Laboratoriekursus 2013

Transkript

1 Laboratoriekursus 2013 Øvelsesvejledninger Biologi B VUC Århus, HF-afdelingen Bülowsgade 68, 8000 Århus C På kursusdagene kan du få fat på os på telefon

2 Indholdfortegnelse: Velkomstbrev side 3 Vejledning i rapport og journalskrivning side 4-5 Øvelsesvejledninger: Øvelse nr. 1: Bestemmelse af primærproduktionen side 6-9 Øvelse nr. 2: Forsøg med osmose i kartofler side Øvelse nr. 3: Metode til påvisning af stivelse og maltose side Øvelse nr. 4: Forsøg med enzymet spytamylase side Øvelse nr. 5: Bestemmelse af kondital side Øvelse nr. 6: Måling af blodglukose ved indtagelse af kulhydrater side Øvelse nr. 7: Diagnosticering af sygdommen seglcelleanæmi side Øvelse nr. 8: Elisatest påvisning af m kyssesyge side Øvelse nr. 9: Mitosen - den almindelige celledeling side

3 Kære selvstuderende i biologi. Vi ønsker dig velkommen på laboratoriekursus på VUC Århus. Kurset afholdes i biologilokale SJ 21, som er beliggende i VUC's bygning Sct. Joseph Bülowsgade 68, 8000 Århus C Om kurset: Laboratoriekurset omfatter den eksperimentelle del i faget biologi B og er en forudsætning for at blive indstillet til prøve i faget. For at få udstedt et kursusbevis kræver det, at du har udført alle forsøgene på kurset, at dine rapporter lever op til de krav der stilles i rapporten og at rapporterne afleveres rettidigt - afleveringsfristerne meddeles på kurset. Til eksamen, på din egen skole, skal du huske at medbringe de rettede rapporter, dine journaler og dit kursusbevis. Kursusmaterialet indeholder: En vejledning i rapportskrivning En Vejledning til hver øvelse Først i hver øvelsesvejledning finder du et punkt kaldet "relevant baggrundsstof" her henvises der til den teori, det kan være relevant at sætte sig ind i, inden du skal lave øvelsen. Bagest i hver vejledning finder du en "rapportvejledning", der giver dig en disposition til hvad din rapport bør indeholde. Forberedelse til kurset: Det forventes at du inden kurset har printet kursusmaterialet ud og medbringer dette på kurset. Og at du til de enkelte kursusdage forbereder dig til forsøgene dvs. som et minimum læser dine øvelsesvejledninger og sætter dig grundigt ind i hvordan forsøgene skal udføres. Husk også at laboratoriekurset er et godt tilbud til at få diskuteret faglige spørgsmål undervejs. På kurset skal du medbringe: Dit kursusmateriale, lærebog, lommeregner, blyant og papir. Da kurset afholdes en weekend er der desværre ikke mulighed for at købe mad på stedet. Det er derfor en god ide at medbringe en madpakke eller du kan købe mad i nærheden. Der er både en kiosk og et pizzaria. Kaffe og te laver vi selv og skolen har også en mikrobølgeovn. Hvis porten til skolen er låst når du ankommer eller hvis du er blevet forsinket kan du kontakte kursets lærere på tlf Med venlig hilsen Biologilærerne på VUC Århus 3

4 Vejledning i rapportskrivning. I forbindelse med det eksperimentelle arbejde udarbejdes der rapporter over de udførte forsøg. Rapporten er en skriftlig formidling af et eksperimentelt arbejde til en modtager. Rapporten skal derfor være formuleret præcist, og den skal være saglig og objektiv. Læseren er dig selv og læreren. Rapporten skal skrives så begge parter hurtigt forstår indholdet - også lang tid efter det pågældende forsøg er lavet. (Rapporterne skal bl.a. bruges i eksamenssituationen). For at kunne skrive en fyldig rapport skal man have gjort personlige notater under udførelsen af et forsøg. Disse personlige notater er kun til en selv og behøver derfor ikke være så formfuldendte, men dog alligevel så klare og tydelige at de giver et godt grundlag for rapporten. Heri nedskrives fremgangsmåde, eventuelle ændringer i forhold til vejledningen, kladde til resultater (gerne i skemaform), stikord om resultaterne og eventuelle spørgsmål og konklusioner man kommer i tanke om undervejs. Ofte vil det være en god idé at styre notaterne efter de samme punkter som en rapport senere skal bygges op over. En biologirapport skal give læseren svar på følgende: Hvad har vi undersøgt? Hvordan er forsøget udført? Hvilke resultater er der kommet ud af det? Hvilken betydning kan det have? Rapporten opbygges efter nedenstående punkter i den angivne rækkefølge: Forsøgets titel: Der laves en forside med forsøgets titel, nummer, navn og holdnummer. Hvis I arbejder flere sammen skrives gruppens navne på. Forsøgets formål: Her noteres formålet med forsøget. Ofte vil der være en hypotese, der skal afprøves, men formålet kan også være at anvende noget specielt apparatur. Forsøgets hypotese: Ofte kan det være godt at formulere en eventuel hypotese som et selvstændigt afsnit. Teori til forsøget: I dette afsnit skal du i en kortfattet form præsentere den teori der hører til forsøget. Undlad at skrive afsnit direkte af fra lærebogen, prøv i stedet selv at formulere teorien i dit eget sprog. Husk også at præsentere de centrale begreber, der knytter sig til emnet. Materialer: Under dette punkt anføres hvilke dyr/planter der er anvendt, hvilke kemikalier der er brugt samt anvendt apparatur. Hvis der ikke er afvigelser fra den udleverede øvelsesvejledning, kan du nøjes med at henvise hertil (husk at vedlægge vejledningen). 4

5 Fremgangsmåde: Under dette punkt beskrives, hvordan forsøget er udført. Gør det kort og klart og i logisk rækkefølge. Skriv hvad du/ gruppen har gjort, dvs. brug jeg form. Det kan i mange tilfælde være en fordel at tegne forsøgsopstillingen for at gøre tingene mere overskuelige. Resultater: Alle iagttagelser og målinger (data) skal naturligvis med i rapporten.i det omfang det er rimeligt, skal resultaterne af hensyn til overskueligheden anføres i skemaform, tabelform og i kurveform. Afbildning af resultater/kurvetegning: - Giv figurer og tabeller en titel, samt en kort tekst, der fortæller, hvad kurven viser. - Ved tegning af kurver vælges en hensigtsmæssig inddeling af akserne. - Angiv benævnelse og enheder på alle akser. - Markér punkterne tydeligt på kurven, afvigende resultater skal også anføres. - Få punkter forbindes med rette linjer - mange punkter tegnes som blød kurve. - Hvis værdier mangler stiples linjen. - To kurver der skal sammenlignes bør altid have samme inddeling. Fejlkilder: Her anføres overvejelser om fejlkilder og usikkerheder under forsøgets udførelse. Ideer til forbedringer eller udvidelse af forsøget kan ligeledes beskrives her. Diskussion: Under dette punkt diskuteres forsøgsresultaterne (både de forventede og de uventede). Dette gøres ved, at man analyserer og tolker de opnåede resultater. Du bør besvare følgende spørgsmål: Har forsøget vist, hvad man teoretisk kunne forvente (er hypotesen bekræftet)? Er formålet/formålene med forsøget blevet opfyldt? Kan fejlkilder forklare eventuelle afvigelser? Er alle nødvendige kontrolforsøg blevet udført? Ofte indeholder den trykte vejledning nogle diskussionsspørgsmål, der skal besvares. Sådanne spørgsmål skal tjene som inspiration og skal derfor ikke besvares med ja/nej, men indgå i en samlet diskussion af data. Konklusion: Som afslutning på rapporten anføres den konklusion, som kan drages ud fra forsøgsresultaterne. Ofte vil det være en stillingtagen til den hypotese, som blev efterprøvet i forsøget. Mens diskussionen er fyldig og bredt formuleret, skal konklusionen være kortfattet og formuleret så præcist som muligt. Konklusionen skal være en konklusion på det der var forsøgets formål. Litteratur: Her anføres den litteratur, der har været anvendt ved udarbejdelse af såvel forsøget som rapporten. 5

