Bestillingsoplysninger AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 Tests P/N: Specimen Preparation Kit ART: US: 83267

Transkript

1 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosistest MTB TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. Bestillingsoplysninger AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 Tests P/N: Specimen Preparation Kit ART: US: AMPLICOR M. tuberculosis MTB CTL 10 Sets P/N: Positive Control Kit ART: US: AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP 96 Tests P/N: Amplification Kit ART: US: COBAS AMPLICOR MTB DK 100 Tests P/N: M. tuberculosis Detection Kit ART: US: COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: Detection Reagents Kit ART: US: COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: Conjugate Detection Reagent ART: US: COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: Wash Buffer ART: US: Nedenstående kit kan bruges til detektion af Mycobacterium-intern kontrol, der er amplificeret ved hjælp af AMPLICOR Mycobacterium Amplification Kit. Detektion af intern kontrol er valgfrit for brugeren. COBAS AMPLICOR IC DK 100 Tests P/N: Internal Control Detection Kit ART: US: /2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 1/30 P/N:

2 Tilsigtet brug COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis (MTB)-testen er en kvalitativ in vitro-diagnosticering til bestemmelse af M. tuberculosis i kliniske prøver. Testen anvender nukleinsyreamplifikationsmetoden PCR (Polymerase Chain Reaction) og nukleinsyrehybridisering til detektion af M. tuberculosis i opløste, dekontaminerede og koncentrerede humane luftvejsprøver, herunder ekspektorerede og inducerede sputum, bronkiale skylninger og BAL (bronkoalveolær lavage). Oversigt over og forklaring af testen Principper for proceduren Mykobakterier er syrefaste, ikke-motile, stavformede, aerobe bakterier, der ikke danner sporer. De indeholder flere arter, der er sygdomsfremkaldende for mennesker. Mange mykobakterielle arter er jord- og vandsaprofytter. De primære humane patogener er arter af Mycobacterium tuberculosis-komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum og M. microti) og M. leprae. M. tuberculosis er det vigtigste mykobakterielle patogen. M. tuberculosis findes kun hos mennesker, der er bærere af denne bakterie og overfører tuberkelbacillien fra menneske til menneske ved dråbeinfektion. Ca. en tredjedel af jordens befolkning har M. tuberculosis i kroppen og er i fare for at udvikle sygdommen. Alene i USA skønnes der at være 15 millioner mennesker, der allerede er inficeret med tuberkel-bacillien, og der registreres årligt over tilfælde af sygdommen tuberkulose 1. M. tuberculosis kan forårsage kroniske lungesygdomme, men kan ligeledes inficere alle andre af kroppens organer. På grund af risikoen for spredning af sygdommen, den potentielle mulighed for forekomsten af stammer, der er resistente over for medicin, og alvorligheden af sygdommen hos patienter, der er smittet med HIV-1, er en hurtig diagnose af M. tuberculosis-komplekset særdeles vigtig. På verdensplan er tuberkulose skyld i 3 millioner dødsfald hvert år, og 26% af de dødsfald, der kunne undgås, blandt voksne i udviklingslandene 1-5. Isolationen af en organisme fra M. tuberculosis-komplekset er nødvendig for med sikkerhed at kunne diagnosticere tuberkulose. Rutinedyrkninger er tidskrævende og kan tage op til otte uger, før en endelig diagnose kan stilles. Mikroskopisk undersøgelse af syrefaste udstrygninger er den hurtigste metode til detektion af mykobakterier, men den er ikke-følsom og non-specifik. De immunologiske og serologiske metoder er begrænsede, hovedsageligt på grund af ringe sensitivitet og/eller specificitet 6,7. Analysen af mykoliske azider fra mykobakterier ved væskekromatografi med høj funktionsevne er et nyttig hjælpemiddel til dyrkning og biokemiske test 8. Artsspecifikke nukleinsyreprober har forbedret muligheden for en hurtig bekræftelse af resultatet af dyrkninger betragteligt for flere mykobakterielle arter 9. Det er påvist, at udviklingen af PCR-baserede tests, der er specifikke for mykobakterier, har gjort det endnu hurtigere at diagnosticere tuberkulose ved at give mulighed for direkte detektion af mykobakterier i kliniske prøver COBAS AMPLICOR MTB-testen er baseret på fire hovedprocesser: prøveforberedelse, PCR-amplifikation 23,24 af mål-dna ved hjælp af biotinylerede primere, hybridisering af de amplificerede produkter til oligonukleotide prober, der er specifikke for målet/målene, samt detektion af de probe-bundne, amplificerede 2/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

3 Mycobacterium tuberculosis Test produkter ved farvedannelse. COBAS AMPLICOR MTB-testen tillader samtidig amplifikation af mål-dna i M. tuberculosis-komplekset og Mycobacterium-intern kontrol-dna. Master Mix-reagenset indeholder to primere, der er specifikke for MTB og Mycobacterium-intern kontrol. Detektionen af det amplificerede Mycobacterium-intern kontrol-dna kan udføres, når brugeren vælger det. Prøveforberedelse NALC-NaOH 25, NaOH 25 eller SDS-NaOH 26,27 -opløste, -dekontaminerede og -koncentrerede humane luftvejsprøver, herunder ekspektorerede og inducerede sputum, bronkiale skylninger og BAL (bronchial alveolar lavages), vaskes med Respiratory Specimen Wash Solution (vaskeopløsning til luftvejsprøver). Organismerne lyseres ved inkubation i Respiratory Specimen Lysis Reagent (lysisreagens til luftvejsprøven), og prøven forberedes til amplifikation ved tilsætning af luftvejsprøveneutraliseringsreagens. PCR-amplifikation Valg af mål Udvælgelsen af en mål-dna-sekvens afhænger af identifikationen af områder i det mykobakterielle genome med den højeste sekvenskonservering blandt arterne i M. tuberculosis-komplekset. Dermed er udvælgelsen af primere og probe afgørende for testens evne til at detektere alle organismerne i M. tuberculosis-komplekset. Mycobacterium-genomet indeholder et område på ca nukleotider, der koder for genet 16S rrna. COBAS AMPLICOR MTB-testen anvender de Mycobacterium-genspecifikke biotinylerede primere, KY18 og KY75, til at definere en sekvens på ca. 584 nukleotider i dette område. 28, 29,30 Målamplifikation Behandlede prøver tilsættes amplifikationsblandingen i amplifikationsrørene (A-rør), hvori PCR reaktionen foregår. Reaktionsblandingen opvarmes for at adskille den dobbeltstrengede DNA-helix og vise primerens målsekvenser. Når blandingen afkøler, binder de biotinylerede primerer, KY18 og KY75, til mål-dna et. Ved tilstedeværelsen af Mg 2+ og overskydende deoxynukleosid trifosfater (dntp er), herunder deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytocin og deoxyuridin (i stedet for deoxythymidin) trifosfater, forlænger den termostabile Thermus aquaticus DNA-polymerase (Taq-polymerase) de bundne primere langs målskabelonerne for at producere en DNA-sekvens med betegnelsen amplicon. COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplicon-dna fordobles for hver cyklus. Intern kontrol-amplifikation I enzymbaserede amplifikationprocesser, f.eks. PCR, kan effektiviteten reduceres af de inhibitorer, der kan være i den kliniske prøve. Der er tilsat Mycobacteriumintern kontrol i COBAS AMPLICOR MTB-testen for at muliggøre identifikation af behandlede prøver, der indeholder stoffer, som kan påvirke PCRamplifikationen. Mycobacterium -intern kontrol er et DNA-plasmid med primerbindingsregioner, der er identiske med dem i MTB-mål-DNA-sekvensen, en randomiseret intern sekvens, der har samme længde og basesammensætning som MTB-målsekvensen, samt en unik probebindingsregion, der adskiller Mycobacterium-intern kontrol-ampliconet fra målampliconet. Disse funktioner er valgt for at sikre en ensartet amplifikation af Mycobacterium-intern kontrolog MTB-mål-DNA. Mycobacterium-intern kontrol tilsættes hver enkelt amplifikationreaktion og co-amplificeres med mål-dna fra den kliniske prøve. Detektionen af den MTB-intern kontrol kan udføres, når brugeren vælger det. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 3/30

