cobas EGFR Mutation Test

Transkript

1 cobas EGFR Mutation Test TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 Tests P/N: BEMÆRK: Købet af dette produkt giver køberen tilladelse til at anvende det til amplifikation og detektion af nukleinsyresekvenser ved hjælp af PCR (Polymerase Chain Reaction) og relaterede metoder til human in vitrodiagnostik. Der gives ingen generelle patent- eller andre licensrettigheder i forbindelse med købet, bortset fra brugsretten. TILSIGTET BRUG cobas EGFR-mutationstesten er en real-time PCR-test til kvalitativ bestemmelse og identifikation af mutationer i exon 18, 19, 20 og 21 af genet for den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) i DNA, der stammer fra formalinfikseret paraffinindstøbt (FFPET) humant NSCLC-tumorvæv (ikke-småcellet lungecancer). Testen er beregnet til at blive anvendt til identificering af patienter med fremskreden NSCLC, hvis tumorer har mutationer i exon 18, 19, 20 og 21 af EGFR-genet, og til at udvælge patienter til behandling med small molecule tyrosinkinaseinhibitorer (TKI'er), der angriber EGFR. Prøverne behandles ved hjælp af cobas DNAprøveforberedelseskittet til manuel prøveforberedelse og cobas z 480-analyseinstrumentet til automatisk amplifikation og detektion. OVERSIGT OVER OG FORKLARING AF TESTEN Aktiverende mutationer i genet, der koder for EGFR, forekommer primært ved NSCLC og resulterer i konstitutiv aktivering af EGFRproteinets kinaseaktivitet, hvilket bidrager til den onkogene proces. 1 Forekomsten af disse mutationer i uselekterede tilfælde af NSCLC er cirka 10 %. Disse mutationer forekommer dog oftest, men ikke udelukkende, hos kvindelige patienter, der er ikkerygere/lette rygere af asiatisk herkomst med adenokarcinom histologi. 2 Kliniske data indikerer, at patienter med fremskredne NSCLC-tumorer med aktiverende mutationer af EGFR, hvilket mest forekommer som deletioner i exon 19 eller som L858R-punktmutation i exon 21, udviser en høj responsrate og forlænget progressionsfri overlevelse (PFS) ved behandling med anti-egfr TKI'er, både i første- og andenlinjebehandling. 3-5 Andre mindre kendte EGFR-mutationer, såsom G719X-substitutioner i exon 18 og L861Q-punktmutationen i exon 21 forudsiger også modtagelighed for anti-egfr-behandlinger. 6-8 Medianoverlevelse hos patienter med EGFR-mutant NSCLC behandlet med anti-egfr TKI'er er nu cirka 2 år. 9 Nuværende kliniske retningslinjer anbefaler overvejelse af anti-egfr TKI-behandling som førstelinjebehandling ved fremskreden EGFR-mutant NSCLC. 10,11 De fleste patienter med EGFR-mutant NSCLC udvikler med tiden progressiv sygdom, når de behandles med anti-egfr TKI'er. I cirka halvdelen af disse progressive tilfælde ses sekundære resistensmutationer i EGFR-genet, oftest T790M-mutationen i exon Hos visse patienter kan disse sekundære resistensmutationer detekteres i deres tumorer forud for anti-egfr TKI-behandling. Selv om disse TKI-naive tilfælde stadig viser højt behandlingsrespons, synes disse patienter at have væsentlig kortere PFS (Progression Free Survival) end patienter, hvis tumorer ikke har disse sekundære mutationer. 6,13 PRINCIPPER FOR PROCEDUREN cobas EGFR-mutationstesten er baseret på to hovedprocesser: (1) Manuel prøveforberedelse for at opnå genomisk DNA fra FFPET, og (2) PCR-amplifikation og detektion af target-dna ved hjælp af komplementære primerpar og oligonukleotidprober, der er mærket med fluorescensfarver. Testen er fremstillet til at detektere G719X (G719A, G719C og G719S) i exon 18, deletioner og komplekse mutationer i exon 19, S768I, T790M samt insertioner i exon 20 og L858R i exon 21. Mutationsdetektion opnås gennem PCR-analyse med analyseinstrumentet cobas z 480. En mutant kontrol og negativ kontrol er inkluderet i hver kørsel for at bekræfte validiteten af kørslen. Klargøring af prøver FFPET-prøver behandles, og genomisk DNA isoleres ved hjælp af cobas DNA-prøveforberedelseskittet, en generisk manuel prøveforberedelse, der er baseret på nukleinsyrebinding til glasfibre. Et afparaffineret snit på 5 μm af en FFPET-prøve lyseres ved hjælp af inkubation ved en forhøjet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer, der frigiver nukleinsyrer og beskytter det frigivne genomiske DNA mod DNaser. Efterfølgende tilsættes isopropanol til lysisblandingen, som derefter centrifugeres igennem en kolonne med en glasfiberfilterindsats. Under centrifugeringen bindes det genomiske DNA til glasfiberfilterets overflade. Ubundne stoffer, f.eks. salte, proteiner og andre cellulære urenheder, fjernes ved centrifugering. De adsorberede nukleinsyrer vaskes og elueres derefter med en vandig opløsning. Mængden af genomisk DNA bestemmes spektrofotometrisk og justeres til en fastsat koncentration, der skal tilsættes amplifikations-/detektionsblandingen. Target-DNA'et amplificeres derefter og detekteres på cobas z 480-analyseinstrumentet ved hjælp af amplifikations- og detektionsreagenserne, der følger med cobas EGFR-mutationstestkittet. Afsnittet med oplysninger om dokumentrevision findes sidst i dette dokument DA 1 Doc Rev. 1.0

2 PCR-amplifikation Valg af target cobas EGFR-mutationstestkittet anvender primere, der definerer specifikke baseparsekvenser for hver af de tilsigtede mutationer. For G719X-mutationer i exon 18, er baseparsekvenser i området fra 104 til 106 tilsigtet; for exon 19-deletionsmutationer er baseparsekvenser i området 125 til 141 tilsigtet; for S768I-mutation i exon 20 er en baseparsekvens på 133 tilsigtet; for T790Mmutationen i exon 20 er en baseparsekvens på 118 tilsigtet; for exon 20-insertioner er baseparsekvenser i området fra 125 til 143 tilsigtet, for L858R-mutationen i exon 21 er en baseparsekvens på 138 tilsigtet. Amplifikationen foregår kun i områderne for EGFRgenet mellem primerne. Hele EGFR-genet amplificeres ikke. Amplifikation af target Der anvendes et derivat af Thermus-art Z05-AS1 DNA-polymerase til amplifikation af target. Først opvarmes PCR-reaktionsblandingen for at denaturere det genomiske DNA og blotlægge primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, bindes upstream- og downstream-primerne til DNA-targetsekvenserne. Z05 DNA-polymerasen forlænger hver bundne primer under tilstedeværelsen af en divalent metalion og overskydende dntp og syntetiserer dermed en anden DNA-streng. Dette afslutter den første cyklus af PCR, der giver en dobbeltstrenget DNA-kopi, som inkluderer de tilsigtede baseparregioner af EGFR-genet. Denne proces gentages et antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Automatiseret real-time mutationsdetektion cobas EGFR-mutationstesten anvender real-time PCR-teknologi. Hver target-specifikke oligonukleotide probe i reaktionen mærkes med en fluorescensfarve, som fungerer som rappportfarvestof, og med et quencher-molekyle, der absorberer (dæmper) fluorescensfrigivelsen fra rapportfarvestoffet i en intakt probe. Under hver amplifikationscyklus bindes proben, som er komplementær til den enkeltstrengede DNA-sekvens i amplikonet, og spaltes derefter af 5'-3'-nukleaseaktiviteten i Z05-AS1 DNA-polymerasen. Når rapportfarvestoffet er separeret fra quencher-farvestoffet af denne nukleaseaktivitet, kan fluorescens med en karakteristisk bølgelængde måles, når rapportfarvestoffet exciteres af det korrekte lysspektrum. Der anvendes fire forskellige rapportfarvestoffer til at mærke testens targetmutationer. Amplifikation af de seks EGFR-sekvenser detekteres uafhængigt på tværs af tre reaktioner ved at måle fluorescensen ved de fire karakteristiske bølgelængder i dedikerede optiske kanaler. Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af target-nukleinsyren fra prøven opnås i cobas EGFR-mutationstesten ved hjælp af AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) og deoxyuridintrifosfat (dutp) 15. AmpErase -enzymet genkender og katalyserer nedbrydningen af DNAstrenge, der indeholder deoxyuridin, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af dutp i stedet for deoxythymidintrifosfat som ét af nukleotidtrifosfaterne i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplikonet, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør kontaminerende amplikon modtageligt for nedbrydning med AmpErase-enzym, før amplifikationen af target-dna'et. Enzymet AmpErase, der findes i Master Mix-reagenser, katalyserer spaltningen af deoxyuridinholdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus ved alkalisk ph brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA'et ikke amplificeres. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges target-amplikonet ikke. Det er påvist, at cobas EGFR-mutationstesten kan inaktivere mindst 10 3 kopier af deoxyuridin-holdigt EGFR-mutant amplikon pr. PCR DA 2 Doc Rev. 1.0

