Identifikation af aminosyre

Transkript

1 Identifikation af aminosyre Kapitel 8: Bioteknologi proteiner, DNA og bioethanol Problemstilling Aminosyrer er opløselige i vand og har syre-baseegenskaber. Et 2-aminosyremolekyle indeholder mindst én carboxylgruppe og én aminogruppe eller som zwitterion en carboxylatgruppe og en ammoniumgruppe R R 2N Ikke-ioniseret form zwitterion R betegnes aminosyrens sidegruppe, der er forskellig for hver af de tyve aminosyrer, der indgår i den genetiske kode. Aminosyrerne adskiller sig ved forskel i isoelektrisk punkt og tilbøjelighed til at vandre på en chromatografiplade. ypotese: Vi vil identificere en aminosyre blandt fire mulige ved hjælp af syre-basetitrering og tyndtlagschromatografi (TL). Teori Syre-baseteori Afhængigt af en opløsnings p forekommer en aminosyre hovedsageligt på følgende tre måder: på syreform, som en zwitterion (amfoion) eller på baseform som vist i figur 1. NR syre syreform NR zwitterion (eller amfoion), 2 NR baseform x s 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0, 0,2 0, p 2 Figur 1 Glycins bjerrumdiagram kend kemien identifikation af aminosyre 1/5 GYLDENDAL Må kun benyttes på institutioner, som har købt rettighederne til KEND KEMIEN - EKSPERIMENTER

2 NR er en dihydronsyre, når R ikke indeholder en ammoniumgruppe eller en carboxylgruppe. Ved titrering med stærk base sker følgende reaktion indtil første ækvivalenspunkt NR(aq) O (aq) NR (aq) 2 O(l) (I) Ved fortsat titrering mod andet ækvivalenspunkt forløber følgende reaktion: NR (aq) O (aq) 2 NR (aq) 2 O(l) (II) En aminosyres isoelektriske punkt, pi, er den p-værdi af en opløsning, hvor nettoladningen af aminosyren er nul. Netop ved første ækvivalenspunkt forekommer aminosyren som zwitterion. Dvs. vi kan bestemme aminosyrens pi som p i dette punkt. Teoretisk beregnes pi som middelværdien af syreformens pk s ( ) og zwitterionens pk s ( N ) pi = (pk s ( ) pk s ( N 4 )) Tyndtlagschromatografi hromatografi er omtalt i Kend Kemien 1, side 4. Vi vil udføre en analyse af fire forskellige aminosyrer med tyndtlagschromatografi. TL udføres også professionelt i mindre omfang og udmærker sig ved at være en meget følsom metode. De opløste stoffer i blandingen, der analyseres, har mulighed for at binde sig til den stationære fase (en kappe af vand bundet til cellulose på TL-pladen) og til den mobile fase. I TL er den mobile fase en blanding af væsker, der ved kapillarvirkning trækkes op igennem den stationære fase. Jo mere tilbøjeligt et stof er til at binde sig til den stationære fase, jo langsommere føres det med af den mobile fase. Derved sker adskillelsen. Vandringslængden af prøvens komponenter måles relativt i forhold til væskefrontens vandring (betegnet R f -værdier). Identifikationen er afhængig af, at man har et kendt referencestof, der har samme R f, som ens ukendte stof. Man kan dog ikke udelukke, at to forskellige stoffer har samme R f -værdi. For at bestemme længden af aminosyrernes vandring er det nødvendigt at lave en fremkaldelse på TL-pladen. ertil benyttes en opløsning af stoffet ninhydrin (GIFTIGT!), der danner kraftig violetfarvede forbindelser med aminosyrer. Den kemiske reaktion mellem ninhydrin og aminosyrer er velkendt, men behøver ingen omtale for at gennemføre dette forsøg. Forskellige aminosyrer giver forskellige farvenuancer, hvilket dog ikke udnyttes her. kend kemien identifikation af aminosyre 2/5 GYLDENDAL Må kun benyttes på institutioner, som har købt rettighederne til KEND KEMIEN - EKSPERIMENTER