4 Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af mål-dna fra den kliniske prøve i COBAS AMPLICOR MTB-testen opnås ved hjælp af AmpErase LD (uracil-nglycosylase)-enzym 31. AmpErase LD-enzymet er renset for at fjerne potentielt kontaminerende bakteriel DNA. AmpErase LD-enzymet registrerer og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplicon som følge af brugen af deoxyuridin trifosfat i stedet for deoxythymidin trifosfat som en af dntp erne i Master Mix-reagenset. Derfor er det kun amplicon, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør forurenende amplicon modtagelig for nedbrydning med AmpErase LD-enzym før amplifikationen af mål-dna et. AmpErase LDenzymet katalyserer spaltningen af deoxyuridin-holdigt DNA ved deoxyuridinresidues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus ved basisk ph i Master Mix brækker ampliconets DNAkæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA et ikke amplificeres. AmpErase LD-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges mål-ampliconet ikke. Efter amplifikation denatureres resterende enzym ved at tilsætte denatureringsopløsningen, hvilket forhindrer nedbrydningen af mål-ampliconer. Det er påvist, at AmpErase LDenzym i COBAS AMPLICOR MTB-testen deaktiverer mindst 10 3 kopier af deoxyuridin-holdigt MTB-amplicon pr. PCR. Hybridiseringsreaktion Efter PCR-amplifikation tilsætter COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet automatisk denatureringsopløsning til A-røret for kemisk at denaturere MTBampliconet og Mycobacterium-intern kontrol-ampliconet. Dervet dannes enkeltstrenget DNA. Aliquots af denatureret amplicon overføres derefter til detektionskopper (D-kopper). En opløsning af magnetiske partikler, der er belagt med en oligonukleotid detektionsprobe, som er specifik for M. tuberculosiskomplekset (KY172T3) eller Mycobacterium-intern kontrol (SK535), tilsættes til de enkelte D-kopper. Det biotin-mærkede MTB og Mycobacterium-inter kontrolampliconet hybridiseres til den målspecifikke oligonukleotidprobe, der er bundet til de magnetiske partikler. Denne hybridisering af ampliconet til den målspecifikke probe øger den samlede specificitet for testen. Detektionsreaktion Efter hybridiseringsreaktionen skyller COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet de magnetiske partikler i D-kopperne for at fjerne ubundet materiale og tilsætter derefter avidin/horseradish-peroxidasekonjugat. Avidin/horseradishperoxidasekonjugatet bindes til det biotin-mærkede amplicon, der er hybridiseret af de målspecifikke oligonukleotid-detektionsprober, der er bundet til de magnetiske partikler. COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet fjerner ubundet konjugat ved at skylle de magnetiske partikler og tilsætter derefter en substratopløsning, der indeholder brintoverilte og 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) i hver D-kop. Ved tilstedeværelsen af brintoverilte katalyserer den partikelbundne horseradish-peroxidase oxideringen af TMB og derved dannes et farvekompleks, for hvilket der måles absorbans ved hjælp af COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet ved en bølgelængde på 660 nm. 4/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

5 Mycobacterium tuberculosis Test Reagenser AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 test P/N: Specimen Preparation Kit ART: AMPLICOR forberedelseskit til luftvejsprøve US: RW (Vaskeopløsning til luftvejsprøve) Tris-HCl-buffer < 1% emulgator EDTA 0,05% natriumazid RL (Lysisreagens til luftvejsprøve) 0,2% natriumhydroxid < 1% emulgator EDTA 0,05% natriumazid RN (Luftvejsprøveneutraliseringsreagens) Tris-HCl-buffer Magnesiumklorid 0,05% natriumazid 2 x 25 ml 3 x 6 ml 2 x 5 ml AMPLICOR M. tuberculosis MTB CTL 10 sæts P/N: Positive Control Kit ART: AMPLICOR M. tuberculosis positiv kontrolkit US: MTB (+) C [M. tuberculosis (+)-kontrol] Tris-HCl-buffer < 0,001% ikke-smitsom plasmid-dna (mikrobiel) indeholdende M. tuberculosis-sekvenser < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid 10 x 0,75 ml AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP 96 test P/N: Amplification Kit ART: AMPLICOR Mycobacterium amplifikationskit US: MYCO MMX (Mycobacterium Master Mix) Tris-HCl-buffer Glycerol < 0,01% AmpliTaq (Taq DNA-polymerase, mikrobiel) < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% KY18- og KY75-primere, biotinyleret 0,05% natriumazid 3 x 1,7 ml 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 5/30