3 REAGENSER cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 tests cobas DNA-prøveforberedelseskit (P/N: ) DNA TLB 1 x 10 ml (DNA-vævlysisbuffer) Tris-HCl-buffer Kaliumklorid 0,04 % EDTA 0,1 % triton X-100 0,09 % natriumazid PK 1 x 100 mg (Proteinase K) Proteinase K (frysetørret) Xn Proteinase K Sundhedsskadelig DNA PBB (DNA-paraffinbindingsbuffer) Tris-HCl-buffer 49,6 % guanidinhypoklorid 0,05 % carbamid 17,3 % triton X-100 Xn 49,6 % (w/w) guanidin-hci 1 x 10 ml Sundhedsskadelig WB I (DNA-vaskebuffer I) Tris-HCl-buffer 64 % guanidinhypoklorid Xn 64 % (w/w) guanidin-hci 1 x 25 ml Sundhedsskadelig WB II (DNA-vaskebuffer II) Tris-HCl-buffer Natriumklorid DNA EB (DNA-elueringsbuffer) Tris-HCl-buffer 0,09 % natriumazid FT (filterrør med låg) CT (prøveglas) 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 1 x 25 stk. 3 x 25 stk DA 3 Doc Rev. 1.0

4 cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 tests (P/N: ) EGFR 2 x 0,4 ml (EGFR Master Mix 1) Trisbuffer Kaliumklorid Glycerol EDTA Tween 20 3,13 % dimethylsulfoxid 0,09 % natriumazid < 0,10 % dntp'er < 0,01 % Z05 -AS1 DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,01 % AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) (mikrobielt) < 0,01 % aptamer < 0,01 % upstream- og downstream-egfr-primere < 0,01 % fluorescerende EGFR-prober EGFR 2 x 0,4 ml (EGFR Master Mix 2) Trisbuffer Kaliumklorid Glycerol EDTA Tween 20 3,13 % dimethylsulfoxid 0,09 % natriumazid < 0,10 % dntp'er < 0,01 % Z05 -AS1 DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,01 % AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) (mikrobielt) < 0,01 % aptamer < 0,01 % upstream- og downstream-egfr-primere < 0,01 % fluorescerende EGFR-prober EGFR 2 x 0,4 ml (EGFR Master Mix 3) Trisbuffer Kaliumklorid Glycerol EDTA Tween 20 3,13 % dimethylsulfoxid 0,09 % natriumazid < 0,10 % dntp'er < 0,01 % Z05 -AS1 DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,01 % AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) (mikrobielt) < 0,01 % aptamer < 0,01 % upstream- og downstream-egfr-primere < 0,01 % fluorescerende EGFR-prober MGAC 6 x 0,2 ml (Magnesiumacetat) Magnesiumacetat 0,09 % natriumazid EGFR MC 6 x 0,1 ml (EGFR-mutantkontrol) Trisbuffer EDTA Poly-rA RNA (syntetisk) 0,05 % natriumazid < 0,1 % plasmid-dna indeholdende EGFR exonsekvens 18, 19, 20 og 21 (mikrobielt) < 0,1 % EGFR vildtype-dna (cellekultur) DNA SD 2 x 3,5 ml (DNA-prøvediluent) Tris-HCl-buffer 0,09 % natriumazid DA 4 Doc Rev. 1.0

5 ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. B. Denne test er til brug med FFPET NSCLC-prøver. C. Brug ikke mundpipette. D. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. E. Undgå mikrobiel og DNA-kontaminering af reagenser. F. Reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. G. Brug ikke kittene efter udløbsdatoen. H. Reagenser fra forskellige lot eller kit må ikke blandes. I. Der skal bæres handsker, og de skal skiftes mellem håndtering af prøver og reagenser for at forhindre kontamination. J. For at undgå kontamination af arbejds-master Mix'et (arbejds-mmx) med DNA-prøver bør amplifikation og detektion foretages i et område, der er adskilt fra DNA-isolering. Arbejdsområdet for amplifikation og detektion bør gøres grundigt rent, før der arbejdes med MMX-forberedelse. For korrekt rengøring bør alle overflader, inklusive racks og pipetter, aftørres grundigt med en opløsning på 0,5 % natriumhypoklorit og derefter med en opløsning på 70 % ethanol. K. DNA PBB og WB I indeholder guanidinhypoklorid. Rengør med egnet laboratorierengøringsmiddel og vand, hvis der spildes væske, som indeholder denne buffer. Hvis der spildes potentielt smittefarlige stoffer, skal det berørte område først rengøres med laboratorierengøringsmiddel og derefter med 0,5 % natriumhypoklorit*. Hvis der spildes på cobas z 480-analyseinstrumentet skal instruktionerne i manualen til cobas z 480-analyseinstrumentet følges. *BEMÆRK: Almindeligt tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25 %. En 1:10-fortynding af et sådant blegemiddel giver en 0,5 % opløsning af natriumhypoklorit. L. Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 16 og i CLSI-dokument M29-A3. 17 M. DNA TLB og DNA PBB indeholder triton X-100, som kan irritere slimhinderne. Undgå kontakt med øjne, hud og slimhinder. N. DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR, EGFR, EGFR, EGFR MC og DNA SD indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazidholdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder koldt vand for at undgå ophobning af azider. O. Xylen er et farligt kemikalie og bør anvendes i et stinkskab. Bortskaf kemisk affald i overensstemmelse med lokale, regionale og nationale bestemmelser. P. Anvend beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangsbeskyttelseshandsker ved håndtering af alle reagenser. Undgå kontakt med huden, øjnene og slimhinderne. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis området ikke behandles. Hvis der spildes, skal der fortyndes med vand, før det tørres op. Q. Alle engangsartikler må kun bruges én gang. De må ikke genbruges. R. Anvend ikke engangsartikler efter deres udløbsdato. S. Anvend ikke natriumhypokloridopløsning (blegemiddel) til rengøring af cobas z 480-analyseinstrumentet. Rengør cobas z 480 i henhold til de procedurer, der er beskrevet i manualen, der fulgte med cobas z 480-analyseinstrumentet. T. I manualen til cobas z 480-analyseinstrumentet findes der yderligere advarsler, forholdsregler og procedurer til reducering af risikoen for kontaminering af cobas z 480-analyseinstrumentet. U. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og DNase-fri pipettespidser. KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING A. Med undtagelse af PK-reagenset må reagenserne ikke fryses. B. Opbevar DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FTog CT ved 15 C til 30 C. Efter åbning kan DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB og PK holde sig op til 8 anvendelser over 90 dage, eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der kommer først. C. Efter tilsætning af sterilt, nukleasefrit vand til PK skal ubrugt, rekonstitueret PK opbevares i mængder på 450 μl ved -20 C. Efter rekonstitution skal PK anvendes inden for 90 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der kommer først. D. Efter tilsætning af absolut ethanol skal WB I og WB II opbevares ved 15 C til 30 C. Disse arbejdsopløsninger er holdbare i 90 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der kommer først. E. Opbevar MGAC, EGFR, EGFR, EGFR, EGFR MC og DNA SD ved 2 C til 8 C. Efter åbning er reagenserne holdbare til 4 anvendelser over 90 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der kommer først. F. EGFR, EGFR, EGFR og arbejds-mmx (forberedt ved tilsætning af MGAC til EGFR eller EGFR eller EGFR ) bør beskyttes mod længerevarende udsættelse for lys DA 5 Doc Rev. 1.0