6 Eksperiment nr.: Bestemmelse af primærproduktionen ved O 2 - metoden Rapporten er udført af: I samarbejde med: Dato: Rettet af: 6

7 Øvelsevejledning: Bestemmelse af primærproduktionen ved O 2 - metoden. Relevant baggrundsstof: Fotosyntese og respiration, planternes primærproduktion. Teori: Grønne planter er i stand til at danne glukose ud fra kuldioxid og vand, samt energi i form af sollys. Dette foregår i planternes grønkorn ved processen fotosyntese. Planterne optager kuldioxid gennem deres spalteåbninger, som oftest sidder på undersiden af bladet. Vand optages gennem rødderne sammen med de næringssalte planten har brug for, til at danne alle de organiske stoffer der indgår i dens opbygning. Hos vandplanter er den mest anvendte kulstofkilde HCO 3 -. Hydrogencarbonat-ionen fremkommer når CO 2 opløses i vand (kulsyres ligevægtssystem). At vandplanterne kan udnytte hydrogencarbonat-ionen til fotosyntesen skyldes, at de har et enzym der katalyserer processen: 2 HCO 3 - CO 2 + CO H 2 O den frigjorte CO 2 udnyttes herefter til fotosyntesen. Da planterne er første led i en fødekæde, kaldes de for primærproducenter. Planter har imidlertid brug for energi til forskellige livsprocesser, den får de ved at udføre en respiration. Respirationsprocessen foregår i plantens mitochondrier, som ligger i cellens cytoplasma. Ved respirationen kan planten ved brug af glukose og ilt frigøre energien i glukosen. Fotosyntesen : 6CO 2 +6H 2 O +lysenergi C 6 H 12 O 6 +6O 2 Respirationen : C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O + energi i form af ATP Bemærk fotosyntesen er en opbygningsproces, hvor der opbygges organiskstof i form af glukose, mens respirationen er en nedbrydningsproces, hvor den dannede glukose nedbrydes og omsættes til energi i form af ATP. ATP, Adenosin-Tri-Phosfat er den universelle energiform i cellen. Den totale mængde organisk stof, som planten har dannet ved fotosyntesen kaldes bruttoprimærproduktionen (BPP). Den del af produktionen, der er tilbage når planten har brugt energi til egne livsprocesser ved respiration (R), kaldes nettoprimærproduktionen (NPP). Det er således nettoprimærproduktionen som kan føres videre i fødekæden. Primærproduktionen opgives ofte pr. tidsenhed (år) og pr. arealenhed (km 2 ). Følgende sammenhæng haves: BPP = NPP + R, NPP kaldes også for tilvæksten 7

8 Formål: At bestemme en vandplantes primærproduktion i løbet af et døgn, samt iagttage under hvilke forhold planten udskiller O 2 og optager O 2. Materialer: Til forsøget benyttes vandplanter, da disse er lettere at arbejde med. Vandplanter har ingen spalteåbninger, da bladpladerne kun er få cellelag tykke. Læg eventuelt et blad under mikroskopet og se på grønkorn og cytoplasmastrømninger. to portioner afvejet vandplante (Elodea) tre Bluecap flasker 500ml vand fra hanen evt. mineralvand (CO 2 ) iltmåler staniol stor plastikspand med vand Metode: Til at bestemme en plantes primærproduktion i et soldøgn, vil vi benytte den såkaldte O 2 -metode. Metoden forudsætter at planten optager O 2 fra vandet til sin respiration og udskiller O 2 ved sin fotosyntese. Ændringen i vandets oxygenindhold, fra start til slut, kan på den måde føre frem til en værdi for plantens nettoprimærproduktion og respiration. Der opstilles tre forsøg: Forsøg Plante Vand CO 2 Lys O 2 indhold start O 2 indhold slut kontrolflaske + + lysflaske mørkeflaske Der måles iltindhold inden flaskerne lukkes. Flaskerne skal lukkes så der ikke er luftlommer, dette gøres ved at skrue hætten på under vand. Stil flaskerne i samme miljø (lys i 12 timer et soldøgn). Beregning: Følgende sammenhæng gælder: BPP = NPP + R, hvor man kan finde: NPP = lysflaske/slut lysflaske/start (mg O 2 /liter ) R = mørkeflaske/start mørkeflaske/slut (mg O 2 /liter) Det er nu muligt at omregne mængden af oxygen til milligram glukose ud fra følgende sammenhæng: 6CO 2 + 6H 2 O + lysenergi C 6 H 12 O 6 + 6O 2 264g/mol 108g/mol 180g/mol 192g/mol Ud fra fotosynteseligningen og de forskellige reaktanter- og produkters molmasse, finder vi at 1g oxygen udskilt ved fotosyntesen svarer til 0,94g glukose da forholdet mellem dem er 180g/mol :192g/mol = 0,94. 8

9 Rapportvejledning: Teori: Nævn forskellige forhold, der har betydning for primærproduktionens størrelse. Hvilke næringsalte har planterne behov for og hvad bruger planten dem til? Hvor meget energi går der til plantens vækst og til dens nødvendige livsprocesser? Hypotese: Hvad forventer du der vil ske med O 2 indholdet i de tre forsøgsflasker. Materialer/metode: Skriv kun hvis der er ændringer i forhold til øvelsesvejledningen. ændringer Resultatbehandling: Opstil et skema med forsøgsresultaterne. Beregn NPP udtrykt som mg O 2 produceret/gram plante/soldøgn. Beregn R udtrykt som mg O 2 produceret/gram plante/soldøgn. Beregn BPP udtrykt som mg O 2 produceret/gram plante/soldøgn. Omregn den mængde oxygen, der er et udtryk for NPP, til mængden af glukose produceret pr.gram plante i et soldøgn. Udregn NPP (i gram glukose pr.gram plante) på årsbasis, idet du antager at fotosyntesen kan finde sted i 240 dage på et år. Beregn hvor stor en procentdel af energien (proportional med mg O 2 ) der er gået til plantens respiration henholdsvis nettoprimærproduktion. Diskussion: 1. Forklar hvilke processer der er foregået i de to glas med planter 2. Hvorfor er det nødvendigt at afveje plantematerialet? 3. Hvorfor må der ikke være luftlommer i glassene ved start? 4. Hvorfor laver vi forsøget med vandplanter? 5. Hvor stor en procentdel udgør den energi der går til henholdsvis respirationen og tilvæksten (NPP) Stemmer de fundne resultater overens med de teoretiske værdier? Konklusion: Fejlkilder: Er der fejlkilder i dette forsøg? 9