6 AmpErase LD-enzym (Lav DNA-uracil-N-glycosylase) Tris-HCl-buffer < 0,01% Uracil N-glycosylase (mikrobiel) EDTA dithiothreitol glycerol < 1% emulgator natriumklorid 0,05% natriumazid 3 x 0,1 ml MYCO IC 3 x 0,1 ml (Mycobacterium-intern kontrol) Tris-HCl-buffer < 0,001% ikke-smitsom plasmid-dna (mikrobiel) indeholdende Mycobacterium-sekvenser, der er identiske med MTB-mål-DNA, og en unik probebindingsregion. < 0,005% poly ra RNA (syntetisk) EDTA Amaranth-farve 0,05% natriumazid MYCO ( ) C [Mycobacterium ( )-kontrol] Tris-HCl-buffer < 0,005% poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid 1 x 0,75 ml COBAS AMPLICOR MTB DK 100 test P/N: M. tuberculosis Detection Kit ART: COBAS AMPLICOR M. tuberculosis detektionskit US: MT PS1 1 x 100 test (MTB probeopløsning 1) MES-buffer < 0,3% opløsning af Dynabeads (paramagnetiske partikler), der er belagt med MTB-specifik oligonukleotid-opfangningsprobe (KY172T3) 0,09% natriumazid MT4 (MTB probeopløsning 2) Natriumfosfatbuffer 29,9% natriumthiocyanat natriumklorid < 0,2% emulgator 1 x 100 test + Xn 29,9% (w/w) natriumthiocyanat Sundhedsskadelig 6/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

7 Mycobacterium tuberculosis Test COBAS AMPLICOR DK 100 test P/N: Detection Reagents Kit ART: COBAS AMPLICOR detektionsreagenskit US: DN4 (Denatureringsopløsning) 1,6% natriumhydroxid EDTA Thymolblå 1 x 100 test + Xi 1,6% (w/w) natriumhydroxid Lokalirriterende CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) Tris-HCl-buffer < 0,001% Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat serumalbumin fra kvæg (fra pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Phenol 1% ProClin 150-konserveringsmiddel SB3 (Substrat A) Citratopløsning 0,01% brintoverilte 0,1% ProClin 150-konserveringsmiddel SB (Substrat B) 0,1% 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) 40% dimethylformamid (DMF) 1 x 100 test 5 x 75 test 5 x 5 ml T 40% (w/w) dimethylformamid (DMF) Giftig R: 61-20/21-36 Kan skade barnet under graviditeten. Farlig ved indånding og ved hudkontakt. Irriterer øjnene. S: Undgå enhver kontakt - indhent særlige anvisninger før brug. Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående lægebehandling nødvendig; vis etiketten, hvis det er muligt. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 7/30

8 COBAS AMPLICOR CN4 200 test P/N: Conjugate Detection Reagent ART: COBAS AMPLICOR konjugat-detektionsreagens US: CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) Tris-HCl-buffer < 0,001% Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat serumalbumin fra kvæg (fra pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Phenol 1% ProClin 150-konserveringsmiddel 2 x 100 test COBAS AMPLICOR WB 500 test P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: WB (10X-skyllekoncentrat) < 2% fosfatbuffer < 9% natriumklorid EDTA < 2% rensemiddel 0,5% ProClin 300-konserveringsmiddel 2 x 250 test Advarsler og forholdsregler Til in vitro-diagnosticering. Denne test må kun bruges med opløste, dekontaminerede og koncentrerede humane luftvejsprøver, herunder ekspektorerede og inducerede sputum, bronkiale skylninger og BAL, der er opløst, dekontamineret og koncentreret med metoderne NALC-NaOH 25, NaOH 25 eller SDS-NaOH 26,27. Undgå at pipettere med munden. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend engangsbeskyttelseshandsker, kitler og sikkerhedsbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. Undgå bakteriekontaminering af reagenser, når der fjernes aliquoter fra reagensflaskerne. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og pipettespidser. Reagenser fra forskellige lot eller fra forskellige flasker fra det samme lot må ikke blandes sammen. Reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. Et kit må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Du kan rekvirere MSDS er (Material Safety Data Sheets) hos din lokale Roche-forhandler. 8/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

9 Mycobacterium tuberculosis Test Arbejdsgangen i laboratoriet skal være envejs, idet der startes i preamplifikationsområdet og fortsættes i post-amplifikationsområdet (amplifikation/ detektion). Pre-amplifikationsaktiviteterne skal starte med klargøring af reagenser og fortsætte med klargøring af prøver. Beholdninger og udstyr skal være specielt beregnet til pre-amplifikationsaktiviteten og må ikke bruges til andre aktiviteter eller flyttes mellem områder. Der skal bæres handsker i hvert enkelt område, og de skal skiftes, før området forlades. Udstyr og beholdninger, der bruges til forberedelse af reagenser, må ikke bruges til forberedelse af prøver eller til pipettering eller behandling af amplificeret DNA eller andre mål-dna kilder. Beholdninger og udstyr til post-amplifikation skal altid bibeholdes i postamplifikationsområdet. Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med laboratoriesikkerhedsprocedurer som dem, der er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 32 og i CLSI-dokument M29-A3 33. Rengør alle arbejdsoverflader grundigt med en passende desinficerende opløsning. RW, RL, RN, MYCO MMX, AmpErase LD-enzym, MYCO IC, MTB (+) C, MYCO ( ) C og MT PS1 indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazid-holdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. Brug beskyttelsesbriller, kitler og engangshandsker ved håndtering af RW, RL, RN, MYCO MMX, MT4, DN4, CN4, SB3, SB og arbejdssubstrat (blanding af reagenserne SB3 og SB). Undgå, at hud, øjne og slimhinder kommer i kontakt med disse materialer. Hvis der opstår kontakt, skal du straks skylle med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis det ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal du fortynde med vand, før de tørres op. Undgå kontakt mellem hud eller slimhinder og SB eller arbejdssubstratet. Hvis der opstår hudkontakt, skal du straks skylle med store mængder vand. SB og arbejdssubstratet indeholder dimethylformamid, der er rapporteret som giftigt ved høje orale doser og kan virke fosterskadende. Undgå hudkontakt, indånding af dampe samt indtagelse. Hvis der opstår hudkontakt, skal du vaske grundigt med vand og sæbe samt straks søge læge. Der skal bruges rør med skruelåg til forberedelse af prøver og kontroller for at undgå prøvestænk og potentiel krydskontaminering af prøver. Brug ikke rør med snaplukning. Krav til opbevaring og håndtering Reagenser må ikke nedfryses. RW, RL og RN opbevares ved 2-25 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. MYCO MMX, AmpErase LD-enzym og MYCO IC opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. Arbejds- Master Mix (forberedes ved tilsætning af AmpErase LD-enzym og MYCO IC til MYCO MMX) skal opbevares ved 2-8 C og kan holde sig i 4 uger. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 9/30