6 G. Arbejds-MMX skal opbevares mørkt ved 2 C til 8 C. De forberedte prøver og kontroller skal tilsættes inden for 1 time efter forberedelsen af arbejds-mmx. H. Behandlede prøver (oprenset DNA) er holdbare i op til 7 dage ved 15 C til 30 C, op til 60 dage ved 2 C til 8 C eller op til 60 dage ved -15 C til -20 C. Behandlede prøver er også holdbare i op til 60 dage ved -15 C til -25 C efter at have gennemgået 3 nedfrysninger/optøninger. I. Amplifikation skal påbegyndes inden for 1 time fra det tidspunkt, de behandlede prøver og kontroller tilsættes arbejds-mmx (forberedt ved tilsætning af MGAC til EGFR eller EGFR eller EGFR ). MEDFØLGENDE MATERIALER A. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 tests cobas DNA-prøveforberedelseskit (P/N: ) DNA TLB (DNA-vævlysisbuffer) PK (Proteinase K) DNA PBB (DNA-paraffinbindingsbuffer) WB I (DNA-vaskebuffer I) WB II (DNA-vaskebuffer II) DNA EB (DNA-elueringsbuffer) FT (filterrør med låg) CT (prøveglas) B. cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 tests (P/N: ) MGAC (magnesiumacetat) (låg med gul knap) EGFR (EGFR-Master Mix 1) (låg med hvid knap) EGFR (EGFR-Master Mix 2) (låg med guldfarvet knap) EGFR (EGFR Master Mix 3) (låg med blågrøn knap) EGFR MC (EGFR mutantkontrol) (låg med rød knap) DNA SD (DNA-prøvediluent) DA 6 Doc Rev. 1.0

7 NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Xylen (Sigma, katalognummer eller Fisher Scientific, katalognummer X5-4 eller tilsvarende) Absolut ethanol (Sigma, katalognummer E7023 eller Fisher Scientific, katalognummer BP eller tilsvarende) Isopropanol (Sigma, katalognummer eller Fisher Scientific, katalognummer A451-1 eller tilsvarende) Sterilt vand, nukleasefrit (Applied Biosystems PCR Grade Water, katalognummer AM9937 eller Thermo Scientific Molecular Biology Grade Water, katalognummer SH eller tilsvarende) Sterile, serologiske engangspipetter: 5 og 25 ml Microwell-plade (AD-plade) og forseglingsfilm (Roche P/N ) til cobas 4800-systemet Hjælpespartel til forseglingsfilm (Roche P/N ) til cobas 4800 Justérbare pipetter* (kapacitet 10 μl, 20 μl, 200 μl og 1000 μl) med aerosolbarriere- eller DNase-fri positive displaceringsspidser Pipette-værktøj (Drummond P/N: eller tilsvarende) Benchtop-mikrocentrifuge med kapacitet til x g og til x g (Eppendorf 5417C eller tilsvarende)** To (2) tørvarmeblokke, der kan varme mikrocentrifugerør op til hhv. 56 C og 90 C** 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør, der er sterile, RNase/DNase-fri og af PCR-kvalitet (Eppendorf, katalognummer ) Nanodrop UV-Vis-spektrofotometer (Thermo Scientific ND-1000 eller ND-2000)** Vortex-mixer** Mikrocentrifugerør-racks Talkumfrie engangsbeskyttelseshandsker Kalibrerede termometre til tørvarmeblok** Vandbad** der kan opretholde en temperatur på 37 C Enkeltkantet barberblad eller tilsvarende * Pipetter bør vedligeholdes i henhold til producentens anvisninger, og må højst afvige 3 % fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolbarriere- eller positive DNase-fri displaceringsspidser, hvor det er angivet, for at undgå nedbrydning af prøverne og krydskontaminering. ** Alt udstyr bør vedligeholdes korrekt i henhold til producentens anvisninger Instrumenter og software cobas z 480-analyseinstrumentet cobas 4800 SR2-systemkontrolenhed med OSXP-billede cobas 4800 SR2-systemsoftware, version 2.0 EGFR-analysepakkesoftware, version 1.0 Stregkodelæser, ekstern USB Printer HP P2055d PRØVEINDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING BEMÆRK: Alle prøver skal håndteres som potentielt smittefarlige. A. Indsamling af prøver NSCLC FFPET-prøver er blevet valideret til brug med cobas EGFR-mutationstesten. B. Transport af prøver NSCLC FFPET-prøver kan transporteres ved 15 C til 30 C. Transport af FFPET-prøver skal overholde nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer. 14 C. Opbevaring af prøver NSCLC FFPET-prøver kan opbevares ved 15 C til 30 C i op til 12 måneder efter datoen for vævindsamling. 5 μm-snit, der er anbragt på objektglas, kan opbevares ved 15 C til 30 C i op til 30 dage DA 7 Doc Rev. 1.0

8 BRUGSANVISNING BEMÆRK: Kun NSCLC FFPET-snit med 5 μm tykkelse, der har et tumorindhold på mindst 10 %, kan anvendes i cobas EGFR-mutationstesten. Enhver prøve med et tumorindhold på mindre end 10 % bør makrodissekeres efter afparaffinering. BEMÆRK: Se manualen til cobas z 480-analyseinstrumentet for detaljerede oplysninger om betjening af cobas z 480- analyseinstrumentet. BEMÆRK: Tørvarmeblokke, der kan opvarme mikrocentrifugerør, bør tændes og indstilles til hhv. 56 C og 90 C. Kørselsstørrelse En enkelt kørsel kan inkludere 1 til 30 prøver (plus kontroller) pr. microwell-plade med 96 brønde. Ved kørsel med mere end 24 prøver er det nødvendigt at anvende flere cobas EGFR-mutationstestkit. cobas EGFR-mutationstesten indeholder tilstrækkelige reagenser til 8 kørsler af 3 prøver (plus kontroller) for maksimalt 24 prøver pr. kit. Arbejdsgang Testprocessen med cobas EGFR-mutationstesten består af en manuel prøveforberedelse ved hjælp af cobas DNA-prøveforberedelsekittet efterfulgt af amplifikation/detektion på cobas z 480-analyseinstrumentet med cobas EGFR-mutationstestkittet. Reagensforberedelse A. Rekonstituér proteinase K (PK) ved at tilsætte 4,5 ml sterilt, nukleasefrit vand (PCR-kvalitet) til flasken ved hjælp af en steril, serologisk engangspipette på 5 ml. Bland ved at vende flasken 5 til 10 gange. Afmål 450 μl rekonstitueret PK i 1,5 ml Safe-Lockmikrocentrifugerør, og opbevar ved -20 C. Hvis proteinase K allerede er blevet rekonstitueret og nedfrosset, optøs et passende antal afmålte mængder til behandling af det prøveantal, der skal køres forud for afparaffinering (70 μl rekonstitueret PK er nødvendigt for hver prøve). B. Alle opløsninger, der opbevares ved C, skal være klare. Hvis der er bundfald til stede i et reagens, skal opløsningen opvarmes i et vandbad på 37 C, indtil bundfaldet opløses. Brug ikke opløsningen, før alt bundfaldet er opløst. C. Forbered arbejds-dna-vaskebuffer I (WB I) ved at tilsætte 15 ml absolut ethanol til flasken med WB I. Bland ved at vende flasken 5 til 10 gange. Datér flasken og notér, at der er tilsat ethanol. Opbevar arbejds-wb I ved 15 C til 30 C. D. Forbered arbejds-dna-vaskebuffer II (WB II) ved at tilsætte 50 ml absolut ethanol til flasken med WB II. Bland ved at vende flasken 5 til 10 gange. Datér flasken og notér, at der er tilsat ethanol. Opbevar arbejds-wb II ved 15 C til 30 C. Afparaffinering af FFPET-snit placeret på objektglas BEMÆRK: Xylen er et farligt kemikalie. Alle trin til afparaffinering bør foretages i et stinkskab. Se "Advarsler og forholdsregler". A. Anbring et objektglas, hvorpå der er placeret et 5 μm FFPET-snit, i en beholder med tilstrækkeligt xylen til at dække vævet; lad det stå i blød i 5 minutter. B. Overfør objektglasset til en beholder med tilstrækkeligt absolut ethanol til at dække vævet; lad det stå i blød i 5 minutter. C. Fjern objektglasset fra ethanolen og lad snittet lufttørre (5 til 10 minutter). D. Foretag makrodissektion, hvis prøven har et tumorindhold på mindre end 10 %. E. Markér et 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør for hver prøve med prøveidentifikationsinformationen. F. Tilsæt 180 μl DNA TLB til 1,5-ml Safe-Lock-mikrocentrifugerøret. G. Tilsæt 70 μl rekonstitueret PK til Safe-Lock-røret indeholdende DNA TLB. H. Skrab vævet af objektglasset og ned i Safe-Lock-røret. Nedsænk vævet i blandingen med DNA TLB/PK. I. Fortsæt med trin A i DNA-isoleringsproceduren. Afparaffinering af FFPET-snit, der ikke er placeret på objektglas BEMÆRK: Xylen er et farligt kemikalie. Alle trin til afparaffinering bør foretages i et stinkskab. Se "Advarsler og forholdsregler". BEMÆRK: Hvis prøven har et tumorindhold på mindre end 10 %, skal snittet placeres på et objektglas til macrodissektion, og proceduren, der er angivet i "Afparaffinering af FFPET-snit placeret på objektglas" skal følges. A. Placér et 5-μm FFPET-snit i et 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør, der er mærket med prøveidentifikationsinformationen for hver prøve. B. Tilsæt 500 μl xylen til Safe-Lock-røret indeholdende FFPET-snittet. C. Bland på vortex-mixer i 10 sekunder. D. Lad røret stå i 5 minutter ved 15 C til 30 C DA 8 Doc Rev. 1.0