10 Eksperiment nr.: Forsøg med osmose Rapporten er udført af: I samarbejde med: Dato: Rettet af: 10

11 Øvelsesvejledning: Forsøg med osmose Relevant baggrundsstof: Plantecellens opbygning, cellemembranens opbygning og transportformer gennem cellemembranen. Teori: Alle celler er afgrænset af en cellemembran. Membranen er fortrinsvis opbygget af fedtstoffer (fosfolipider) og proteiner og er karakteriseret ved, at den kun tillader visse stoffer at passere igennem (kaldes semipermeabel). Cellemembranens egenskaber gør det muligt for cellen at opretholde et indre miljø, der er forskelligt fra omgivelserne. Forskellige opløste stoffer kan bevæge sig gennem membranen på forskellig måde afhængig af deres størrelse eller andre egenskaber. Man taler her om forskellige transportformer gennem membranen. En af de mekanismer der driver stoffer gennem membranen er diffusion. Ved diffusion forstår man molekylernes egenbevægelse gennem membranen. Denne bevægelse er ikke retningsbestemt, men generelt vil et stof bevæge sig fra et sted med høj koncentration af det pågældende stof mod et sted med lav koncentration af stoffet. Molekylerne bevæger sig ad en koncentrationsgradient fra høj til lav koncentration. Et eksempel kunne være diffusionen af ilt fra lungerne til blodet. En særlig form for diffusion er bevægelse af vand gennem en cellemembran, dette fænomen kaldes for osmose. Forestil dig en celle omgivet ferskvand Cellens indre (cytoplasma) består af vand med opløste stoffer - det kan være sukker, salte eller proteiner. Da molekylerne i cytoplasmaet er for store til at gå gennem membranen, vil der ske det at vandet udenfor cellen vil bevæge sig gennem membranen. Da vandet bevæger sig ved hjælp af diffusion, vil vandets nettobevægelse være fra den side af membranen hvor koncentrationen af vand er høj til den side, hvor koncentrationen af vand er lav. Man siger vandet har bevæget sig ved osmose. Den mængde vand, der kan passere over membranen vil være bestemt af, hvor stor en koncentration der er af "osmotisk aktive stoffer" på de to sider af membranen. Med osmotisk aktive stoffer menes der stoffer, som ikke uden videre kan passere cellemembranen. Det tryk der opstår som følge af forskellen i koncentrationen af opløste stoffer på de to sider af cellemembranen kaldes det osmotiske tryk. Formål: At påvise osmosefænomenet - vands diffusion fra en højere til en lavere koncentration af vand. At undersøge hvilken sammenhæng, der er mellem vand-/salt-koncentration og vægtændringerne i vores kartoffel. At undersøge hvilken koncentration af salt, der modsvarer koncentrationen inde i kartoffelcellerne. At beregne det osmotiske tryk i en kartoffelcelle. 11

12 Materialer: Kartofler, propbor (evt. kniv), saltopløsninger med forskellige koncentrationer, analysevægt, køkkenrulle, reagensglas (evt. små bægerglas). Fremstilling af saltopløsninger: Saltopløsningerne laves som fortyndinger af den mest koncentrerede opløsning, nemlig 8% saltopløsningen. Af denne 8 % stamopløsning laves 1 L (= 1000 ml) ved at opløse 80 gram salt (NaCl) i demineraliseret vand til det samlede rumfang er i alt 1L. Fortyndingerne foregår derefter efter skemaet: koncentration af færdig saltopløsning der skal bruges følgende rumfang 8% saltopløsning 0% 0,0 ml 250 ml 0,5% 15,6 ml 250 ml 1,0% 31,3 ml 250 ml 1,5% 46,9 ml 250 ml 2,0% 62,5 ml 250 ml 2,5% 78,1 ml 250 ml 3,0% 93,8 ml 250 ml 4,0% 125,0 ml 250 ml 6,0% 187,5 ml 250 ml 8,0% 250,0 ml en ukendt opl. der fortyndes op til et rumfang på i alt Metode: Hvert hold laver et antal propborkerner eller homogene kartoffelstykker svarende til antallet af saltopløsninger. Hvert af kartoffelstykkerne vejes omhyggeligt (3 decimaler), hvorefter de kommes ned i hvert sit reagensglas med hver sin saltkoncentration. Kartoflen dækkes med 20 ml saltopløsning i hvert glas. NB! Vægten af de enkelte kartoffelstykker noteres ned sammen med den saltkoncentration de hver især udsættes for. Glassene med kartoffelstykkerne står nu i køleskabet - overdækket med plastfilm eller lignende i et døgn. Herefter fiskes de op af glassene og vejes efter kort at have ligget til afdrypning (ikke klemme) på et stykke køkkenrulle. Resultatbehandling: Vægtændringen i % beregnes: (vægt efter - vægt før) vægt før x 100% Vægtændringen i % indskrives i en tabel og afbildes i et koordinatsystem med den procentiske vægtændring som funktion af saltkoncentrationen. Hvor X-aksen =saltkoncentration i % og Y- aksen= vægtændring. 12

13 Den saltkoncentration, der modsvarer koncentrationen af osmotisk aktive stoffer inde i kartoffelceller bestemmes ud fra grafen. Kaldes også for den isotoniske saltopløsning. Beregning af det osmotiske tryk i kartoffelcellerne: Ved hjælp af nedenstående formel kan det osmotiske tryk (Ψ) i en kartoffelcelle bestemmes: Ψ = i C R T, hvor i = 1,9 (en konstant for en næsten ideal opløsning) R= 0,0821 L atm K -1 mol -1 (gaskonstanten) T= 298K (temperaturen i Kelvingrader) C er den molære koncentrationen af NaCl ( M NaCl = 58,5 g/mol ) Den molære koncentration, C, beregnes ud fra den isotoniske saltopløsning som: % salt opløsning aflæst omregnet til gram salt / liter M NaCl 13

14 Rapportvejledning: Teori: Beskriv hvad der vil ske med en celle under følgende forhold: Cellen placeres i en vandigopløsning hvis koncentration af opløste stoffer er højere end inde i cellen (hypertonisk opløsning) Cellen placeres i en vandigopløsning hvis koncentration af opløste stoffer er lavere end inde i cellen (hypotonisk opløsning) Cellen placeres i en vandigopløsning der netop svarer til cellen egen koncentration af opløste stoffer (isotonisk opløsning) Hypotese: Formuler ud fra ovenstående teori en hypotese til forsøget. Resultater: Tegn grafen og aflæs ved hvilken saltkoncentration opløsningen er isotonisk. Find ligeledes koncentrationen af den "ukendte opløsning". Diskussion / konklusion: Hvor stort var det osmotiske tryk i cellen? Gør rede for hvorfor plantecellen er i stand til at modstå så et højt tryk? Forklar hvordan koncentrationen af opløste næringssalte i jorden har betydning for plantens evne til at optage vand gennem rodnettet. Diskuter princippet bag saltning/syltning ved konservering af fødevarer. Har du forslag til udvidelse/ændringer af forsøget? 14

15 Eksperiment nr.: Metode til påvisning af stivelse og maltose Rapporten er udført af: I samarbejde med: Dato: Rettet af: 15

16 Øvelsesvejledning: Metode til påvisning af stivelse og maltose. Relevant baggrundstof: kulhydraters opbygning, enzymer og fordøjelsesprocessen. Teori: Når vi i kosten indtager kulhydrater, skal disse spaltes inden kroppen kan udnytte dem. Denne spaltning er en del af vores fordøjelse. Spaltningen af kulhydrater starter allerede i mundhulen, hvor der med udskillelsen af spyt også tilsættes et enzym, spytamylase. Da fødens opholdstid i munden er begrænset fortsætter fordøjelsen af kulhydrater, når føden kommer ned i tolvfingertarmen og tyndtarmen, hvor der udskilles en række enzymer, som nedbryder kulhydraterne til den mindste enhed nemlig monosakkarider. Føden indeholder forskellige typer af kulhydrater: Monosakkarider: Simple sukkerarter som består af et sukkermolekyle f.eks.glukose, fruktose og galaktose. Disakkarider: Sukkerarter der er opbygget af to monosakkarider, f.eks. maltose (2 glukose), sakkarose (glukose+fruktose) eller laktose (glukose + galaktose) Polysakkarider: Er store molekyler der er opbygget af mange tusinde glukose molekyler f.eks. stivelse (amylose) og cellulose (kostfibre/plantecellevægge). Karakteristisk for de simplekulhydrater er, at de smager sødt mens polysakkariderne ikke rigtig smager af noget - tænk selv efter! Formål: Når man laver forsøg med enzymer, har man brug for at kunne påvise, at en spaltning har fundet sted f.eks. i forbindelse med nedbrydning af stivelse. Stivelse + spytamylase maltose maltose + maltase 2 glukose substrat enzym produkt substrat enzym produkt Øvelsens formål er at afprøve en metode til påvisning af forskellige kulhydrater. Resultatet af dette forsøg kan benyttes, hvis man arbejder med enzymet spytamylase. Spytamylase spalter stivelse til maltose. Bemærk: De fleste enzymer navngives efter ordstammen til den forbindelse eller reaktion de deltager i, tilføjet endelsen -ase, f.eks. spalter enzymet maltase kulhydratet maltose. Materialer: 16