10 Medfølgende materialer MTB (+) C og MYCO ( ) C opbevares ved 2-8 C. Disse reagenser kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. MT PS1 og MT4 opbevares ved 2-8 C. Disse reagenser kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Når først MT PS1 og MT4 er blandet, kan arbejdsreagensen holde sig i 30 dage ved 2-8 C. Arbejdsreagenset kan anvendes i højst seks instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. DN4 opbevares ved 2-25 C. DN4 kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning kan DN4 holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. DN4 kan anvendes i højst seks instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. CN4 opbevares ved 2-8 C. CN4 kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning kan CN4 holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. CN4 kan anvendes i højst seks instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. SB3 og SB opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. Der skal forberedes arbejdssubstrat hver dag ved blanding af SB3 med SB. Arbejdssubstrat kan holde sig i 16 timer på COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. Udsæt ikke SB3, SB eller arbejdssubstrat for metaller, oxideringsmidler eller direkte lys. WB opbevares ved 2-30 C. WB kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Undersøg WB, og opvarm ved C for at opløse evt. bundfald igen, hvis det er nødvendigt. Arbejdsvaskebuffer (1X), der er forberedt ved fortynding af WB med destilleret eller demineraliseret vand, skal opbevares ved 2-25 C i COBAS AMPLICOR -vaskebufferreservoiret og kan holde sig i 2 uger fra forberedelsesdatoen. Detektionsreagenser, der ikke er helt opbrugt, skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentkørsler. Kontroller udløbsdatoen på åbnede reagenser eller arbejdsreagenser, før de indsættes i COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. AMPLICOR Respiratory RSP PREP P/N: Specimen Preparation Kit ART: AMPLICOR forberedelseskit til luftvejsprøve US: RW (Vaskeopløsning til luftvejsprøve) RL (Lysisreagens til luftvejsprøve) RN (Luftvejsprøveneutraliseringsreagens) AMPLICOR M. tuberculosis MYCO CTL P/N: Positive Control Kit ART: AMPLICOR M. tuberculosis positiv kontrolkit US: MTB (+) C [M. tuberculosis (+)-kontrol] 10/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

11 Mycobacterium tuberculosis Test AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP P/N: Amplification Kit ART: AMPLICOR Mycobacterium amplifikationskit US: MYCO MMX (Mycobacterium Master Mix) AmpErase LD-enzym (Lav DNA-uracil-N-glycosylase) MYCO IC (Mycobacterium-intern kontrol) MYCO ( ) C [Mycobacterium ( )-kontrol] COBAS AMPLICOR MTB DK P/N: M. tuberculosis Detection Kit ART: COBAS AMPLICOR M. tuberculosis detektionskit US: MT PS1 (MTB probeopløsning 1) MT4 (MTB probeopløsning 2) COBAS AMPLICOR DK P/N: Detection Reagents Kit ART: COBAS AMPLICOR detektionsreagenskit US: DN4 (Denatureringsopløsning) CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: Conjugate Detection Reagent ART: COBAS AMPLICOR konjugat-detektionsreagens US: CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) COBAS AMPLICOR WB P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: WB 10X-skyllekoncentrat 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 11/30

12 Nødvendige, men ikke medfølgende materialer Pre-amplifikation - Reagensforberedelsesområdet - COBAS AMPLICOR -A-ring monteret med 12 A-rør - Holder til COBAS AMPLICOR -A-ring - Eppendorf Multipette -pipette med 1,25 ml Combitip -reservoir (steril, enkeltpakket) - Pipetter (100 μl kapacitet)* med aerosolfilter eller stempelspidser - Engangshandsker, uden pulver Pre-amplifikation - Prøve- og kontrolklargøringsområde - 1,5 ml polypropylen-rør med skruelåg, sterile, ikke-silikoniseret, konisk (Sarstedt eller tilsvarende)** - Glasrack (Sarstedt eller tilsvarende) - Sterile overførselspipetter med lille spids - Pipetter (kapacitet 50 μl, 100 μl, 400 μl, 500 μl og 1000 μl)* med aerosolfilter eller stempelspidser - Mikrocentrifuge (maks. RCF x g, min. RCF x g) Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller tilsvarende - Vortex-mixer - 60ºC ± 2ºC varmeblok - Engangshandsker, uden pulver Post-amplifikation - Amplifikations-/detektionsområde - COBAS AMPLICOR -analyseinstrument og printer - Brugerhåndbog til COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet Valgfrit: AMPLILINK-software, herunder: Datastation til AMPLILINK-softwaren, med printer Applikationsmanual til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet (til brug med AMPLILINK Software, v3.2 Series) eller applikationsmanual til AMPLILINK Software Version 3.3 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og cobas p 630-instrumentet (til brug med AMPLILINK Software, v3.3 Series) - Metodemanual til COBAS AMPLICOR MTB-testen - Rack med D-kopper - Destilleret eller demineraliseret vand - 5 ml serologiske pipetter - Cylinder med målestreger (min. 1 liter) - Vortex-mixer - Engangshandsker, uden pulver * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolfilter eller stempelspidser, hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og ampliconer. ** Der skal bruges rør med skruelåg til klargøring af prøver for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver og kontroller. Brug ikke rør med snaplukning. 12/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