9 E. Tilsæt 500 μl absolut ethanol og bland på vortex-mixer i 10 sekunder. F. Lad røret stå i 5 minutter ved 15 C til 30 C. G. Centrifugér ved x g til x g i 2 minutter. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Bortskaf supernatanten sammen med kemisk affald. H. Tilsæt 1 ml absolut ethanol og bland på vortex-mixer i 10 sekunder. I. Centrifugér ved x g til x g i 2 minutter. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Bortskaf supernatanten sammen med kemisk affald. BEMÆRK: Hvis pelleten flyder i den resterende supernatant, centrifugeres igen i 1 minut ved x g til x g. Fjern eventuel resterende supernatant. J. Tør vævspelleten i 10 minutter ved 56 C i en varmeblok med røret åbent. BEMÆRK: Sørg for, at ethanolen er helt fordampet, og pelleten er tør, før der fortsættes med næste trin. BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan tørre pelleter opbevares i op til 24 timer ved 2 C til 8 C. K. Resuspendér vævspelletten i 180 μl DNA-vævlysisbuffer (DNA TLB). L. Tilsæt 70 μl rekonstitueret PK. M. Fortsæt med trin A i DNA-isoleringsproceduren. KLARGØRING AF PRØVER DNA-isoleringsprocedure BEMÆRK: Behandl en negativ kontrol sideløbende med prøven/prøverne. Forbered den negative kontrol ved at blande 180 μl DNA-vævlysisbuffer (DNA TLB) og 70 μl PK-opløsning i et 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør, der er mærket NEG CT. Den negative kontrol skal behandles ved at følge den samme procedure som den for prøverne. A. Bland rørene, der indeholder prøveblandingen/dna TLB/PK, og den negative kontrolblanding (NEG CT) på vortex-mixeren i 30 sekunder. BEMÆRK: Vævet skal være helt nedsænket i DNA TLB/PK-blandingen. B. Placér rørene i tørvarmeblokken på 56 C, og inkubér i 60 minutter. C. Bland rørene i 10 sekunder på vortex-mixer. BEMÆRK: Vævet skal være helt nedsænket i DNA TLB/PK-blandingen. D. Placér rørene i tørvarmeblokken på 90 C, og inkubér i 60 minutter. BEMÆRK: Under inkuberingen skal det nødvendige antal filterrør (FT'er) med hængslede låg forberedes ved at placere filterrøret på et prøveglas (CT) og mærke hvert filterrørslåg med den rette prøve- eller kontrolidentifikation. BEMÆRK: Hver prøve behøver 1 FT, 3 CT'er og 1 elueringsrør (1,5 ml mikrocentrifugerør). BEMÆRK: Under inkuberingen mærkes det nødvendige antal elueringsrør (1,5 ml mikrocentrifugerør) med den rette prøve- eller kontrolidentifikation. E. Lad rørene køle ned til 15 C til 30 C. Efter afkøling pulscentrifugeres rørene for at opsamle væske fra lågene. F. Tilsæt 200 μl DNA PBB i hvert rør; bland ved at pipettere op og ned 3 gange. G. Inkubér rørene ved 15 C til 30 C i 10 minutter. H. Tilsæt 100 μl isopropanol i hvert rør; bland lysat ved at pipettere op og ned 3 gange. I. Overfør hvert lysat til den relevant mærkede FT-/CT-enhed. J. Centrifugér FT-/CT-enhederne ved x g i 1 minut. K. Placér hvert FT i et nyt CT. Bortskaf udskillelsen fra det gamle CT sammen med kemisk affald, og bortskaf det brugte CT på korrekt vis. L. Tilsæt 500 μl arbejds-wb I i hvert FT. BEMÆRK: Forberedelse af arbejds-wb I er beskrevet i afsnittet "Reagensforberedelse". M. Centrifugér FT-/CT-enhederne ved x g i 1 minut. N. Bortskaf udskillelsen i hver CT sammen med kemisk affald. Sæt FT tilbage i samme CT. O. Tilsæt 500 μl arbejds-wb II i hvert FT. BEMÆRK: Forberedelse af arbejds-wb II er beskrevet i afsnittet "Reagensforberedelse" DA 9 Doc Rev. 1.0