17 10 små reagensglas 1% stivlesesopløsning En glasspatel til omrøring 1% maltose-opløsning En gryde med kogende vand JJK-opløsning (jod-jod-kalium) Et bægerglas til spyt Benedict- opløsning En pipette Metode: TEST FOR STIVELSE: Opstil 5 glas af følgende indhold (der tilsættes 2 ml opløsning i hvert glas): glas 1 reagens (JJK) glas 2 vand, glas 3 stivelse, glas 4 maltose, glas 5 spyt. Noter farven på glassets indhold og tilsæt JJK til glassene 1-5. Noter farven efter reaktion. Glas nr. Indhold Farve start (uden JJK) Farve slut (med JJK) 1 JJK 2 Vand+JJK 3 Stivelse +JJK 4 Maltose + JJK 5 Spyt+JJK TEST FOR MALTOSE: Opstil dernæst 5 glas med følgende indhold: glas 1 reagens (Benedict ) glas 2 vand, glas 3 stivelse, glas 4 maltose, glas 5 spyt. Tilsæt Benedict til opløsningerne og noter farven på glassets indhold ved start Stil glassene i varmebad og kog i ca. 1minut. Noter farven herefter. Glas nr. Indhold Benedicts farve ved start (inden kogning) 1 Benedict 2 Vand+Benedict 3 Stivelse +Benedict 4 Maltose + Benedict 5 Spyt+Benedict Benedicts farve ved slut (efter kogning) 17

18 Diskussion: 1. Hvilket af de to reagenser (JJK eller Benedict) kan bruges til at påvise stivelse og hvilken farve får prøven? 2. Hvilket reagens kan bruges til at påvise maltose og hvilen farve får prøven? 3. Antag vi har opstillet et forsøg, hvor man har haft et glas med stivelse og spytamylase (spyt). Forklar hvad der vil ske i glasset og hvilken farve man vil få ved test for stivelse og test for maltose, hvis al stivelsen er blevet spaltet? 4. Hvorfor opstilles der et glas kun med spyt? 5. Hvorfor opstilles der et glas kun med vand? Konklusion: 18

19 Eksperiment nr.: Forsøg med enzymet spytamylase Rapporten er udført af: I samarbejde med: Dato: Rettet af: 19

20 Øvelsesvejledning: Forsøg med enzymet spytamylase. Relevant baggrundstof: Proteiner - og kulhydraters opbygning, enzymer og fordøjelsesprocessen. Teori: Enzymer er proteiner, som katalyserer kemiske reaktioner i den levende celle. En katalysator er i stand til at ændre den hastighed, hvormed en kemisk reaktion foregår. Det vil i praksis sige, at de forskellige kemiske reaktioner i cellen kun kan foregå, fordi der er enzymer tilstede. Enzymerne bliver ikke forbrugt under processen og fremtræder efter endt reaktion i uændret form. Et enzym er mere eller mindre specifikt og deltager kun i en eller få beslægtede processer. De fleste enzymer navngives efter ordstammen til den forbindelse eller reaktion de deltager i, tilføjet endelsen -ase, f.eks. spalter enzymet maltase kulhydratet maltose. To andre begreber er værd at kende nemlig substrat og produkt. Man kan sige, at den forbindelse som enzymet binder sig til kaldes substratet og det, der kommer ud af reaktionen kaldes produktet. Maltose + enzym 2 glukose + enzym substratet produktet Enzymerne kan opdeles i to kategorier: endoenzymer, som virker inde i cellen og ektoenzymer som udskilles af cellen og virker uden for denne (f.eks. fordøjelsesenzymerne). Enzymerne er opbygget af en eller flere kæder af proteiner. Herforuden indgår der ofte et såkaldt coenzym (ofte vitamindel) og en metalion (f.eks. Mg 2+, Mn 2+, Fe 3+ eller Zn 2+ ). apoenzym + coenzym = holoenzym proteindel vitamindel Enzymet Enzymers aktivitet afhænger af flere forskellige forhold. Typisk kan man sige, at de forhold der kan ændre et proteins struktur også vil have betydning for enzymets evne til at katalysere en reaktion. Her skal nævnes tre forhold som har betydning: temperatur, ph og tilstedeværelsen af tungmetalioner (f.eks. Hg 2+, Cd 2+ og Cu 2+ ). Både temperatur og ph har indvirkning på proteindelens struktur og tungmetalioner kan gå ind og påvirke det reaktiveområde i enzymet. Endvidere har mængden af enzym og koncentrationen af substrat selvfølgelig også betydning for reaktionshastigheden. 20

21 Formål: At undersøge forskellige faktorers indvirkning på fordøjelsesenzymet spytamylase. Enzymet findes i spyt hos mennesker og andre pattedyr og påbegynder, allerede i munden, nedbrydningen af stivelse (amylose) til simple sukkerarter (maltose). I dette forsøg undersøges hvordan temperatur, ph og kobbersulfat (CuSO 4 ) virker på enzymaktiviteten. Materialer til forsøget: Spyt (læs mundvand) 1% stivelsesopløsning Iod-iodkalium opløsning Benedictopløsning 0,1M HCl (saltsyre) 0,5M CuSO 4 ph-sticks Bægerglas til spyt reagensglas og reagensglasstativ mærkningstape, glasspatel til omrøring engangspipette til spyt termobade ved forskellige temperaturer køleskab gryde med kogende vand Metode: Forsøg med temperaturens indvirkning på enzymaktiviteten: Enzymaktiviteten undersøges ved et udvalg af temperaturer mellem 5 C og 100 C. Til hver temperatur opstilles 3 reagensglas: Glas 1 indeholder 2 ml spyt Glas 2 indeholder 4 ml stivelsesopløsning Glas 3 indeholder 4 ml stivelsesopløsning. Husk at mærke glassene med navn, nummer, indhold, m.m. temperatur navn Lad glassene stå i mindst 5 minutter og akklimatiseret ved forsøgstemperaturen. Herefter overføres de 4 ml stivelse fra glas 2 til glasset med spyt (glas1)- rør rundt. Glas 3 tilsættes ikke spyt (kontrolglas) Reaktionen får nu lov at forløbe i ca.15 minutter ved den valgte forsøgstemperatur. Afkøl de glas der har stået ved høj temperatur i et par minutter. Fordel indholdet fra hvert forsøgsglas (1-3) i to nye glas. Undersøg nu indholdet i glassene vha. Iod - og Benedict prøven som i det indledende forsøg.*) OBS: I forsøget ved 5 C er det vigtigt at lave analysen på indholdet straks, så enzymerne ikke når at blive aktive dvs. Benedictprøven sættes i spilkogende vand!!! *) Forsøg med påvisning af stivelse og maltose. 21