13 Mycobacterium tuberculosis Test Indsamling, transport og opbevaring af prøver Bemærk! Indsamling af prøver Transport af prøver Opbevaring af prøver Alle prøver skal håndteres som potentielt smittefarlige. De eneste acceptable luftvejsprøver er: (a) ekspektorerede og inducerede sputum, (b) bronkiale skylninger og (c) BAL, der er indsamlet i sterile plastikbeholdere. Disse prøver skal opløses, dekontamineres og koncentreres ved hjælp af metoderne NALC-NaOH 25, NaOH 25 eller SDS-NaOH 26,27. Dekontaminerede prøver skal transporteres til laboratoriet ved 2-25 C inden for 24 timer efter prøvetagningen. Hvis prøverne ikke ankommer til laboratoriet inden 24 timer efter prøvetagningen, skal de opbevares ved -70 C og forsendes på tøris. Transport af prøver skal foregå i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 34. Dekontaminerede prøver kan opbevares ved -70 C i op til 8 måneder. Behandlede prøver kan opbevares ved -70 C i op til 6 måneder eller ved 2-8 C i op til 4 dage. Brugsvejledning Bemærk! Bemærk! Bemærk! Bemærk! Reagensforberedelse Detaljerede oplysninger om betjening, udskrivning af resultater og fortolkning af markeringer og kommentarer kan findes i (1) brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og (2) ved brug af AMPLILINK Software v3.2 findes de i applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet, eller ved brug af AMPLILINK Software v3.3 findes de i applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.3 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og cobas p 630-instrumentet. Hvis der udføres prøvebehandling, amplifikation og detektion i løbet af en enkelt arbejdsdag, skal nedenstående testprocedure følges. Hvis prøveforberedelsen udføres på en anden dag end amplifikationen og detektionen, skal reagensforberedelsen udføres samme dag som amplifikationen og detektionen. Alle reagenser skal have den omgivende temperatur før brug. Brug pipetter med aerosolfilter eller stempelspidser, når dette er angivet. Vær yderst forsigtig med at sikre selektiv amplifikation. Der skal bruges rør med skruelåg til forberedelse af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver. Brug ikke rør med snaplukning. Udført i: Pre-amplifikation Reagensforberedelsesområdet 1. Fastlæg det relevante antal A-ringe, der skal bruges til testen af patientprøver og kontroller. Der skal medtages én M. tuberculosis (+)-kontrol og én Mycobacterium ( )-kontrol i hver PCR-kørsel (se afsnittet Kvalitetskontrol ). Placer A-ringen i A-ring-holderen. Bemærk! Selvom der ikke foretages detektion af MYCO IC, skal der tilsættes MYCO IC til Master Mix. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 13/30

14 2. Bland indholdet i MYCO IC -røret i en vortex-mixer i 5 sekunder. Forbered arbejds-master Mix ved at tilsætte 100 μl MYCO IC og 100 μl AmpErase LD-enzym til ét rør MYCO MMX (blandingen rækker til 32 amplifikationer). Det er ikke nødvendigt at måle Master Mix-volumen. Tilsæt 100 μl MYCO IC og 100 μl AmpErase LD-enzym til hele røret med MYCO MMX. Sæt låg på røret, og bland godt ved at vende røret gange. Bland ikke arbejds-master Mix i en vortex-mixer. Angiv forberedelsesdatoen på røret. Kasser de tomme MYCO IC- og AmpErase LD-enzym-rør. Arbejds-Master Mix kan holde sig i 4 uger ved 2-8 C. 3. Tilsæt 50 μl arbejds-master Mix i hvert A-rør med en repetitionspipette med et 1,25 ml Combitip-reservoir eller en pipette med aerosolfilter eller stempelspids. Luk ikke A-rør-lågene endnu. 4. Placer A-ringen med arbejds-master Mix i den genlukkelige plastikpose, og luk posen omhyggeligt. Flyt A-ringen til Pre-amplifikation - Prøve- og kontrolforberedelsesområdet. Opbevar A-ringen med arbejds-master Mix ved 2-8 C i pre-amplifikation - prøve- og kontrolforberedelsesområdet, indtil forberedelsen af prøver og kontroller er fuldført. Arbejds-Master Mix kan holde sig i 24 timer ved 2-8 C i A-rør, forseglet i plastikposen. Prøve- og kontrolklargøring Bemærk! Udført i: Pre-amplifikation - Prøve- og kontrolforberedelsesområdet For at amplificere behandlede prøver og kontroller skal du først udføre trinnene i afsnittet Reagensforberedelse. Optø behandlede prøver og kontroller til stuetemperatur, og gå videre til trin 10 under Prøve og kontrolklargøring. 1. Sæt en etiket på et 1,5 ml polypropylen-rør med skruelåg til hver prøve og kontrol. Brug ikke rør med snaplukning. Sæt en etiket med prøve-id på hvert prøveforberedelsesrør. 2. Tilsæt 500 μl RW til hvert prøverør. 3. Tilsæt 100 μl opløst, dekontamineret og koncentreret luftvejsprøve til røret med RW. Sæt låget på røret igen, og bland i 5 sekunder i en vortex-mixer. 4. Centrifuger ved x g i 10 minutter. 5. Aspirerer supernatanten med en overførselspipette med lille spids, og tilsæt 100 μl RL til cellepelleten med en pipette med en ny aerosolfilterspids for hver prøve. Bland i 5 sekunder i en vortex-mixer for at resuspendere pelleten. 6. Forbered arbejdskontrollerne på følgende måde: Bemærk! Der skal forberedes nye arbejdskontroller til hver dag testen udføres, og de skal kasseres ved hver dags afslutning. a. Bland indholdet af MYCO ( ) C -røret i 5 sekunder i en vortex-mixer. Tilsæt 100 μl MYCO ( ) C til et 1,5 ml polypropylen-rør med skruelåg ved hjælp af en pipette med aerosolfilterspids. Tilsæt 400 μl RL. Bland i 5 sekunder i en vortex-mixer. Dette er Mycobacterium ( )-arbejdskontrollen. 14/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