10 P. Centrifugér FT-/CT-enhederne ved x g i 1 minut. Q. Placér hvert FT i et nyt CT. Bortskaf udskillelsen fra det gamle CT sammen med kemisk affald, og bortskaf det brugte CT på korrekt vis. R. Centrifugér FT-/CT-enhederne ved til x g i 1 minut for at tørre filtermembranerne. S. Placér hvert FT i et elueringsrør (1,5 ml mikrocentrifugerør), der er mærket med prøve- eller kontrolidentifikationen. Bortskaf udskillelsen fra det brugte CT sammen med kemisk affald, og bortskaf det brugte CT på korrekt vis. T. Tilsæt 100 μl DNA EB til midten af hver FT-membran, uden at røre FT-membranen. U. Inkubér FT med elueringsrøret ved 15 C til 30 C i 5 minutter. V. Centrifugér FT med elueringsrør ved x g i 1 minut for at opsamle eluat i elueringsrøret. Bortskaf det brugte FT på korrekt vis. W. Luk låget på elueringsrøret. Elueringsrøret indeholder DNA-stock-opløsningen. Fortsæt med trin A i afsnittet DNA-kvantificering. BEMÆRK: Måling af DNA-koncentrationen bør foretages umiddelbart efter DNA-isoleringsproceduren og før opbevaring. DNA-kvantificering: A. Bland hver DNA-stock-opløsning på vortex-mixeren i 5 sekunder. B. Kvantificér DNA ved hjælp af et Nanodrop UV-Vis-spektrofotometer (ND-1000 eller ND-2000) i henhold til producentens anvisninger. Anvend DNA EB som blindprøve for instrumentet. Det er nødvendigt med gennemsnitligt to konsistente aflæsninger. De to målinger skal være inden for ±10 % fra hinanden, når DNA-koncentrationsaflæsningerne er 20,0 ng/μl. For DNA-koncentrationsaflæsninger < 20,0 ng/μl skal de to målinger være inden for ± 2 ng/μl. Hvis de to målinger ikke er inden for ± 10 % fra hinanden, når DNA-koncentrationsaflæsningerne er 20,0 ng/μl, eller inden for ± 2 ng/μl, når DNAkoncentrationsaflæsningerne er < 20,0 ng/μl, skal der foretages yderligere 2 aflæsninger, indtil kravene opfyldes. Gennemsnittet af disse to ny målinger skal derefter beregnes. BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at måle DNA-stock-opløsningen fra den behandlede negative kontrol (NEG CT). C. DNA-stock-opløsningskoncentrationen fra prøverne skal være 2 ng/μl for at kunne foretage cobas EGFR-mutationstesten. Der køres tre amplifikationer/detektioner pr. prøver ved hjælp af 25 μl af en fortynding af DNA-stock-opløsning på 2 ng/μl (i alt 50 ng DNA) for hver amplifikation/detektion. BEMÆRK: Hver DNA-stock-opløsning skal have en minimumkoncentration på 2 ng/μl for at kunne foretage cobas EGFR-mutationstesten. Hvis koncentrationen af DNA-stock-opløsningen er < 2 ng/μl, skal proceduren for afparaffineringen, DNA-isolering og DNA-kvantificering for den pågældende prøve gentages ved hjælp af to 5 μm FFPET-snit. For prøver, der er placeret på objektglas, kombineres vævet fra begge snit i et rør efter afparaffinering, herefter nedsænkes vævet i DNA TLB + PK, og der foretages DNA-isolering og -kvantificering som beskrevet ovenfor. For prøver, der ikke er placeret på objektglas, kombineres to snit i et rør, hvorefter vævet nedsænkes i DNA TLB + PK, og der foretages DNA-isolering og -kvantificering som beskrevet ovenfor. Hvis DNA-stock-opløsning stadig er < 2 ng/μl, skal et nyt FFPET-prøvesnit udbedes fra rekvirenten. BEMÆRK: Opbevar DNA-stock-opløsningen (behandlet prøve og negativ kontrol) ved 2 C - 8 C i op til 2 uger eller ved -20 C i op til 60 dage. AMPLIFIKATION OG DETEKTION BEMÆRK: For at undgå kontamination af arbejds- MMX med DNA-prøver bør amplifikation og detektion foretages i et område, der er adskilt fra DNA-isolering. Arbejdsområdet for amplifikation og detektion bør gøres grundigt rent, før der arbejdes med MMX-forberedelse. For korrekt rengøring bør alle overflader, inklusive racks og pipetter, aftørres grundigt med en opløsning på 0,5 % natriumhypoklorit og derefter med en opløsning på 70 % ethanol. Almindeligt tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25 %. En 1:10-fortynding af et sådant blegemiddel giver en 0,5 % opløsning af natriumhypoklorit. Opsætning af instrumentet: Se manualen til cobas z 480-analyseinstrumentet for detaljerede instruktioner i opsætning af cobas z 480. Opsætning af testrækkefølge: Se manualen til cobas 4800-systemet, softwareversion 2.0 til cobas EGFR-mutationstest (manual til cobas EGFR) for detaljerede instruktioner vedrørende trinene i EGFR-arbejdsgangen DA 10 Doc Rev. 1.0

11 Fortyndingsberegning af prøve-dna-stock-opløsningen: Fortyndingsberegning til DNA-stock-opløsningskoncentrationer fra 2 ng/μl til 36 ng/μl BEMÆRK: DNA-stock-opløsninger fra prøver bør fortyndes umiddelbart før amplifikation og detektion. BEMÆRK: Der køres tre (3) amplifikationer/detektioner for hver prøve, hvilket kræver en samlet volumen på 75 μl (25 μl for hver af tre reaktioner) for en fortynding af DNA-stock-opløsning på 2 ng/μl (af i alt 150 ng DNA). A. Beregn den nødvendige volumen (μl) af DNA-stock-opløsning, der er nødvendig til hver prøve: μl af DNA-stock-opløsning = (90 μl x 2 ng/μl) DNA-stock-opløsningskoncentration [ng/μl] B. For hver prøve beregnes den nødvendige volumen (μl) af DNA-prøvefortynder (DNA SD): μl af DNA SD = 90 μl μl af DNA-stock-opløsning Eksempel: DNA-stock-opløsningskoncentration = 6,5 ng/μl A. μl af DNA-stock-opløsning = (90 μl x 2 ng/μl) 6,5 ng/μl = 27,7 μl B. μl af DNA SD = (90 μl 27,7 μl) = 62,3 μl Fortyndingsberegning til DNA-stock-opløsningskoncentrationer > 36 ng/μl BEMÆRK: DNA-stock-opløsninger fra prøver bør fortyndes umiddelbart før amplifikation og detektion. BEMÆRK: Der køres tre (3) amplifikationer/detektioner for hver prøve, hvilket kræver en samlet volumen på 75 μl (25 μl for hver af tre reaktioner) for en fortynding af DNA-stock-opløsningen på 2 ng/μl (af i alt 150 ng DNA). A. Ved DNA-stock-opløsningskoncentrationer > 36 ng/μl anvendes følgende formel til at beregne mængden af DNAprøvefortynder (DNA SD), der er nødvendig til at forberede mindst 90 μl fortyndet DNA-stock-opløsning. Dette er for at sikre, at hver prøve anvender minimum 5 μl DNA-stock-opløsning. B. For hver prøve beregnes den volumen (μl) af DNA SD, der er nødvendig for at fortynde 5 μl DNA-stock-opløsning til 2 ng/μl: Nødvendig volumen af DNA SD i μl = ((5 μl DNA-stock-opløsning x DNA-stock-opløsningskoncentration i ng/μl) / 2 ng/μl) 5 μl Eksempel: Koncentration af DNA-stock-opløsning = 100 ng/μl A. Nødvendig volumen af DNA SD i μl = ((5 μl x 100 ng/μl) / 2 ng/μl) 5 μl = 245 μl B. Anvend den beregnede volumen af DNA SD til at fortynde 5 μl DNA-stock-opløsning. Prøvefortynding A. Forbered det relevante antal 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør til DNA-fortyndinger ved at mærke dem med den rette prøveidentifikation. B. Tilsæt ved hjælp af en pipette med en ny aerosolresistent spids den beregnede volumen af DNA SD i rørene, der er mærket hertil. Pipettér 45 μl DNA SD i et Safe-Lock-rør, der er mærket som NEG CT. C. Bland hver DNA-stock-opløsning og den negative kontrol i en vortex-mixer i 5 til 10 sekunder. D. Tilsæt ved hjælp af en pipette med en aerosolresistent pipettespids (en ny spids til hver pipettering) forsigtigt den beregnede volumen af hver DNA-stock-opløsning i det pågældende rør, der indeholder DNA SD. Pipettér 45 μl negativ kontrol (oprenset eluat) i NEG CT-røret. E. Sæt låg på rørene, og bland hvert rør i 5 til 10 sekunder på vortex-mixer. F. Skift handsker DA 11 Doc Rev. 1.0

12 Forberedelse af arbejdsblandingerne (, og ) BEMÆRK: EGFR, EGFR, EGFR og arbejds-mmx er lysfølsomme og skal beskyttes mod længerevarende udsættelse for lys. BEMÆRK: På grund af viskositeten i EGFR-BLANDINGERNE og arbejds-mmx, skal man pipettere langsomt for at sikre, at blandingen er helt afpipetteret fra spidsen. BEMÆRK: EGFR, EGFR og EGFR kan forekomme lysblå/lillaagtig. Dette påvirker ikke reagensets performance. Forbered tre arbejds-mmx, én indeholdende EGFR, én indeholdende EGFR og den sidste indeholdende EGFR i separate 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør. A. Beregn volumenen af EGFR eller EGFR eller EGFR, der er nødvendigt for hver arbejds-mmx, ved hjælp af følgende formel: Nødvendig volumen af EGFR eller EGFR eller EGFR = (antal prøver + 2 kontroller +1) x 20 μl B. Beregn den nødvendige volumen af MGAC til hver arbejds-mmx ved hjælp af følgende formel: Nødvendig volumen af MGAC = (antal prøver + 2 kontroller +1) x 5 μl Brug tabel 1 til at bestemme volumenen for hver reagens, der er nødvendig til forberedelse af arbejds-mmx, baseret på antallet af prøver i kørslen. Tabel 1 Nødvendige volumener af reagenser til arbejds-, arbejds- og arbejds- Antal prøver* MMX 20 μl MGAC 5 μl Samlet volumen for hver arbejds-mmx (μl) * Volumener for antallet af prøver er baseret på summen af antallet af prøver + 2 kontroller + 1 C. Fjern det relevante antal EGFR -, EGFR -, EGFR - og MGAC-flasker fra opbevaringen ved 2 C til 8 C. Bland hver reagens i 5 sekunder, og indsaml væsken i bunden af røret før brug. Mærk et sterilt mikrocentrifugerør til arbejds-, arbejds- og arbejds-. D. Tilsæt den beregnede volumen af EGFR eller EGFR eller EGFR til de pågældende arbejds-mmx-rør. E. Tilsæt den beregnede volumen af MGAC til arbejds-mmx-rørene. F. Bland rørene på vortex-mixer 3-5 sekunder for at sikre korrekt blanding. BEMÆRK: Prøver og kontroller bør tilsættes microwell-pladen (AD-plade) inden for 1 time efter forberedelsen af arbejds-mmx'er. BEMÆRK: Brug kun microwell-plade (AD-plade) og forseglingsfilm (Roche P/N ) til cobas systemet DA 12 Doc Rev. 1.0

