. 0,5 g sølv til hver gruppe. Der afvejes hhv. 0,5021 g Ag NP, 0,5022 g Ag MP og 0,7095 g AgNO 3, hvor den afvejede mængde AgNO 3 svarer til ca. 0,5 g Ag +. Ag NP opløses i 335 ml demineraliseret vand og ultralydssonikeres i 15 min. efterfulgt af 15 min. pause. I alt sonikeres Ag NP i 2 timer. Ag MP opløses i 335 ml demineraliseret vand i konisk kolbe. Blandingen omrøres på magnetomrører i ca. 2 timer. AgNO 3 opløses i en lille mængde 65 % HNO 3 og blandes herefter med 335 ml demineraliseret vand. Herefter overføres alle 335 ml Ag-opløsninger til ca. 1675 g vådt sediment, så vi efter spiking har tre forskellige sedimentgrupper, med den samme vægt men med forskellige sølvformer. Derudover afvejes 1256,3 g vådt sediment til kontrolgruppen. Til dette sediment tilføres 251,3 ml demineraliseret vand, således at vand/sediment forholdet er ens for alle fire grupper. Sedimentet omrøres herefter grundigt ved håndkraft i ca. 30 min., hvorefter det opbevares i 24 timer under samme forhold som kulturene. Herefter er det spikede sediment, samt kontrolsedimentet klar til brug. Den konkrete spikingsmetode, kategorisering af anvendte sølvpartikler, samt udregninger kan findes i appendiks 2. 22

Aktuel koncentration i spiket sediment Der udtages 9 prøver til måling af den aktuelle sølvkoncentration i de tre spikede sedimentgrupper; 3 fra hver sølvgruppe. Prøverne (ca. 5 mg ww) overføres til petriskåle og frysetørres i 24 timer. Samme generelle metode som beskrevet for baggrundskoncentrationen i sedimentet, er anvendt til måling af sølvkoncentrationen i det spikede sediment. Dog tilføres der her 6,25 ml MilliQvand, samt 6,25 ml HNO 3 til hvert teflonrør inden kørsel i mikroovn. Efter kørsel og afkøling tilføres 30 ml NH 4 OH til hvert teflonrør og opløsningerne overføres til 100 ml volumetriske flasker. Herefter måles sølvkoncentrationen i de 9 prøver ved FAAS (GFAAS, SpectrAA-220, Varian, Australia). Efter 24 timer overføres det spikede sediment, samt kontrolsedimentet, til 250 ml bægerglas (n=60) som derefter tilsættes ferskvandsmedie, se figur 4 nedenfor for anvendt mængde sediment og medie. Der tilføres ikke føde til sedimentet under forsøgsperioden. Figur 4: Mængden af sediment og medie der er tilført hvert bægerglas, indenfor hver eksponeringsgruppe inden forsøgsopstart. Forsøg Der anvendes i alt 300 orme, der puljes i grupper af 5 orme. Der benyttes 48 bægerglas indeholdende spiket sediment, 16 med henholdsvis Ag NP, Ag MP og AgNO 3, samt 12 bægerglas med rent sediment, der fungerer som kontrolgruppe. Vi har valgt at køre tre sideløbende forsøg: ét hvor vi undersøger den passive og aktive optagelse af sølv hos L. variegatus over 5 dage, ét hvor vi undersøger optaget af sølv over 15 dage og et udskillelsesforsøg hvor L. variegatus først optager sølv aktivt i 15 dage og dernæst går 6 dage i rent sediment. Antallet af dage for den passive eksponering er bestemt på baggrund af vores pilotforsøg, hvor vi påviste at det, under vores forsøgsbetingelser, tager 6 døgn for L. variegatus at regenerere et nyt hoved efter opdeling med skalpel. Ved en eksponeringstid på 5 dage, er vi dermed sikre på at de passive orme ikke kan indtage sedimentpartikler og dermed kun optager sølv over overfladeepithelet. Forberedelse Ved forsøgets opstart (dag 0) udtages 300 af de synkroniserede orme fra akvariet. Der udtages orme til undersøgelse af henholdsvis aktivt og passivt optag samtidig og i 23

tilfældig rækkefølge. Til undersøgelse af aktivt optag puljes 220 orme tilfældigt i afvejede petriskåle med fem orme i hver. Herefter afvejes hver pulje, hvorved ormenes vådvægt bestemmes, og der tages billede gennem stereolup (Olympus SZ61, med et Olympus Altra 20 kamera), med billedredigeringsprogrammet Cell D. Herefter overføres ormene forsigtigt til bægerglas indeholdende sediment og medie i de forhold vist i figur 4. Til undersøgelse af passivt optag overføres 60 orme til et bægerglas med medie. Her bliver de taget op enkeltvis, overført til en petriskål og skåret over med skalpel, inden haleenderne puljes á fem styk, afvejes og fotograferes i stereolup som beskrevet ovenfor. Hoveddelene bliver ført tilbage til kulturene. Dernæst overføres haledelene forsigtigt til bægerglas indeholdende sediment og medie i de forhold vist i figur 4. De i alt 60 bægerglas overdækkes med parafilm, forsynes med ilt gennem silikoneslanger og pipettespidser tilknyttet en kraftig luftpumpe. Bægerglassene fordeles tilfældigt i klimarummet, hvor de står under samme forhold som kulturene. Lufttilførslen til bægrene kontrolleres hver anden dag. Se figur 5 og 6 for forsøgsopstilling. Figur 5: Ilt-fordelingen, som den var sat op til alle 60 bægerglas. Her ses 5 bægerglas, placeret tilfældigt i klimarummet, som er tilkoblet en kraftig lutfpumpe via plastslange og en luftfordeler. Til alle afvejninger under forsøgsperioden benyttes samme vægt (Mettler AE200). Det skyldes at ormenes biomasser er så små, at benyttelsen af forskellige vægte vil kunne have indflydelse på det endelige vægtresultat. Aktivt/passivt optag over 5 dage Efter 5 dages eksponering udtages alle 5-dagesorme både de aktive og passive fra deres bægerglas, enten med engangspipette eller si. De udtagne orme overføres til petriskåle, hvor de skylles med rent medie. Herefter bestemmes ormenes vådvægt i puljerne, og ormene fotograferes ligeledes under stereolup. 24