15 Mycobacterium tuberculosis Test b. Bland indholdet af MTB (+) C-røret i 5 sekunder i en vortex-mixer. Tilsæt 100 μl MTB (+) C til et 1,5 ml polypropylen-rør med skruelåg ved hjælp af en pipette med aerosolfilterspids. Tilsæt 400 μl RL. Bland i 5 sekunder i en vortex-mixer. Dette er M. tuberculosis (+)-arbejdskontrollen. c. Tilsæt 100 μl fra hver arbejdskontrol til et 1,5 m polypropylen-rør med skruelåg til behandling parallelt med de kliniske prøver. 7. Inkuber prøver og kontroller i en 60 C ± 2 C varmeblok i 45 minutter. 8. Fjern rørene fra varmeblokken, og pulscentrifuger rørene i 5 sekunder for at fjerne kondensat fra låget. 9. Brug en pipette med aerosolfilterspids til at tilsætte 100 μl RN til hvert prøve- og kontrolrør. Bland i 5 sekunder i en vortex-mixer ved halv hastighed. Brug en ny aerosolfilterpipettespids til hver prøve og kontrol. 10. Brug en pipette med aerosolfilterspids(er) til at overføre 50 μl af hver forberedt patientprøve, M. tuberculosis (+)-arbejdskontrol og Mycobacterium ( )-arbejdskontrol, til det relevante A-rør med arbejds-master Mix. Undgå omhyggeligt at overføre materiale, der muligvis ikke er resuspenderet. Sæt låg på rørene. Registrer positionerne for patientprøven eller -prøverne og kontrollerne på A-ring-kortet. 11. Flyt de forberedte prøver (patientprøver og kontroller) i A-ringene til amplifikations-/detektionsområdet. Behandlede prøver kan opbevares ved 2-8 C i op til 8 timer. Amplifikation og detektion Udført i: Post -amplifikation - Amplifikations-/detektionsområde Udfør den daglige instrumentvedligeholdelse, herunder: Aftør initialiseringspunktet med en fnugfri, fugtig klud, og tør det Aftør spidsen på D-kop-håndteringsenheden med en fnugfri, fugtig klud, og tør den Kontroller vaskebufferreservoiret, og fyld det om nødvendigt Forbered arbejdsvaskebufferen (1X) på følgende måde. Undersøg WB, og opvarm ved C for at opløse evt. bundfald igen, hvis det er nødvendigt. Forbered arbejdsvaskebufferen ved at tilføje 1 del WB til 9 dele destilleret eller demineraliseret vand. Bland grundigt. Sørg for, at der altid er mindst 3-4 liter arbejdsvaskebuffer (1X) i analyseinstrumentets vaskebufferreservoir. Tøm affaldsbeholderen Foretag priming af COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet Kontroller sprøjter og slanger under primingen Kontroller overførselsspidsen under primingen Gør følgende før hver kørsel: Kontroller affaldsbeholderen, og tøm den om nødvendigt Kontroller vaskebufferreservoiret, og tilføj om nødvendigt buffer Udskift brugte D-kop-rack Foretag priming af COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 15/30

16 Indsætning af reagenser og betjening af COBAS AMPLICOR - analyseinstrumentet 1. Kontroller mængden af reagens på COBAS AMPLICOR - analyseinstrumentet. Forbered nok reagenskassetter til udførelse af arbejdsopgaverne. 2. Bland MT PS1 grundigt i vortex-mixeren. Tilsæt 2,5 ml MT PS1 til MT4-kassetten. Placer kassetten på det testspecifikke reagensrack. Kasser det brugte MT PS1-rør. Angiv datoen for reagensforberedelsen på MT4-kassetten. Bemærk! Fortsæt til trin 4, hvis der ikke foretages detektion af den interne kontrol. Ellers fortsættes med trin Bland IC PS1 grundigt i vortex-mixeren. Tilsæt 2,5 ml IC PS1 til IC4- kassetten. Placer kassetten på det testspecifikke reagensrack. Kasser det brugte IC PS1-rør. Angiv datoen for reagensforberedelsen på IC4-kassetten. 4. Forbered arbejdssubstratopløsningen ved at pipettere 5 ml SB til én SB3- kassette. Bland det ved at pipettere op og ned. Kasser det åbne SB-rør. Angiv datoen for reagensforberedelsen på SB3-kassetten. 5. Placer arbejdssubstratet i SB3-kassetten i racket med generisk reagens. 6. Placer DN4- og CN4-kassetterne i racket med generisk reagens. Angiv datoen for, hvornår hver kassette blev åbnet, på kassetten. 7. Identificer reagensrackene som generiske eller testspecifikke ved hjælp af tastaturet, barkodescanneren eller AMPLILINK-softwaren. 8. Konfigurer reagensrackene ved at indtaste reagenspositioner og lotnumre i COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet ved hjælp af tastaturet, barkodescanneren eller AMPLILINK-softwaren. 9. Indlæs reagensrackene i COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet ved hjælp af tastaturet, barkodescanneren eller AMPLILINK-softwaren. Kontroller, at hver reagenskassette befinder sig på den tildelte position, og at hver kassette er sat ordentligt fast på det pågældende rack. 10. Placer D-kop-racket på D-kop-platformen. Der skal bruges én D-kop til hver detektionsreaktion og to D-kopper til hver kassette med arbejdssubstrat, før COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet kan udføre en blindkørsel. 11. Placer A-ringen eller -ringene i COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentets thermo cycler segment(-er). 12. Indlæs A-ringene i COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet ved hjælp af tastaturet, barkodescanneren eller AMPLILINK-softwaren. 13. Opret en A-ring-arbejdsliste. 14. Luk låget til det eller de thermo cycler segmenter tæt til. 16/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

17 Mycobacterium tuberculosis Test 15. Start COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. 16. Vent, til COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet indikerer, at der er udført load check. Bemærk! Med COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet kan der udføres 6 separate detektioner på indholdet af hvert A-rør. Den påkrævede mængde af hver detektionsreagens beregnes af COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet, og der foretages et load check ved starten af hver kørsel, som indikerer om der er nok tilgængelig reagens til at foretage de ønskede test. Kvalitetskontrol 17. COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet udfører automatisk amplifikation og detektion. Resultaterne udtrykkes som en absorbansværdi ved 660 nm og som positiv eller negativ. Der skal behandles mindst én kopi af M. tuberculosis (+)-kontrollen og én kopi af Mycobacterium( )-kontrollen for hvert batch med prøver. Som ved alle nye laboratorieprocedurer bør nye brugere overveje at bruge ekstra positive og negative kontroller, hver gang testen udføres, indtil de har opnået en høj grad af fortrolighed med hensyn til at udføre testen korrekt. Der er ikke nogen krav med hensyn til kontrollernes position i A-ringen(e). Kontroller kørselsudskriften for flag og kommentarer for at sikre dig, at kørslen er gyldig. Se brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet for at få oplysninger om udskrivning af resultater samt fortolkning af flag og kommentarer. Negativ kontrol Positiv kontrol Prøvebehandlingskontrol Absorbansen for Mycobacterium ( )-kontrollen skal være mindre end 0,25 ved 660 nm. Hvis absorbansen for Mycobacterium ( )-kontrollen er større end eller lig med 0,25, er hele kørslen ugyldig. Gentag hele testproceduren, (prøveforberedelse, amplifikation og detektion). Hvis absorbansen for Mycobacterium ( )-kontrollen konstant er større end 0,25, skal du kontakte den lokale Roche-forhandler for at få teknisk assistance. Absorbansen for M. tuberculosis (+)-kontrollen skal være større end eller lig med 2,0 ved 660 nm. Hvis absorbansen for M. tuberculosis (+)-kontrollen er mindre end 2,0, er hele kørslen ugyldig. Gentag hele testproceduren, (prøveforberedelse, amplifikation og detektion). Hvis absorbansen for M. tuberculosis (+)-kontrollen konstant er mindre end 2,0, skal du kontakte den lokale Roche-forhandler for at få teknisk assistance. Hvis du vil teste effektiviteten af prøvebehandlingen (det anbefales at gøre dette månedligt), skal 10 4 M. tuberculosis-cellerne behandles som beskrevet i afsnittet Prøve- og kontrolforberedelse, hvorefter de skal testes som en klinisk prøve. Der bør kunne opnås en absorbansværdi med COBAS AMPLICOR MTB-testen, der er større end eller lig med 0,35 ved 660 nm, hvis prøven er behandlet korrekt. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 17/30