13 Forberedelse af plade Figur 1 Prøvepladelayout Figur 1. Pladelayout for cobas EGFR-mutationstesten Række/ kolonne A B C D E F G H MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 Hvor: NEG = negativ kontrol, MUT = mutant kontrol, S# = prøve-id og MMX-# svarer til Master Mix-reagens 1, 2 eller 3. BEMÆRK: Alle prøver skal spredes over tre konsekutive kolonner i en række for at kunne frembringe et resultat. A. Pipettér 25 μl arbejds-mmx i hver reaktionsbrønd på microwell-pladen (AD-plade), som er nødvendig til kørslen. Lad ikke pipettespidsen røre pladen uden for brønden. Tilsæt arbejds- (indeholdende EGFR ) til microwell-pladebrøndene (AD-plade) i række 1, 4, 7 og 10 efter behov. Tilsæt arbejds- (indeholdende EGFR ) til microwell-pladebrøndene (AD-plade) i kolonne 2, 5, 8 og 11 efter behov. Tilsæt arbejds- (indeholdende EGFR ) til microwell-pladebrøndene (AD-plade) i kolonne 3, 6, 9 og 12 efter behov. B. Pipettér 25 μl af EGFR MC i brønd A1, A2 og A3 på microwell-pladen (AD-plade); bland grundigt ved at bruge pipetten til at aspirere og dispensere i brønden minimum to gange. C. Pipettér 25 μl af NEG CT i brønd B1, B2 og B3 på microwell-pladen (AD-plade) ved brug af en ny pipettespids; bland grundigt ved at bruge pipetten til at aspirere og dispensere i brønden minimum to gange. BEMÆRK: Hver kørsel skal indeholde positiv kontrol (EGFR MC) i brønd A1, A2 og A3, og negativ kontrol (NEG CT) i brønd B1, B2 og B3. I modsat fald ugyldiggøres kørslen af cobas z 480-analyseinstrumentet. BEMÆRK: Skift handsker efter behov for at beskytte mod prøve-til-prøve-kontamination og kontamination af ydersiden af PCR-reaktionsrør. D. Brug en ny pipettespids til hver fortyndet DNA-prøve, og tilsæt 25 μl af den første DNA-prøve til brønd C1, C2 og C3 på microwell-pladen (AD-plade) idet der bruges en ny spids ved tilsætning af DNA-prøven til hver af brøndene. Bland hver brønd ved at bruge pipetten til at aspirere og dispensere i brønden minimum to gange. Gentag denne procedure for det fortyndede DNA fra den anden prøve (brønd D1, D2 og D3). Følg templaten i figur 1, indtil alle prøvernes DNA-fortyndinger er pipetteret til microwell-pladen (AD-plade). Sørg for, at al væske er samlet i bunden af brøndene. E. Tildæk microwell-pladen (AD-plade) med forseglingsfilm (leveres sammen med pladerne). Brug hjælpespartlen til forseglingsfilm til at forsegle microwell-pladen (AD-plade). F. Kontrollér, at al væske er samlet i bunden af hver brønd, før PCR startes. BEMÆRK: Amplifikation og detektion bør startes inden for 1 time efter tilsætning af den første prøve DNA-fortynding til arbejds-mmx. Start af PCR Se manualen til cobas EGFR for detaljerede instruktioner vedrørende trinene i EGFR-arbejdsgangen DA 13 Doc Rev. 1.0

14 FORTOLKNING AF RESULTATER BEMÆRK: Al validering af kørsler og prøver udføres af cobas 4800-softwaren. BEMÆRK: En gyldig testkørsel kan indeholde både gyldige og ugyldige prøveresultater. Hvis kørslen er gyldig, skal prøveresultaterne fortolkes som vist i tabel 2. Tabel 2 Fortolkning af resultater fra cobas EGFR-mutationstest Testresultat Mutationsresultat Fortolkning Mutation Detected Exon 19-deletion S768I L858R T790M G719X (G719A, G719C, G719S) Exon 20-insertion (der kan være mere end én mutation til stede) Mutation detekteret i specificeret target-egfr-område. Mutation Not Ikke tilgængelig Mutation ikke detekteret i target-egfr-områder Detected* Invalid Ikke tilgængelig Prøveresultatet er ugyldigt. Gentag testen af prøver med ugyldige resultater ved at følge instruktionerne, der er beskrevet i afsnittet Gentagelse af test af prøver med ugyldige resultater nedenfor. Failed Ikke tilgængelig Kørsel mislykket på grund af hardware- eller softwarefejl. Kontakt dit lokale Roche-kontor for teknisk hjælp. * Resultatet "Mutation Not Detected" (Mutation ikke detekteret) udelukker ikke tilstedeværelsen af en mutation i target-egfrområderne, da resultater afhænger af procenten af mutante sekvenser, korrekt prøveintegritet, fravær af inhibitorer og tilstrækkelig DNA, før der kan foretages en detektion. Gentagelse af test af prøver med ugyldige resultater A. Gentag fortynding af den ugyldige prøve-dna-stock-opløsning fra procedurerne Fortyndingsberegning af prøve-dnastock-opløsningen og Prøvefortynding i afsnittet AMPLIFIKATION OG DETEKTION. B. Efter at have foretaget DNA-stock-opløsningsfortynding til 2 ng/μl som beskrevet i Prøvefortynding fortsættes med Forberedelse af arbejdsblandingerne (, og ) og resten af amplifikations- og detektionsproceduren. BEMÆRK: Hvis prøven forbliver ugyldig efter at have foretaget testen igen, eller hvis der ikke var tilstrækkelig DNAstock-opløsning til at forberede en anden opløsning i Gentagelse af test af prøver med ugyldige resultater, trin A, skal hele testproceduren gentages for den pågældende prøve ved at starte med afsnittet Afparaffinering og DNA-isolering ved hjælp af et nyt 5-μm FFPET-snit. KVALITETSKONTROL Der skal inkluderes et kit af cobas EGFR-testmutantkontrol (EGFR MC) og negativ kontrol (NEG CT) til arbejds-, arbejds- og arbejds- i hver kørsel på op til 30 prøver. En kørsel er gyldig, hvis EGFR-mutantkontrolbrøndene (EGFR MC) (A1, A2 og A3) og de negative kontrolbrønde (NEG CT) (B1, B2 og B3) er gyldige. Hvis EGFR-mutantkontrollen (EGFR MC) eller den negative kontrol (NEG CT) for arbejds- eller arbejds- eller arbejds- er ugyldige, er hele kørslen ugyldig og skal gentages. Forbered en frisk fortynding af den tidligere isolerede prøve af DNA-stock-opløsning for at opsætte en ny microwellplade (AD-plade) med kontrol til amplifikation og detektion. Positiv kontrol Resultatet for EGFR-mutantkontrol (EGFR MC) skal være "Valid" (gyldigt) for arbejds-, arbejds- og arbejds-. Hvis EGFR MC-resultaterne konstant er ugyldige, kontaktes Roche for teknisk hjælp. Negativ kontrol Resultatet for negativ kontrol (NEG CT) skal være "Valid" (gyldigt) for arbejds-, arbejds- og arbejds-. Hvis NEG CT-resultaterne konstant er ugyldige, kontaktes dit lokale Roche-kontor for teknisk hjælp DA 14 Doc Rev. 1.0