22 Forsøg med ph s indvirkning på enzymaktiviteten (37 C). Opstil 3 glas på følgende måde: Glas 1 indeholder 2 ml spyt + 2ml HCl Glas 2 indeholder 4 ml stivelsesopløsning Glas 3 indeholder 4 ml stivelsesopløsning. Husk at mærke glassene med navn, nummer, indhold m.m. Lad glassene stå i mindst 5 minutter og akklimatiseret ved 37 C. Herefter overføres de 4 ml stivelse fra glas 2 til glasset med spyt+ HCl (glas1) omrør og mål ph i blandingen- lad blandingen stå i 5 minutter. Glas 3 tilsættes ikke spyt (kontrolglas) Reaktionen får nu lov at forløbe i ca.15 minutter ved 37 C Fordel indholdet fra hvert forsøgsglas (1-3) i to nye glas. Undersøg nu indholdet i glassene vha. Iod - og Benedict prøven som i det indledende forsøg.*) OBS. Mål ph i opløsningen før og efter tilsætning af syren! Forsøg med kobbersulfats (CuSO 4 ) indvirkning på enzymaktiviteten (37 C). Opstil 3 glas på følgende måde: Glas 1 indeholder 2 ml spyt + 1ml CuSO 4 Glas 2 indeholder 4 ml stivelsesopløsning Glas 3 indeholder 4 ml stivelsesopløsning. Husk at mærke glassene med navn, nummer, indhold, m.m. temperatur og navn Lad glassene stå i mindst 5 minutter og akklimatiseret ved 37 C. Herefter overføres de 4 ml stivelse fra glas 2 til glasset med spyt+cuso 4 (glas1) - rør rundt og lad blandingen stå i 5 minutter. Glas 3 tilsættes ikke spyt (kontrolglas) Reaktionen får nu lov at forløbe i ca.15 minutter ved 37 C Fordel indholdet fra hvert forsøgsglas (1-3) i to nye glas. Undersøg nu indholdet i glassene vha. Iod - og Benedict prøven som i det indledende forsøg.*) I ventetiden kan du formulere en hypotese og lave resultatskema. 22

23 Rapportvejledning: Teori: Beskriv kort fødens vej gennem fordøjelsessystemet og giv eksempler på mekanisk nedbrydning og andre enzymer end dem du har arbejdet med i forsøget. Hypotese: Argumenter for hvilke resultater du forventer i de enkelte forsøg. Materialer/metode: Skriv kun hvis der er ændringer i frohold til øvelsesvejledningen. Resultater: Opstil et skema med forsøgsresultaterne Diskussion/ spørgsmål til forsøget: 1. Forklar hvordan man af forsøgsresultaterne kan se, om enzymet er aktivt eller inaktivt? 2. Gør rede for aktiviteten ved de forskellige forsøgstemperaturer og diskuter resultaterne i forhold til teorien. 3. Ved hvilken ph er enzymet spytamylase normalt aktivt? 4. Forklar hvilken betydning en ændring i ph vil have på enzymaktiviteten og gør rede for resultaterne i dit eget forsøg. 5. Hvad sker der med enzymaktiviteten, når der tilsættes CuSO 4? 6. Hvorfor er der i opstillet glas med og uden spyt ved hvert forsøg? Konklusion: Fejlkilder: Angiv her hvilke fejlkilder har haft indflydelse på dine resultater. 23

24 Eksperiment nr.: Bestemmelse af kondital Rapporten er udført af: I samarbejde med: Dato: Rettet af: 24

25 Øvelsesvejledning: Bestemmelse af kondital Relevant baggrundstof: Blodkredsløbet, lungernes opbygning og funktion, musklernes energiomsætning under arbejde, konditionstræning. Teori: Konditallet benyttes som et udtryk for hvor god kroppen er til at udføre aerobt arbejde, fx løbe eller cykle. Evnen til at udføre dette arbejde afhænger af lungernes evne til at optage luftens ilt, hjertet og kredsløbets evne til at transportere ilten ud til musklerne og musklernes evne til at udnytte den tilførte ilt ved arbejde. Forsøget bygger på den teori, at der er en lineær sammenhæng mellem de tre størrelser: iltoptagelse, pulsfrekvens og arbejdsintensitet, og konditallet beregnes som den maksimale iltoptagelse pr. minut pr. kilo legemsvægt. For at bestemme den maksimale iltoptagelse skal man finde den maksimale arbejdsintensitet, hvilket kan gøres ved at køre sig selv helt ud på kondicyklen (ergometercyklen). Der findes dog mindre anstrengende metoder, hvor man arbejder med submaksimal intensitet ( = under maksimal intensitet) og det er denne type konditest, vi skal benytte os af her. Testen udføres som en to-punktstest (men kan også udføres som en tre-punktstest, hvor cykelarbejde(max) aflæses grafisk se senere). Forsøget udføres på en kondicykel (ergometercykel). Umiddelbart inden testen skal forsøgspersonen varme op ved at cykle med meget lav belastning i 4-5 minutter. Under selve forsøget skal forsøgspersonen cykle i fem minutter på to forskellige belastninger (de kaldes arbejde 1 og arbejde 2). Kadencen skal være 60 omdrejninger pr minut (brug evt. en metronom). Den første belastning skal være således at pulsen stabiliseres i området slag/min efter ca. 5 minutters cykling. Den anden belastning skal være således at pulsen stabiliseres i området slag/min efter yderligere 5 minutters cykling Testen giver det bedste resultat, hvis de to pulsværdier ikke kommer til at ligge for tæt. Fx vil 130 og 160 være fint. Ved tre-punktstest vælges pulsværdier på: arbejde 1) slag/min, arbejde 2) slag/min, arbejde 3) slag/min, fx 120, 140 og 160 Formål: Formålet med dette eksperiment er at beregne forsøgspersonernes kondital. Materialer: Ergometercykel (kondicykel) Pulsur med tilhørende elektrode-/sender-rem pc med software til pulsur træningstøj/t-shirt 25

26 Fremgangsmåde: Cyklen indstilles, så den er behagelig at sidde/cykle på. Pulsuret og dets senderrem monteres. Senderremmen placeres om brystkassen i hjertehøjde og fugtes så der er bedst mulig kontakt med huden og det sikres at der et forbindelse mellem sender og ur (se særskilt vejledning). Pulsregistreringen startes. Forsøgspersonen varmer nu op ved at cykle i ca. 5 minutter ved lav belastning (50-75 watt afhængig af træningstilstand, vægt og køn). I samråd med læreren bestemmes første belastning ud fra køn, alder, kropsvægt og puls ved opvarmningens ophør. Belastningen indstilles på cyklen. Køn, kropsvægt, alder og belastningen noteres i nedenstående skema!! Der cykles nu i 5 minutter med den indstillede belastning. Det bestræbes at holde den samme kadence under hele eksperimentet fx 60 omdrejninger/minut. Er belastningen ikke for høj, vil pulsen nogenlunde have stabiliseret sig på en bestemt værdi efter de 5 minutter. I samråd med læreren bestemmes anden belastning. Belastningen noteres i nedenstående skema. Belastningen indstilles på cyklen og forsøgspersonen cykler nu i 5 minutter. Stabiliserer pulsen sig ikke, er belastningen måske valgt for høj. Lad forsøgspersonen hvile til pulsen er på ca. 100 slag/ min og fortsæt derefter forsøget med en lavere belastning i samråd med læreren. Der cykles nu i 5 minutter. Pulsregistreringen fortsættes endnu 5 minutter efter af cyklingen er afsluttet Pulsregistreringen afsluttes og pulsurets data overføres nu til pc en (se vejledning i laboratoriet) og de opsamlede data udskrives og vurderes. Der skal findes to stabile pulsniveauer. Et for hver arbejdsintensitet. De fundne værdier noteres i nedenstående skema. Konditallet kan nu beregnes. Forslag til resultatskema: Køn Alder Vægt kg Belastning 1. Arbejde watt Belastning 2. Arbejde watt Belastning 3. Arbejde watt Puls 1. Arbejde slag/min Puls 2. Arbejde slag/min Puls 3. Arbejde slag/min Forsøgsperson Maks.- puls. slag/min Aktivitetsniveau Beregning af kondital: Til beregningerne skal den anslåede maksimale puls bruges: maksimale puls = 208 (0,7 x alder). Herefter skal det maksimale cykelarbejde i watt findes. Det kan gøres på to måder a) ved at indsætte i denne formel (ved topunktstest): 26