18 Resultater Fortolkning af resultater Uden intern kontrol-detektion 1. Kontroller kørselsudskriften for flag (FLG) og kommentarer for at sikre dig, at kørslen er gyldig. Hvis kørslen er ugyldig, skal du gentage hele kørslen (prøveforberedelse, amplifikation og detektion). 2. Hvis kørslen er gyldig, skal prøveresultaterne fortolkes på følgende måde: A 660 Kommentar Fortolkning < 0,35 NEGATIVE MTB DNAikke detekteret. Prøven er sandsynligvis negativ med hensyn til M. tuberculosis. Et negativt resultat udelukker ikke tilstedeværelse af en MTBinfektion, da resultater er afhængige af korrekt prøveindsamling, fravær af inhibitorer og tilstrækkeligt med DNA, før der kan foretages en detektion. 0,35 POSITIVE MTB DNA detekteret. Prøven er positiv for tilstedeværelsen af M. tuberculosis. Fortolkning af resultater Med intern kontrol-detektion 1. Kontroller kørselsudskriften for flag (FLG) og kommentarer for at sikre dig, at kørslen er gyldig. Hvis kørslen er ugyldig, skal du gentage hele kørslen (prøveforberedelse, amplifikation og detektion). 2. Hvis kørslen er gyldig, skal prøveresultaterne fortolkes på følgende måde: MTB Prøveresultat IC Prøveresultat A 660 Kommentar A 660 Kommentar Fortolkning < 0,35 NEGATIVE 0,35 POSITIVE MTB DNA ikke detekteret. Prøven er sand- synligvis negativ med hensyn til M. tuberculosis. Et negativt resultat udelukker ikke tilstedeværelsen af en MTB-infektion, da resultater er afhængige af korrekt prøveindsamling, fravær af inhibitorer og tilstrækkeligt med DNA, før der kan foretages en detektion. < 0,35 NEGATIVE < 0,35 NEGATIVE Ugyldigt negativt resultat. En anden aliquot af den oprindelige prøve skal behandles. Hvis den oprindelige prøve ikke er tilgængelig, skal der indsamles en ny prøve. 0,35 POSITIVE ALLE ALLE MTB DNA detekteret. Prøven er positiv for tilstedeværelsen af MTB. 18/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

19 Mycobacterium tuberculosis Test Forholdsregler ved procedurerne Procedurebegrænsninger Arbejdsgangen i laboratoriet skal være envejs, idet der startes i preamplifikationsområdet og fortsættes i post-amplifikationsområdet (amplifikation/ detektion). Pre-amplifikationsaktiviteterne skal starte med klargøring af reagenser og fortsætte med klargøring af prøver. Beholdninger og udstyr skal være specielt beregnet til pre-amplifikationsaktiviteten og må ikke bruges til andre aktiviteter eller flyttes mellem områder. Der skal bæres handsker i hvert enkelt område, og de skal skiftes, før området forlades. Udstyr og beholdninger, der bruges til forberedelse af reagenser, må ikke bruges til forberedelse af prøver eller til pipettering eller behandling af amplificeret DNA eller andre kilder til mål-dna. Beholdninger og udstyr til post-amplifikation skal altid bibeholdes i postamplifikationsområdet. Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik for en korrekt udførelse af analysen. På grund af denne tests høje analytiske sensitivitet skal du være ekstraordinært opmærksom på at bevare renheden af reagenser og amplifikationsblandinger i kittet. Renheden af alle reagenser skal undersøges nøje. Kasser alle suspekte reagenser. Denne test er valideret ved brug af opløste, dekontaminerede og koncentrerede humane luftvejsprøver, herunder ekspektorerede og inducerede sputum, bronkiale skylninger og BAL, der er opløst, dekontamineret og koncentreret med metoderne NALC-NaOH 25, NaOH 25 eller SDS-NaOH 26,27. Test af andre prøvetyper kan resultere i ukorrekte negative eller ukorrekte positive resultater. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøveindsamling, transport, opbevaring og behandling. Detektionen af M. tuberculosis-komplekset er afhængig af det antal organismer, der findes i prøven, og kan påvirkes af prøveindsamlingsmetoder, patientfaktorer (dvs. alder, forekomst af symptomer) og/eller infektionsstadiet. Der kan forekomme falske negative resultater pga. polymerase-inhibering. Der er tilsat Mycobacterium-intern kontrol i COBAS AMPLICOR MTB-testen for at muliggøre identifikation af behandlede prøver, der indeholder stoffer, som kan påvirke PCR-amplifikationen. Tilsætningen af AmpErase LD-enzym i MTB Master Mix reducerer risikoen for amplicon-kontaminering. Kontaminering fra MTB-positive kontroller og kliniske prøver kan dog kun udgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i denne metodemanual. Som ved alle diagnostiske tests skal resultaterne af COBAS AMPLICOR MTB-testen fortolkes på baggrund af alle kliniske og laboratoriemæssige undersøgelser. Dette produkt må kun anvendes af medarbejdere, der er oplært i brugen af PCR-teknikker. Dette produkt må kun anvendes med COBAS AMPLICOR - analyseinstrumentet. 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 19/30