15 FORHOLDSREGLER VED PROCEDURERNE Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik for en korrekt performance af analysen. På grund af testens høje analytiske sensitivitet skal man være omhyggelig med at undgå, at reagenser og amplifikationsblandinger kontamineres. BEGRÆNSNINGER VED PROCEDURERNE 1. Test kun de angivne prøvetyper. cobas EGFR-mutationstesten er kun blevet valideret til brug med NSCLC FFPET-prøver. 2. cobas EGFR-mutationstesten er kun blevet valideret ved hjælp af cobas DNA-prøveforberedelseskittet (Roche P/N: ). 3. Detektionen af en mutation er afhængig af det antal kopier, der findes i prøven, og kan påvirkes af prøveintegriteten, mængden af isoleret DNA og tilstedeværelsen af interfererende stoffer. 4. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøvefiksering, transport, opbevaring og behandling. Følg procedurerne i dette pakningsindlæg og i manualen til cobas EGFR. 5. Effekten fra andre potentielle variabler, såsom prøvefikseringsvariabler, er ikke blevet evalueret. 6. Tilsætningen af AmpErase-enzym til cobas EGFR-mutationstestens Master Mix aktiverer den selektive amplifikation af target- DNA. Kontaminering fra reagenser kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i dette pakningsindlæg. 7. Dette produkt må kun anvendes af medarbejdere, som er uddannet i brugen af PCR-teknikker og brugen af cobas systemet. 8. Kun cobas z 480-analyseinstrumentet er blevet valideret til brug med dette produkt. Der kan ikke anvendes nogen anden thermocycler med real-time optisk detektion med dette produkt. 9. På grund af naturlige forskelle mellem teknologier anbefales det, at brugeren udfører metodekorrelationsundersøgelser i laboratoriet for at fastslå teknologiske forskelle, før der skiftes fra en teknologi til en anden. 10. Selvom de er sjældne, kan mutationer inden for regionerne af de genomiske DNA i EGFR-genet, som er dækket af cobas EGFR-mutationstestens primere og/eller prober, medføre, at tilstedeværelsen af en mutation ikke detekteres. 11. Forekomst af PCR-hæmmere kan medføre falsk-negative eller ugyldige resultater. 12. Selvom det er sjældent, viser cobas EGFR-mutationstesten resultatet "Mutation Not Detected" for visse mutationer og begrænset krydsreaktivitet (resultater af "Mutation Detected") for mutationer, der ligger ved siden af targetmutationer i exon 18, 19, 20 og cobas EGFR-mutationstesten er valideret til brug med 50 ng DNA per reaktionsbrønd. DNA-inputmængder mindre end 50 ng per reaktionsbrønd anbefales ikke. EVALUERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE Analytisk sensitivitet Analytisk sensitivitet for cobas EGFR-mutationstest ved hjælp af plasmidblandinger Seks DNA-plasmidkonstruktioner, der indeholder den hyppigst observerede mutation for hver mutationsklasse detekteret af testen, blev blandet med vildtype cellelinje-dna til en endelig targetsammensætning på 5 % mutantsekvens baseret på tilsvarende genomisk DNA. Serielle fortyndinger af de 5 % mutantsekvensstamopløsninger blev forberedt, og 24 bestemmelser af hvert panelmedlem blevet testet ved hjælp af 3 kit med forskellige lotnumre af cobas EGFR-mutationstesten. Analytisk sensitivitet blev fastlagt ved den laveste mængde DNA, der gav et EGFR-niveau for "Mutation Detected" (Mutation detekteret) på mindst 95 % for targetmutationen, som det fremgår af tabel 3. Tabel 3 Sensitivitet for cobas EGFR-mutationstest ved anvendelse af DNA fra plasmid- og cellelinjeblandinger EGFR exon EGFR-mutation Targetnukleinsyresekvens Mindste mængde DNA (ng) i 5 % muteret panelmedlem per reaktionsbrønd til at opnå et niveau på 95 % af "Mutation Detected" (N=72 bestemmelser) 18 G719A 2156 G>C 3,13 19 Exon 19-deletion del15 0,78 20 S768I 2303 G>T 0,78 20 T790M 2369 C>T 3,13 20 Exon 20-insertion 2307_2308ins9 (GCCAGCGTG) 3,13 21 L858R 2573 T>G 0, DA 15 Doc Rev. 1.0

16 Analytisk sensitivitet ved brug af FFPET-prøveblandinger Tre FFPET-prøver af oprenset DNA for Exon 19-deletion og L858R-mutationer blev blandet med EGFR vildtype FFPET-prøveekstrakter til opnåelse af blandinger med prøver med et targetmutationsniveau på 10, 5,0, 2,5 og 1,25 %, som bestemt med en valideret, hyperparallel sekventeringsmetode, 454-sekventering (454 Life Sciences, Branford, CT, USA). Serielle fortyndinger af hver af prøveblandingerne blev forberedt, og der blev kørt otte (8) bestemmelser for hvert panelmedlem ved hjælp af 3 kit med forskellige lotnumre af cobas EGFR-mutationstest (n=24/panelmedlem). Sensitiviteten for hver prøve blev bestemt ved den laveste mængde DNA, der gav et EGFR-niveau for "Mutation Detected" på mindst 95 % for targetmutationen, vist i tabel 4. Tabel 4 Sensitivitet for cobas EGFR-mutationstest ved hjælp af FFPET-prøveblandinger EGFRmutation Prøve EGFR-nukleinsyresekvens Exon 19- deletion L858R Prøve nr _2249del15 1,4 Prøve nr _2250del15 2,5 Prøve nr _2252del15 2,4 Prøve nr T>G 4,0 Prøve nr T>G 4,2 Prøve nr T>G 4,3 Procent mutation i panelmedlem til opnåelse af et niveau på 95 % "Mutation Detected" med 50 ng DNA-input per reaktionsbrønd (N=24 bestemmelser) Dette forsøg viser, at cobas EGFR-mutationstesten kan detektere mutationer i EGFR exon 19 og 21 med et mutationsniveau på mindst 5 % ved hjælp af et standard input på 50 ng per reaktionsbrønd. Korrelation til referencemetode Sammenligningstest af 201 FFPET NSCLC-prøver ved hjælp af hver af 2 lot cobas EGFR-mutationstest og 2X bidirektionel sekventering (Sanger) blev udført for at bestemme den positive, negative og samlede procentvise overensstemmelse mellem metoderne. Afvigende resultater mellem cobas EGFR-mutationstesten og Sanger blev testet ved hjælp af 454-sekventering for at løse uoverensstemmelserne. Prøver, der gav ugyldige resultater med cobas EGFR-mutationstesten og/eller Sanger, blev udelukket fra analyse. Resultaterne for cobas EGFR-mutationstesten betragtes som ugyldige, hvis et eller flere mutations-calls rapporteres som "invalid" (tabel 2). Sanger-resultater betragtes som ugyldige, hvis et eller flere af de fire exons for en prøve ikke kan give gyldige resultater. cobas EGFR-mutationstest og Sanger-resultater Ud af de 201 prøver, der blev evalueret i sammenligningen, kunne 49 ikke evalueres for overensstemmelse, fordi den ene eller begge metoder gav ugyldige resultater. 48 prøver var ugyldige for Sanger (23,8 %), 6 prøver var ugyldige for cobas EGFR-mutationstest lot 1 (3,0 %) og 5 prøver var ugyldige for cobas EGFR-mutationstest lot 2 (2,5 %). Fordelingen af de ugyldige resultater for hver af metoderne kan ses i tabel 5. Tabel 5 Fordeling af ugyldige resultater for de forskellige metoder cobas EGFR-mutationstest Ugyldige prøver efter metode Lot 1 Lot 2 Kun ugyldig ved Sanger Kun ugyldig ved cobas 1 1 Ugyldige ved Sanger og cobas 5 4 I alt DA 16 Doc Rev. 1.0

