Dialyse og carbamidanalyse

Transkript

1 C.12.1 Dialyse og carbamidanalyse Formål: Ved dialyse af en vandig opløsning af proteinet albumin og det lavmolekylære stof carbamid trænes forskellige laboratorieprocedurer (afpipettering, tidtagning, termostatering, absorbansmåling, kvalitetssikring mm.) repeteres reaktionskinetik, farveteori mm. illustreres separationsprincippet, det enzymatiske, det kemiske og det fotometriske princip Mål: 1. bestemmelse af dialyseslangens permeabilitet for carbamid og albumin 2. bestemmelse af carbamidkoncentrationens indflydelse på dialysehastigheden 3. kontrol af analysens præcision og akkuratesse Teori: Dialyse Dialyse er en adskillelsesmetode, der benytter sig af, at visse membraner tillader diffusion af molekyler og ioner under en vis størrelse. Membranerne findes naturligt i kroppen, hvor der fx i nyrerne sker en udskillelse af carbamid (urinstof), mens proteinerne tilbageholdes. Membranerne fremstilles også syntetisk og anvendes bl.a. i apparatur til dialyse af nyrepatienter. Carbamidanalyse Carbamid spaltes katalyseret af urease til carbonsyre og ammoniak: (NH 2 ) 2 C (aq) + 2 H 2 (l) H 2 C 3 (aq) + 2 NH 3 (aq) Ammoniakken danner ved reaktion med hypochlorit og phenol i basisk væske et blåt indophenolfarvestof, der er slutproduktet i en 4-trins reaktion: 1. NH 3 + HCl NH 2 Cl + H 2 2. x. NH 2 Cl + H N Cl 3. N Cl H N H + + HCl

2 C N H H- N Det blå farvestof måles fotometrisk ved 620 nm. Proteinanalyse Proteiner og peptider (men ikke dipeptider eller frie aminosyrer) giver i basisk opløsning en rødviolet farve med Cu 2+. Prøven har fået navnet Biuretanalysen efter stoffet biuret: N H 2 C NH C NH2 der også giver positiv reaktion. Prøven anvendes både kvalitativt og kvantitativt. Farven skyldes kompleksbinding mellem kobberionen og 4 NH-grupper. Reagenser: Kemikalie CAS-nr. Mærkning Fareklasse R-sætninger S-sætninger Fysiologisk saltvand: NaCl, 0,9 g/100ml Dialyseblanding 1: Indeholder albumin og carbamid (75 mm) i fysiologisk saltvand Dialyseblanding 2: Indeholder albumin og carbamid (150 mm) i fysiologisk saltvand Phenolopløsning 5% Xn, C 20/21/ Hypochloritopløsning ,3% 26-36/37/39-45 (indeholder NaH 2,5%) C /39-45 Ureaseopløsning NaH 2 M C /39-45 CuS 4 -opløsning 1% (w/v) Carbamidstandard: ,00 mm Carbamidkontrol: 8,00 mm

3 C.12.3 Apparatur: Fotometer Dialyseslange Bægerglas 150 ml Måleglas Automatpipetter Saks Magnetomrører m. magnetpind Stopur/alarmur Reagensglas og propper Reagensglasstativ Vita Wrap Vandbad med termostat (Dispensor) Sikkerhed: Tilsætningen af phenolopløsning og hypocloritopløsning skal foregå i stinkskab og man skal anvende handsker til dette. Kemikalieaffald kasseres i affaldsdunken mærket Z andet affald.

4 C.12.4 Dialyse og prøveindsamling Fremgangsmåde: Grupper med ulige numre arbejder med dialyseblanding 1, grupper ned lige numre arbejder med dialyseblanding 2. Til rapporten skal der bruges resultater for begge dialyseblandinger. Aftal selv med en anden gruppe ang. udveksling af resultater på Fronter Første del først på dagen 1. Afmål 130 ml fysiologisk saltvand i et 150 ml bægerglas, læg en magnetpind i og anbring det på magnetomrøreren. 2. Et stykke dialyseslange på 20 cm klippes af rullen, gennemvædes med demineraliseret vand og lukkes med en knude i den ene ende (undgå unødig berøring af slangen). 3. Afpipetter 10,00 ml af den relevante dialyseblanding i slangen. Luk herefter den anden ende af slangen med en knude ca. 1 cm over væskeoverfladen. 4. Klip overskydende slange af. Skyl påfyldningsenden med demineraliseret vand for at fjerne evt. dialyseblanding. 5. Start magnetomrøringen, anbring forsigtigt dialyseslangen i bægerglasset og start stopuret. Noter starttidspunktet. Dæk bægerglasset med Vita Wrap for at mindske fordampning. 6. Til følgende tider udtages med automatpipetter 1,00 ml fra bægerglasset: 5, 10, 15, 20, 40 og 60 min. De afmålte væsker tømmes ud i passende mærkede små reagensglas, der efterhånden forsynes med prop. Anden del - senere på dagen: 7. Dialysen skal fortsætte så lang tid, som dagens program tillader. I forbindelse med anden øvelsesrunde, udtages den sidste prøve (1,00 ml) på samme måde som de øvrige. Husk at notere dette tidspunkt. 8. Dialyseslangen tages op og indervæsken overføres til et passende bægerglas, idet der klippes hul på slangen. 1,00 ml af indervæsken udtages og overføres til et mærket lille reagensglas, der sættes i stativet med de andre prøver. Resten af inder- og ydervæsken gemmes til proteinanalyse.