20 Selvom de er sjældne, kan mutationer i den bedst konserverede region i bakteriegenomet, som er dækket af COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis-testens primere og/eller probe, bevirke, at bakterierne ikke detekteres. På grund af naturlige forskelle mellem teknologier anbefales det, at brugeren udfører metodekorrelationsundersøgelser i laboratoriet for at fastlægge teknologiske forskelle, før der skiftes fra en teknologi til en anden. Egenskaber for funktionsevne Analytisk specificitet: Den analytiske specificitet for COBAS AMPLICOR MTB-testen er evalueret ved test af følgende bakterier og vira, hvoraf mange er normale flora eller patogener, der er almindelige i luftvejene. Alle bakterieisolater er testet med 10 6 celler/ml eller 10 5 nukleinsyrekopier/pcr. Virusisolaterne er testet ved de PFU/ml-værdier, der er angivet nedenfor. Ingen af de testede isolater var positive med COBAS AMPLICOR MTB-testen. Mykobakterielle arter Mycobacterium asiaticum Mycobacterium aurum Mycobacterium avium Mycobacterium chitae Mycobacterium cookii Mycobacterium fallax Mycobacterium flavescens Mycobacterium fortuitum Mycobacterium gastri Mycobacterium gordonae Mycobacterium intracellulare Mycobacterium kansasii Mycobacterium komassense Mycobacterium malmoense Mycobacterium marinum Mycobacterium neoaurum Mycobacterium nonchromogenicum Mycobacterium phlei Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium senegalens Mycobacterium simiae Mycobacterium smegmatis Mycobacterium sphagni Mycobacterium szulgai Mycobacterium terrae Mycobacterium thermoresistibile Mycobacterium triviale Mycobacterium xenopi 20/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0

21 Mycobacterium tuberculosis Test Ikke-mykobakterielle arter Acinetobacter calcoaceticus Actinomadura madurae Actinomyces pyogenes Actinoplanes italicus Aeromonas hydrophila Arcanobacterium haemolyticum Arthrobacter oxydans Bacillus subtilis Bacteriodes fragilis Blastomyces dermatitidis Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella (Moraxella) catarrhalis Brevibacterium linens Campylobacter jejuni Candida albicans Chromobacterium violaceum Citrobacter freundii Clostridium perfringens Coccidioides immitis Corynebacterium aquaticum Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium flavescens Corynebacterium glutamicum Corynebacterium jeikeium Corynebacterium minutissimum Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium pseudotuberculosis Corynebacterium renale Corynebacterium striatum Corynebacterium xerosis Cryptococcus neoformans Deinococcus radiodurans Dermatophilus congolensis Eikenella corrodens Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Gordona sputi Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Histoplasma capsulatum Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Lactobacillus casei Legionella micdadei Legionella pneumophila Microbacterium lactamicum Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamica Neisseria meningitidis Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis Nocardia farcinica Nocardia nova Nocardia otitidiscaviarum Nocardia transvalensis Oerskovia turbata Peptococcus niger Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica Propionibacterium acnes Pseudomonas aeruginosa Rhodococcus aichiensis Rhodococcus bronchialis Rhodococcus chubuensis Rhodococcus equi Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus gordonii Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptomyces griseus Veillonella atypica Veillonella parvula Vibrio parahaemolyticus Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica 8/2009, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 21/30

22 Virusisolater VIRUS Testet PFU/PCR Adenovirus 3,2 x 10 5 Cytomegalovirus 98 Herpes simplex I 5,6 x 10 5 Herpes simplex II Ikke tilgængelig Influenza B Ukendt* Parainfluenza 2 2,8 x 10 5 Respiratorisk syncytial virus 28 * Denne prøve var en halsskylning fra en patient Chlamydiaisolater Chlamydiaarter Testet IFU/PCR Chlamydia pneumoniae 188 Chlamydia trachomatis 88 Analytisk sensitivitet: Oprenset DNA Detektionsgrænsen for COBAS AMPLICOR MTB-testen blev fastlagt ved at bestemme det mindste antal kopier af M. tuberculosis-mål-dna, der ved reproducering kan detekteres med proceduren. Dette blev opnået ved at analysere serielle fortyndinger af oprenset mål-dna. Resultaterne viser, at COBAS AMPLICOR MTB-testen kan detektere 1 kopi af M. tuberculosis kompleks-dna pr. PCR-reaktion, og der blev detekteret 5 eller flere kopier af oprenset M. tuberculosis -DNA pr. PCR-reaktion 100% af tiden. Fem kopier af M. tuberculosis-kompleks-dna pr. PCR-reaktion svarer til 1000 kopier af M. tuberculosis-kompleks-dna pr. ml prøve. Analytisk sensitivitet: Detektionsgrænsen for COBAS AMPLICOR MTB-testen blev fastlagt ved at M. tuberculosis-celler bestemme det mindste antal M. tuberculosis-kolonidannelsesenheder (CFU), der ved reproducering kan detekteres med proceduren. Dette blev opnået ved at analysere serielle fortyndinger af kulturstammer i titer fra hver af tolv M. tuberculosis-isolater. Resultaterne viser, at COBAS AMPLICOR MTB-testen kan detektere én CFU pr. PCR-reaktion, og at der blev detekteret 40 CFU pr. PCR-reaktion 100% af tiden for hver af de tolv M. tuberculosis-kompleksisolater. Én CFU M. tuberculosis pr. PCR-reaktion svarer til 40 CFU M. tuberculosis pr. ml prøve. Præcision Intraseriel kørsel, mellem kørsel, mellem dag og den samlede præcision af COBAS AMPLICOR MTB-testen blev evalueret i overensstemmelse med de metoder, der er defineret i retningslinjerne fra CLSI (EP5-A2), Evaluation of Performance of Clinical Chemistry Devices. 36 Denne procedure tillader fastlæggelsen af intraseriel kørsel, mellem kørsel, mellem dag og den samlede præcision via udførelsen af en undersøgelse foretaget af flere brugere over flere dage. Undersøgelsen blev udført i Roche Molecular Systems Diagnostic Development-laboratorierne med et enkelt lot af COBAS AMPLICOR MTBtesten. Mycobacterium (+)-kontrollen blev behandlet til denne undersøgelse og yderligere fortyndet med prøvebehandlingsbuffere for at resultere i koncentrationer på 10 og 20 DNA-kopier/amplifikationsreaktion. Der blev dagligt udført en kørsel bestående af 24 test i 10 dage af hver 2 brugere. Hver kørsel omfattede 8 kopier af hver af de 2 Mycobacterium (+)-kontrolkoncentrationer og Mycobacterium ( )-kontrollen. Resultaterne af denne undersøgelse er vist i tabel 1. 22/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 8/2009, Revision 6.0