17 Sammenligningen af de 152 gyldige resultater for Sanger og cobas EGFR-mutationstesten vises i tabel 6. Tabel 6 Overensstemmelsesanalyse for cobas EGFR-mutationstest (per lot) vs. Sanger cobas Lot 1 Sanger Sanger MD MND I alt MD MND I alt MD MD cobas MND Lot 2 MND I alt I alt Positiv overensstemmelse = 95,8 % (95 % CI = 88,3 til 99,1 %) Positiv overensstemmelse = 95,8 % (95 % CI = 88,3 til 99,1 %) Negativ overensstemmelse = 97,5 % (95 % CI = 91,3 til 99,7 %) Negativ overensstemmelse = 97,5 % (95 % CI = 91,3 til 99,7 %) Samlet overensstemmelse = 96,7 % (95 % CI = 92,5 til 98,9 %) Samlet overensstemmelse = 96,7 % (95 % CI = 92,5 til 98,9 %) MD: Mutation detekteret MND: Mutation ikke detekteret Sammenfaldet mellem cobas EGFR-mutationstesten vs. Sanger var 96,7 % (i alt 5 afvigende resultater) for lot 1 og 96,7 % (i alt 5 afvigende resultater) for lot 2. Sammenligningen mellem cobas EGFR-mutationstesten og Sanger evaluerede seks targets for hver prøve. Der blev udført i alt 912 calls baseret på resultaterne fra de 152 gyldige prøver. Tabel 7 og tabel 8 viser sammenligningen mellem cobas EGFRmutationstesten og Sanger på en per call-basis henholdsvis for lot 1 og lot 2. To gyldige prøver var afvigende mellem lot 1 og lot 2 i cobas EGFR-mutationstesten: Én prøve havde et Exon 20-insertion-call for lot 1 og et MND-call for lot 2. Den anden prøve havde et Exon 19-deletion-call for lot 2 og et MND-call for lot 1. Tabel 7 Sammenligning per call af cobas EGFR-mutationstest (Lot 1) vs. Sanger cobas Lot 1 Sanger G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND Andet I alt G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND * 837 I alt * Sanger-resultatet for én prøve var G719D, en mutation som cobas EGFR-mutationstesten ikke retter sig mod. Med henblik på analysen blev denne prøve kategoriseret som MND for begge metoder DA 17 Doc Rev. 1.0

18 Tabel 8 Sammenligning per call af cobas EGFR-mutationstest (Lot 2) vs. Sanger Sanger G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND Andet I alt G719X Ex 19 Del S768I cobas Ex 20 Ins Lot 2 T790M L858R MND * 837 I alt * Sanger-resultatet for én prøve var G719D, en mutation som cobas EGFR-mutationstesten ikke retter sig mod. Med henblik på analysen blev denne prøve kategoriseret som MND for begge metoder. Analyse af afvigende resultater med 454-sekventering Baseret på sammenligningsresultaterne i forhold til Sanger var 5 prøver gyldige og afvigende for hvert lot af cobas EGFRmutationstesten. Prøver, der gav afvigende resultater mellem cobas EGFR-mutationstesten og Sanger, blev analyseret med 454- sekventering og vises i tabel 9. En revideret overensstemmelsesanalyse blev udført baseret på 454-sekventeringsresultaterne. I denne analyse blev prøver med 454-sekventeringsresultater, der var i overensstemmelse med cobas EGFR-mutationstestens resultater, betragtet som overensstemmende. Prøver med 454-sekventeringsresultater, der var i overensstemmelse med Sanger, blev betragtet som afvigende. Tabel 9 Løsning af afvigende prøver med 454-sekventering Prøve Sanger cobas Lot 1 cobas Lot bestemmelse Prøve 1 G719A MND MND MND Prøve 2* G719S MND MND G719S (1,1 % mutation) Prøve 3 Ex 19 Del MND MND MND Prøve 4** MND MND Ex 19 Del Ex 19 Del (3,0 % mutation) Prøve 5 MND Ex 20 Ins Ex 20 Ins Ex 20 Ins (12,9 % mutation) Prøve 6 MND Ex 20 Ins MND MND * Prøve 2 blev bekræftet som G719S med 454-sekventering med 1,1 % mutation. Dette er under detektionsgrænsen for cobas EGFRmutationstesten. **Prøve 4 blev bekræftet som Exon 19-deletion med 454-sekventering med 3,0 % mutation. Dette er ved eller tæt på detektionsgrænsen for cobas EGFR-mutationstesten. Efter løsning af de prøver, der var afvigende i cobas EGFR-mutationstesten vs. Sanger, med 454-sekventering, var den samlede overensstemmelse på tværs af alle mutationsklasser, som analysen er rettet mod, 98,7 % for lot 1 og 99,3 % for lot 2 af cobas EGFRmutationstesten som vist i tabel 10. Tabel 10 Overensstemmelsesanalyse af cobas EGFR-mutationstesten (per lot) vs. Sanger med løsning af afvigende resultater med 454-sekventering cobas Lot 1 Sanger, løst ved hjælp af 454-sekventering Sanger, løst ved hjælp af 454-sekventering MD MND I alt MD MND I alt MD MD MND cobas Lot 2 MND I alt I alt Positiv overensstemmelse = 98,6 % (95 % CI = 92,4 til 100 %) Positiv overensstemmelse = 98,6 % (95 % CI = 92,5 til 100 %) Negativ overensstemmelse = 98,8 % (95 % CI = 99,3 til 100 %) Negativ overensstemmelse = 100 % (95 % CI = 96,3 til 100 %) Samlet overensstemmelse = 98,7 % (95 % CI = 95,3 til 99,8 %) Samlet overensstemmelse = 99,3 % (95 % CI = 96,4 til 100 %) DA 18 Doc Rev. 1.0

19 Tabel 11 og 12 viser sammenligningen af cobas EGFR-mutationstesten og Sanger med løsning af afvigende resultater med 454- sekventering på en per call-basis for henholdsvis lot 1 og lot 2. Tabel 11 Sammenligning per call af cobas EGFR-mutationstest (Lot 1) vs. Sanger med løsning af afvigende resultater med 454-sekventering cobas Lot 1 Sanger, løst ved hjælp af 454-sekventering G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND Andet I alt G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND * 837 I alt * Sanger-resultatet for én prøve var G719D, en mutation som cobas EGFR-mutationstesten ikke retter sig mod. Med henblik på analysen blev denne prøve kategoriseret som MND for begge metoder. Tabel 12 Sammenligning per call af cobas EGFR-mutationstest (Lot 2) vs. Sanger med løsning af afvigende resultater med 454-sekventering cobas Lot 2 Sanger, løst ved hjælp af 454-sekventering G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND Andet I alt G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND * 837 I alt * Sanger-resultatet for én prøve var G719D, en mutation som cobas EGFR-mutationstesten ikke retter sig mod. Med henblik på analysen blev denne prøve kategoriseret som MND for begge metoder DA 19 Doc Rev. 1.0

20 Inklusivitet med plasmider cobas EGFR-mutationstesten har vist sig at kunne detektere de mutationer, der ses i tabel 13. Tabel 13 Mutationer, der detekteres af cobas EGFR-mutationstesten Exon 18 mutations-call G719X Mutation Aminosyreændring COSMIC ID 2155 G>A G719S G>T G719C G>C G719A 6239 Exon 19 mutations-call Exon 19-deletion Mutation Aminosyreændring COSMIC ID 2235_2249del15 E746_A750del _2250del15 E746_A750del _2257del18 L747_P753>S _2254del15 L747_T751del _2256del18 L747_S752del _2251>C L747_T751>P _2251del15 E746_T751>A _2255>T E746_S752>V _2248TTAAGAGAAG>C E747_A750>P _2253del15 L747_T751del _2247del9 L747_E749del _2252>AAT E746_T751>I _2253del18 E746_T751del _2254del18 E746_S752>A _2255del18 E746_S752>D _2248>GC L747_A750>P _2252>GCA L747_T751>Q _2258>CA L747_P753>Q _2251del12 L747_T751>S _2247del15 K745_E749del _2276del24 S752_I759del _2248>AATTC E746_A750>IP _2252>T E746_T751>V _2251>AATTC E746_T751>IP _2255>AAT E746_S752>I _2253>TTGCT E746_T751>VA _2257>TCT E746_P753>VS _2252del15 L747_T751del _2256>CAA L747_S752>Q DA 20 Doc Rev. 1.0