27 cykelarb.(max) = b) grafisk ved at afbilde de to fundne pulsværdier som funktion af de tilsvarende arbejdsintensiteter i et koordinatsystem på et stykke millimeterpapir (ved både topunktstest og tre-punktstest). De to (tre) fundne punkter forbindes og stregen forlænges (ekstrapoleres) op til den skærer en vandret streg svarende til den beregnede maksimale puls. Fra skæringen mellem de to linjer tegnes en lodret linje ned på x-aksen. Det maksimale cykelarbejde (cykelarb.(max)) aflæses, hvor den lodrette linje skærer x- aksen. ) Det maksimale cykelarbejde (i watt) er imidlertid kun en mindre del af det maksimale arbejde kroppen udfører, da en stor del af musklernes arbejde bruges til fx gnidningsmodstanden i musklerne. Den øgede respiration og hjertets øgede aktivitet kræver også ilt. Ved cykling er den såkaldte nyttevirkning 23%. Det vil sige, at kun 23% af det arbejde musklerne udfører går til at cykle. Resten bliver til varme. Det maksimale arbejde kan derfor udregnes ud fra det maksimale cykelarbejde på følgende måde: Maksimale arbejde (i watt) = maksimale cykelarbejde (i watt) x 100/23 Det maksimale arbejde omregnes til kilojoule pr. minut (kj/min)ved at gange med 60 og dividere med 1000 (da en watt svarer til en joule pr. sekund). Maksimale arbejde (i kilojoule pr minut) = maksimale arbejde (i watt) x 60/1000 Da der for hver liter ilt, der optages i kroppen, frigives 21,1 kj, og da hvilestofskiftet svarer til et iltoptag på 0,25 liter O 2 /min, kan den maksimale iltoptagelse beregnes således: VO 2 (max) (i Liter/min) = Maksimale arbejde (i kj/min)/21,1 kj/liter + 0,25 Liter/min Den maksimale iltoptagelse pr minut omregnes til kondital ved at dividere med kropsvægten og gange med tusinde (for at få værdien i ml ilt pr minut pr kilo): Kondital (ml ilt pr minut pr kilo) = VO 2 (max)(i liter pr minut) x 1000 / kropsvægt. 27

28 Rapportvejledning: Teori: 1. Forklar kort hjertets og kredsløbets funktion og opbygning. 2. Hvorfor har de arbejdende muskler brug for rigelig blodtilførsel? Hypotese: Fremgangsmåde: Skriv kun hvis den anvendte fremgangsmåde afviger fra vejledningens. Resultater: 1. Forsøgsresultaterne skal indføres i resultatskema. 2. Udprintede pulskurver vedlægges. 3. Udregningerne af konditallet vises for en enkelt af forsøgsdeltagerne. De resterende kondital angives blot. Diskussion: 1. Vurdér forsøgspersonernes kondital i forhold til normalværdierne (skema udleveres i laboratoriet). 2. Er der en sammenhæng mellem forsøgspersonernes aktivitetsniveau og kondital? 3. Hvilken effekt vil du vurdere at rygning har på ens kondital? Begrund! 4. Hvorfor skal man dividere med kropsvægten for at finde konditallet? 5. Hvorledes kan man forbedre sit kondital? 6. Hvilken effekt tror du en forbedret kondition vil have på pulsen ved en bestemt arbejdsbelastning? Begrund! 7. Forklar pulskurvens forløb. Hvor længe er pulsen om at indstille sig på et nyt aktivitesniveau? Er der her en sammenhæng med konditallet? 8. Vurdér testens fejlkilder. 28

29 Eksperiment nr.: Måling af blodglukose-niveauet ved indtagelse af kulhydrater Rapporten er udført af: I samarbejde med: Dato: Rettet af: 29

30 Øvelsesvejledning: Måling af blodglukose-niveauet ved indtagelse af kulhydrater. Relevant baggrundsstof: kulhydraternes opbygning og fordøjelse, hormoner, regulering af blodglukosen, Glykæmisk index, diabetes. Teori: Alle kroppens celler har brug for energi blandt andet i form af glukose, især hjernen som er meget følsom, da den næsten udelukkende bruger glukose som energikilde. Endvidere er det vigtigt for cellernes indre miljø, at koncentrationen af glukose ikke svinger for meget, da glukosen er osmotisk aktiv. Når vi indtager kulhydrater nedbrydes de store kulhydrater blandt andet til glukose og fruktose, disse transporteres over i blodbanen og det er her reguleringen af blodglukosen (også kaldet blodsukkeret) starter. Efter et måltid vil koncentrationen af glukose i blodet være høj (op til 10 mmol/l) mellem måltiderne vil koncentrationen svinge mellem 3 og 6 mmol/l. Hvor meget blodglukosen stiger efter et kulhydratrigt måltid afhænger bl.a. af, hvilke typer kulhydrater man har spist, samt ens evne til at regulerer blodsukkerkoncentrationen. Tidligere troede man at stivelse var sundest, fordi den var længere tid om at blive fordøjet. Denne teori holder ikke, da der er rigeligt med fordøjelsesenzymer i tarmen. Derimod skyldes forsinkelsen snarere tilstedeværelsen af visse typer af kostfibre. Det har også vist sig at de forskellige monosakkarider ikke transporteres lige hurtigt fra tyndtarmen til blodbanen. Kartofler eller hvidt brød får således blodglukosen til at stige lige så hurtigt som ren glukose. To af de hormoner, der er ansvarlige for reguleringen af blodglukosen er insulin og glukagon. Begge hormoner produceres i bugspytkirtlens langerhanske øer i hhv. -cellerne og -cellerne. Insulin fremmer optagelsen af glukose i muskelcellerne, mens det påvirker levercellerne til at omdanne glukose til glykogen (et polysakkarid som svarer til stivelse). Glukagon virker modsat og aktiverer levercellerne til at omdanne sit depot af glykogen til glukose, når der mangler glukose i blodbanen. Foruden de to nævnte hormoner spiller hormonet adrenalin også en rolle i reguleringen af blodglukosen. Efter et måltid er koncentration af glukose i blodet høj hormonet insulin glukosen trækkes ind i muskelceller glukosen omdannes til glykogendepot i leveren Ved sult er koncentrationen af glukose i blodet lav hormonet glukagon Glykogen spaltes til glukose i levercellerne glukosen frigives til blodet 30

31 Diabetes mellitus (DM) er en fællesbetegnelse for flere forskellige stofskiftesygdomme, hvor omsætningen af blandt andet glukose ikke forløber, som den skal. Der skelnes mellem to typer af diabetes. Diabetes type-1, der kort fortalt skyldes manglende produktion af insulin i -cellerne og diabetes type-2, tidligere kendt som aldersdiabetes, der er en form for insulinresistens, som bevirker at cellerne ikke reagerer på hormonet insulin. Resultatet bliver i begge tilfældet at blodglukosen vil forblive meget høj efter et måltid, hvis ikke patienten behandles. På lang sigt udvikles en række følgesygdomme, her kan nævnes øget risiko for hjerte-karsygdom, blindhed, nyreproblemer og dårlig sårheling. Hvis en persons fasteblodglukose er over 7mmol/l eller hvis ikke-fastende blodglukose ligger over 11,1mmol/l, har personen diabetes. Et normalt faste blodglukose ligger under 5mmol/l. Diabetes kan blandt andet konstateres ved at udføre en glukosebelastningstest. Flere oplysninger om diabetes finder du på hjemmesiden: Tabel over glykæmisk indeks kan findes på: Formål: At undersøge variationen i koncentrationen i blodglukoseniveauet efter indtagelse af forskellige kulhydrater. Materialer: bagevægt forskellige kulhydratrige fødevarer apparat til måling af blodglukose glukosticks spritservietter prikkepen tabel over det glykæmiske indeks (udleveres til øvelsen) Metode: Der vælges 2-3 forsøgs personer, som møder fastende dvs. ingen mad, drikke eller røg de sidste 2-3 timer. Personernes blodglukose måles inden forsøget starter. Personerne indtager nu hver en portion kulhydratholdigt føde svarende til 1 gram kulhydrat/ kg legemesvægt (beregnes vha. kosttabel) til maden indtages samme mængde vand 2dl. Forsøgspersonerne indtager nu den udvalgte fødevare og deres blodglukose måles med intervaller på minutter i ca.90 minutter afhængig af om blodglukosen er faldet til normal niveau eller ej. 31