3 Aminosyrerne vandrer ikke lige hurtigt på TL-pladen pga. deres forskellige sidekæder R. Forarbejde 1. Skriv navnene på aminosyrerne med betegnelserne Asp, Gly, ys og Val. 2. Skriv formlerne for de sidegrupper, der findes i aminosyrerne Asp, Gly, ys og Val på syreform (ved p 2).. vilken af aminosyrerne er den mest upolære blandt de fire undersøgte? 4. Overvej beliggenheden af første og andet ækvivalenspunkt, når 10,00 ml aminosyreopløsning titreres med 0,100 m natriumhydroxid. 5. Beregn den teoretiske værdi for de fire aminosyrers pi ved hjælp af formlen under syre-baseteori. Udførelse 1. Titrering p-meteret indstilles til 25 eller opløsningens temperatur og justeres ved at anbringe kombielektroden i en puffer med p = 7,00 og evt. efterfølgende i en puffer p = 4,00. Kombielektroden skylles med demineraliseret vand, og p-meteret er klar til brug. Med pipette overføres 10,00 ml aminosyreopløsning til bægerglasset med magnet. Der tilsættes så meget demineraliseret vand, at volumenet er ca. 100 ml. 0,100 m natriumhydroxid hældes i buretten, evt. luftbobler ved hanen fjernes, og bægerglasset anbringes på magnetomrøreren under buretten. Kombielektroden nedsænkes i væsken, uden at den rører bægerglasset eller den roterende magnet. Basen tildryppes forsigtigt under omrøring. Burettestand og p aflæses for hver ml tilsat base. Titrer meget forsigtigt omkring første ækvivalenspunkt på titrerkurven, 1 ml før og 1 ml efter, og aflæs p i spring på ml tilsat base. Apparatur Fælles stinkskab ovn (115 ) ninhydrin-fremkalderkar hårtørrer vert hold Syre-basetitrering p-meter med kombielektrode elektrodeholder magnetomrører med magnet bægerglas, 250 ml burette, 25 ml pipette, 10 ml hromatografi TL-plade med cellulosebelægning saks blød blyant lineal 5 udtrukket kapillærrør chromatografikar af glas med låg (glas) petriskål pincet hårtørrer Kemikalier 4 0,10 m saltsure aminosyreopløsninger. Fire kendte aminosyrer på syreform (Asp, Gly, ys og Val) 0,10 m saltsur ukendt aminosyreopløsning identisk med en af de fire ovenstående Titrering 0,100 m natriumhydroxid puffer p = 7,00 og p = 4,01 hromatografi butan-1-ol koncentreret ethansyre 0,2 % ninhydrin (GIFTIG) i propanon Sikkerhed briller handsker punktudsugning kend kemien identifikation af aminosyre /5 GYLDENDAL Må kun benyttes på institutioner, som har købt rettighederne til KEND KEMIEN - EKSPERIMENTER

4 Titreringen kan afbrydes efter første ækvivalenspunkt ved p 9. Afhængig af arbejdsfordelingen på grupperne gentages titrering med de tre øvrige kendte aminosyrer og med den ukendte aminosyre. 2. hromatografi Klargøring Løbevæsken består af: butan-1-ol, ethansyre, demineraliseret vand i volumenforholdet 60:25: ml løbevæske er passende til hele holdet. Væsken, der skal stå ca. 1 cm op i chromatografikarret, hældes i karret. Det lukkes med glasplade, så der dannes mættede dampe af løbevæske i karret. En TL-plade, som skal kunne stå på skrå i chromatografikarret, klippes ud af en større færdig plade. Med blød blyant tegnes en vandret linje på TL-pladen 1,5 cm over bunden, og fem påsætningssteder markeres. Der må ikke ridses gennem celluloselaget på pladen. Kapillarrør laves ved udtrækning af smeltepunktsrør efter opvarmning i gasflamme. Glasrørets midte varmes op til det er blødt, røret tages ud af flammen og trækkes straks ca. 5 cm ud i et tyndt kapillar med en rolig bevægelse. Det kræver øvelse! De udtrukne kapillærrør knækkes over, så der er en ca. 1,5-2,0 cm lang og 0,1 mm tyk spids. ca. 5 cm Figur 1 Udtrækning af glasrør til kapillarrør. Opvarm et smeltepunktsrør. Fjern røret fra flammen og træk. Knæk kapillarrøret, så der dannes to næste lige lange spidser. Knækkede glasstumper opsamles med det samme omhyggeligt i spand til glasaffald. Påsætning af prøver Den ukendte aminosyre og fire standarder påsættes hvert sit sted med nyt udtrukket kapillærrør, der dyppes en gang i flasken med 0,1 M opløsning. Prøvemængden er ca. 1 mikroliter, hvis der ca. 4 gange påsættes en dråbe med ca. mm bredde. Den påsatte dråbe skal tørre ind mellem hver påsætning (pust evt. på dråben). kend kemien identifikation af aminosyre 4/5 GYLDENDAL Må kun benyttes på institutioner, som har købt rettighederne til KEND KEMIEN - EKSPERIMENTER

5 hromatografering TL-pladen anbringes med pincet i karret. Låget lægges på, og chromatogrammet udvikles, indtil væskefronten er ca. 1 cm fra pladens øverste kant. Pladen tages op med pincet, og væskefronten markeres med blyant. 2,85 cm Figur 2 Eksempel på et klargjort TLplade. Gly ys Val Asp x Tørring og fremkaldelse Pladen skal være helt tør før fremkaldelse (brug evt. hårtørrer). Pladen dyppes kortvarigt i ninhydrin-opløsning i petriskål i stinkskab og tørres med hårtørrer. Brug handsker. Alle hold dypper lige efter hinanden, så opløsningsmidlet ikke når at fordampe. Pladen varmebehandles 1-2 min i ovn (115 ). Pletterne markeres med blyant (ikke kugle- eller spritpen) efterhånden som de kan ses, nogle er længe om at blive synlige. Pladerne opbevares fx i plastikchartek og kan fotokopieres. Bortskaffelse Overskydende natriumhydroxid og neutraliseret aminosyreblandinger hældes i vasken, idet der skylles grundigt med postevand. Løbevæske og andre organiske væsker hældes i dunk til organisk affald. Efterbehandling 1. Tegn titrerkurverne for titreringerne, og bestem pi for de undersøgte aminosyrer. 2. Kommenter resultaterne.. Udmål aminosyrernes R f -værdier ved analysen med TL. 4. Kommenter resultaterne. Vandrer asparaginsyre og glycin næsten lige langt? 5. vilken aminosyre mener I, der er i den ukendte prøve? kend kemien identifikation af aminosyre 5/5 GYLDENDAL Må kun benyttes på institutioner, som har købt rettighederne til KEND KEMIEN - EKSPERIMENTER