5 C.12.5 Carbamidanalyse og biuretanalyse Fremgangsmåde: Carbamidanalyse: Et passende antal store reagensglas mærkes til carbamidanalysen. Der foretages dobbeltbestemmelse på alle prøver, standard, kontrol og reagensblind. Højeste tilladte forskel på dobbeltbestemmelsernes absorbanser er 0,015. Det er acceptabelt hvis kun én dobbeltbestemmelse overstiger denne grænse. I så fald vurderes, om man skal bruge én af absorbanserne eller gennemsnittet. Hvis to eller flere dobbeltbestemmelser varierer for meget laves disse prøver om. Husk at medtage standard og reagensblind til den nye serie. Analyserne udføres ifølge nedenstående procedure, idet der naturligvis anvendes automatpipetter. I mærkede reagensglas afmåles prøver og enzym efter følgende skema: Udtagne prøver 20 µl Standard 20 µl Prøver Standard Kontrol Reagensblind Kontrol 20 µl Ureaseopløsning 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl Der mixes omhyggeligt, dækkes med alufolie og anbringes i vandbad ved 37 o C i 5 min. Glassene tages op af vandbadet og tilsættes phenol- og hypochloritopløsning efter følgende skema: Phenolopløsning 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml Hypochloritopløsning 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml Der mixes omhyggeligt efter hver reagenstilsætning. Glassene dækkes igen med alufolie og anbringes igen i vandbadet i 5 min. Glassene tages op af vandbadet og alle glas tilsættes demineraliseret vand: Demineraliseret vand 10,0 ml 10,0 ml 10,0 ml 10,0 ml Glassene vendes omhyggeligt efter tilsætningen.

6 C.12.6 Alle prøvernes og standardernes absorbanser måles på fotometer ved 620 nm over for reagensblind, hvorefter carbamidkoncentrationerne kan beregnes af formlen: Apr C pr = Cst, A st Biuretprøve: Prøven foretages både på inder- og ydervæsken. 2 ml af væsken blandes med 2 ml NaH-opløsning. Herefter tilsættes under omrystning et par dråber CuS 4 opløsning. En rødviolet farve indikerer protein.

7 C.12.7 Rapport: Standardretningslinier for rapportskrivning følges naturligvis. Det skal fremgå af rapporten, hvilken analyseserie I selv har lavet samt gruppenummer og navne på jeres samarbejdsgruppe. Af rapporten skal fremgå, hvilket af fotometrene I har anvendt (model og evt. nummer). Rapporten skal indeholde en overskuelig tabel med tid, absorbans og carbamidkoncentration for samtlige udtagne og målte prøver (også 2. dagens). Såvel enkeltresultaterne som middelværdien anføres for dobbeltbestemmelserne, og der vises et beregningseksempel. (Vurder hvad der skal i selve rapporten og hvad der skal med som bilag!) Afbild carbamidkoncentrationen som funktion af tiden for begge opløsninger i samme koordinatsystem. Beskriv og diskuter grafernes udseende. C Beregn dialysehastigheden (grafens hældning, v = ) i tidsrummet 0-5 min t og i tidsrummet min for begge forsøg. Hvorfor falder dialysehastigheden med tiden? Hvorfor er der forskel på hastigheden i de to forsøg? Beregn den teoretisk forventede koncentration af carbamid i inder- og ydervæsken. Vink: Problemet er identisk med følgende: Hvad bliver carbamidkoncentrationen, hvis ydervæsken og indervæsken blandes uden dialyse? Sammenlign og diskuter inder- og ydervæskernes carbamidkoncentrationer målt på 2. dagen. Her gøres bl.a. brug af analyseusikkerheden, der beregnes 3 punkter længere nede. Anfør og diskuter resultatet af biuretprøverne (hvad kan I udlede)? Hvorfor er indophenolforbindelsen fra carbamidanalysen farvet? Brug dobbeltbestemmelserne til at beregne analyseusikkerheden på en carbamidkoncentrationsbestemmelse (både et enkeltresultat og gennemsnittet af en dobbeltbestemmelse). Indfør kontrollens værdi i kontrolkortet, som hører til det anvendte fotometer. Vedlæg en kopi af kontrolkortet. Brug måleresultaterne på kontrolkortet til at beregne dag-til-dag analyseusikkerheden. Vurder ved hjælp af kontrolkortet carbamidanalysens præcision og akkuratesse i den optegnede periode. Afgør ved hjælp af en passende test (p = 0,05), om analysen er behæftet med systematisk fejl (dvs. om akkuratessen er tilfredsstillende) i den optegnede periode. Generelt: Vurder selv, hvor i rapporten de enkelte punkters besvarelser skal placeres.