32 Rapportvejledning: Teori: Forklar hvorfor kroppens celler har brug for glukose og gør rede for hvor og i hvilken form glukosen kan deponeres i kroppen. Gør rede for omsætningen /forbrændingen af glukosen i forbindelse med muskelarbejde. Forklar til sidst hvad det glykæmiske indeks er et udtryk for. Hypotese: Formuler dine forventninger til forsøget - hvordan forventer du blodglukosen vil stige ved indtagelse af de valgte næringsmidler? Materialer/metode: Tilføj hvis der er ændringer i forhold til øvelsesvejledningen Resultater: Lav et skema der viser forsøgspersonernes blodglukosekoncentrationer på måletidspunkterne. Tegn en kurve over forsøgsresultaterne der viser blodglukose koncentrationen, som funktion af tiden. Diskussion: 1. Diskuter personernes blodglukosekoncentration inden forsøget starter. Forklar hvordan de forskellige forsøgsresultater ser ud og hvordan det passer med teorien om forskellige kulhydraters optagelse i blodet. 2. Kan man se, at det glykæmiske indeks har betydning for blodsukkerstigningen i de tre forsøg? 3. Hvilke kulhydrater er bedst at indtage, hvis man skal udføre et langvarigt fysisk arbejde? 4. Hvordan kan blodsukkerniveauet opretholdes f.eks. under en løbetur? 5. Analyser figurerne side 4 og forklar hvem af de to personer på figur 13 der har diabetes. Konklusion: Fejlkilder: 32

33 Figuren er hentet fra opgave 108, Biofag nr Særnummer/opgavesamling 33

34 Eksperiment nr.: Diagnosticering af sygdommen seglcelleanæmi Ved brug af DNA restriktionsanalyse. Rapporten er udført af: I samarbejde med: Dato: Rettet af: 34

35 Formålet med forsøget At undersøge genotypen hos de enkelte familiemedlemmer for derved at kortlægge barnets risiko for at få seglcelleanæmi. Relevant baggrundsstof Seglcelleanæmi Seglcelleanæmi er en arvelig sygdom, der bevirker at personens blodceller antager form som et segl, når koncentrationer af oxygen er lav. Personer med seglcelleanæmi kan ikke danne hæmoglobin af typen HbA1, i stedet dannes der et defekt hæmoglobin kaldet HbS. Seglcelleanæmi kommer kun til udtryk hos personer der er homozygote (HbS,HbS). Hos personer der er heterozygote ( HbA, HbS) ses kun det man kalder seglcelletræk idet generne er codominante. Fejlen i genet for HbA1 skyldes en punktmutation i det gen, der koder for β-kæden. På figur 2 ses, at mutationen består i en udskiftning af aminosyren glutamin med aminosyren valin. I det normale gen, er koden for aminosyrerne 5, 6 og 7 (Pro-Glu-Glu) i betakæden: CCT-GAG-GAG. Punktmutationen i sjette triplet ændrer A til T, hvilket giver følgende baserækkefølge: CCT-GTGAG. Sygdommen er dødelig og resulterer i at blodcellerne lettere klumper sammen, at de røde blodlegemers levetid er forkortet, iltforsyning til organerne er nedsat med skader på bl.a. lever, nyrer, øjne til følge. Prenatal diagnostik kan tilbydes (abort inden 12 uge er tilladt for muslimer).. fig. 1 figur 2 35

36 Figur 1 og 2 er hentet på: 36

37 DNA analyse Man kan ved brug af få celler fra et individ, udtrække DNA og via Polymerase Chain Reaction (PCR) øge mængden af DNA til videre analyse. Baggrunden for testen er at man bruger restriktionsenzymer der klipper i specifikke palindromiske sekvenser (sekvenser der kan læses i begge retninger i det dobbeltstrengede DNA). Når man i dette forsøg har valgt restriktionsenzymet MstII skyldes det, at enzymet kun klipper i det normale gens basesekvens CCTGAGGAG, og ikke den muterede sekvens CCTGTGGAG, hvor basen Adenin er udskiftet med basen Thymin. Genkendelsesstedet for Restriktionsenzymet Mstll ses her markeret med rødt CC TNAGG, hvor N kan være enhver af de fire nukleotider (T, C,G eller A). Palindromsekvensen i genet HbA. C-C T-G-A-G-G- G-G-A-C-T C-C- Pilene markerer klippestedet for MstII. Den markerede base svarer til basen betegnet N i den forklarende tekst. Restriktionsenzymer. Restriktionsenzymer er endonukleaser, som katalyserer kløvningen af phosfatbindingerne i DNA strengen. Det specielle ved restriktionsenzymerne er, at de kun klipper i helt specifikke basesekvenser. Enzymerne produceres i mange forskellige arter af bakterier og der findes i dag et katalog med over 1500 forskellige restriktionsenzymer. Enzymerne er typisk navngivet efter de organismer de er isoleret fra. Man navngiver enzymet ved hjælp af slægtsnavnet samt et romertal i tilfælde af, at flere enzymer isoleres fra samme slægt. Restriktionsenzym Organisme Bgl I Bacillus globigii Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H Eco RI Eschericia coli, strain RY 13 Eco RII Eschericia coli, strain R 245 Hae III Haemophilus aegyptius Hind III Haemophilus influenzae R 37

38 Generel vejledning til Gelelektroforese Teori om elektroforese. Agarose Gel elektroforesen som anvendes i dette forsøg udnytter at agarose gelen består af mikroskopiske porer der fungerer som et slags filter. DNA er stærkt negativ ladet ved neutralt ph. Derfor vil DNA fragmenterne vandre mod den positive pol i det elektriske felt der skabes i elektroforeseapparatet. DNA fragmenterne adskilles efter størrelse således, at de mindste stykker vandrer hurtigst. Efter elektroforesen synliggøres DNA ved farvning. Materialer DNA-prøver (seglcellegener), agarosegel, FlashBlue Flydende Stain, destilleret vand, elektroforese apparat, støbningsbakke, plast kamme, mikropipette Metode: (SE OGSÅ FORSØGSOVERSIGTEN - FLOWCHART PÅ SIDSTE SIDE) 1. Støbning af gelen. Der støbes en 0,8 % agarose gel. a. Tag støbeformen til gelen og sæt gummiklodserne på enderne. b. Placer kammen i positionen nærmest enden af formen. c. Hæld nu gelen forsigtigt ud i formen uden at der dannes luftblærer. d. Lad gelen størkne i ca. 20 minutter 2. Klargøring af gelen til elektroforese. Når gelen er størknet fjernes gummiklodserne og kammen tages forsigtigt op så prøvebrøndene ikke beskadiges. Gelen anbringes i elektroforesekarret og karret fyldes op med elektroforesebuffer gelerne skal være helt dækkede. Bemærk gelen skal være orienteret i strømretningen (minus til plus). 38

39 3. Påsætning af prøverne Med mikropipette opsuges 35 l (mikroliter/ 10-6 liter) DNA prøve. Prøven afsættes i gelens brønd i rækkefølgen A-F. Husk at skifte pipettespids for hver prøve. Når prøven skal påsættes anbringes pipettespidsen forsigtigt midt i brønden uden at røre bunden. Brønden er fyldt med buffer og princippet er, at prøven fortrænger væsken i brønden. Pipetter langsomt, så prøven ikke får mulighed for at diffundere ud i karbufferen. Metoden kaldes submarine fordi prøverne påsættes under væskeoverfladen. Læg evt. et stykke farvet papir under elektroforesekarret så brøndene træder tydeligere frem. DNA-prøver i rørene A - F har følgende indhold: 1. A DNA-prøve fra person med Seglcelleanæmi 2. B DNA-prøve fra person med seglcelletræk 3. C DNA-prøve fra en normal rask person 4. D Mors DNA-prøve 5. E Barnets DNA-prøve 6. F Fars DNA-prøve 4. Kørsel af prøverne - elektroforesen. Strømmen sluttes til elektroforeseapparatet via strømforsyningen. Forbind sort ledning til sort input( ) og rød ledning til rød input (+). Elektroforesen udføres ved: Spændingen (Volt) 70V Anbefalet tid (timer) Ca. 120 minutter Under kørslen kan man følge prøvernes vandring vha. en farvemarkør. Lad markøren vandre 3,5 4 cm inden kørslen stoppes. Når kørslen er færdig slukkes for strømforsyningen og gelerne kan tages op af karret. 39

40 5. Farvning og fremkaldelse af DNA prøverne. Farvebad med Methylen Blåt: Lav 600 ml farveopløsning (brug handsker.) 1. Tag gelen ud af formen og Læg den i en farvebakke og hæld farveopløsningen over. 2. Lad gelen stå i badet 5-20 minutter og hold væsken i bevægelse undervejs. 3. Affarv gelerne i 300 ml 37 C varmt destilleret vand to gange á 15 minutter. 4. Gelerne tages herefter op og lægges på et stykke plastikfilm eller lignende. OBS. Gelerne kan opbevares flere uger i køleskab. De mørke blå bånd vil blive synlige mod den lyseblå baggrund. Yderligere affarvning kan give bedre resultater (mere tydelige resultater). 40

41 41

42 Resultater Tag et foto af gelen eller tegn båndmønsteret af på et stykke OHP plast. Analyse af resultaterne. 1. Med udgangspunkt i din viden om nedarving af seglcelleanæmi, skal du gøre rede for, hvor mange raske gener / syge gener, du har i hver af prøverne 1-3 (kontrolforsøgene). 2. Forklar endvidere hvor mange DNA fragmenter (bånd) du vil se på gelen, hos en person med seglcelleanæmi i forhold til en person der ikke fejler noget, når DNA er klippet med restriktionsenzymet MstII dit svar skal begrundes. 3. Forklar hvilke fragmenter der vil vandre længst under elektroforesen. 4. Forklar hvorfor det er nødvendigt at have prøver med, som dem i kontrolforsøgene? 5. På baggrund af resultaterne af elektroforesen, skal du bestemme genotypen for hhv. moderen til barnet, faderen til barnet og hos det undersøgte barn dit svar skal begrundes. Forklar endvidere hvordan de undersøgte personers fænotype vil se ud. Diskussion. Ved elektroforese vandrer DNA molekylerne mod den positive pol. Find en figur af DNA molekylets opbygning og forklar, hvad der gør DNA til et stærkt negativt molekyle. Hvilke celler kan man anvende, når man ønsker at lave DNA test? Opstil et krydsningsskema der viser risikoen for at to forældre, der begge er bærere af sygdommen Seglcelleanæmi får et barn der har arvet sygdommen. Nedenfor ser du, hvor udbredt genet HbS er i verden. Det har vist sig at heterozygote personer er mere resistente over for malaria end personer med genotypen HbA,HbA. Forklar hvordan dette forhold, har været med til at øge hyppigheden af genet HbS i den Centrale Afrikanske befolkning. 42

43 43

44 Eksperiment nr.: ELISA- test - Påvisning af "Kyssesyge" Rapporten er udført af: I samarbejde med: Dato: Rettet af: 44

45 Øvelsevejledning: ELISA- test - Påvisning af "Kyssesyge". Relevant baggrundstof: Kendskab til immunforsvaret, antigener og antistoffer, mikroorganismernes opbygning (bakterier og virus). Teori: Har man mistanke om at en person er smittet med en infektionssygdom f.eks. mononukleose (kyssesyge), borrelia-bakterien (bid fra Skovflåt) eller HIV-virus, kan man benytte en antistoftest kaldet ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). ELISA-testen bruges til at undersøge om en person har dannet antistoffer mod et bestemt antigen. Et antistof kan binde sig til et specifikt antigen, denne egenskab benyttes til at påvise om en person indeholder et specifikt antigen eller et specifikt antistof. En negativ test viser, at personen ikke har dannet antistoffer mod den pågældende virus eller bakterie. En positiv test viser, at personen har dannet antistof i kroppen. Antistofferne kan inddeles i 5 forskellige klasser. To af disse er særlig interessante IgM, som optræder ved førstegangsinfektioner og IgG, der er en del af den immunologiske hukommelse. Man kan designe sin ELISA test, så der testes for både IgM og IgG. På denne måde er det muligt at afgøre om der er tale om en ny infektion eller personen er blevet smittet for længe siden. Antigener er stoffer eller organisme, som fremkalder en antistofreaktion i kroppen. Antigener er ofte fremmede proteiner, men alle fremmede stoffer kan i princippet virke som mulige antigener. Antistoffer er proteiner, som dannes af immunforsvarets celler, og deres opgave er at binde sig til indtrængende fremmedstoffer (antigener). Antistof-antigenkomplekset optages af de såkaldte makrofager. Mononukleose (kyssesyge): Infektiøs mononukleose, eller "kyssesyge", skyldes en virus ved navn Epstein-Barr virus (EBV). Det er en DNA virus som hører til gruppen af "Herpes vira", men den har intet at gøre med forkølelsessår eller genital herpes. Infektionen kaldes kyssesyge, fordi smitten overføres via inficeret spyt. Det kan ske enten ved kys eller ved luftbåren smitte. Som det gælder for andre herpesvirusinfektioner forbliver virus i kroppen resten af livet, selvom man sandsynligvis kun vil få mononukleose én gang i livet. Virus kan formentlig med mellemrum findes i spyttet og sprede smitte denne vej. Sygdommen rammer specielt 15 til 25-årige og giver influenzalignende symptomer med halsbetændelse og hævelse af lymfeknuder og milt. Sygdommen er hyppigt forekommende; mellem 80 og 90 % af voksenbefolkningen har haft sygdommen. Sygdommen er i langt de fleste tilfælde ufarlig og uden senere komplikationer. Eventuelle komplikationer til mononukleose kan være forstørret milt, forstørret lever og en udpræget træthed. I sådanne tilfælde anbefaler man, at patienten undgår hårdt fysisk arbejde og sport med kropskontakt til ca. 4 uger efter sygdomsophør, da der kan ske skader på milten. Indtagelse af 45

46 alkohol bør undlades i op til et halvt år på grund af sygdommens påvirkning af leveren. Diagnosen for mononukleose stilles ud fra de ovennævnte symptomer og sygdommens udvikling. Desuden kan lægen supplere med en podning fra halsen eller en blodprøve for påvisning af akut Epstein-Barr virus infektion (Monospot test) eller påvisning af antistoffer tydende på en tidligere infektion. Der findes ingen behandling rettet direkte mod Epstein-Barr virus. Behandlingen er derfor rettet mod sygdommens symptomer. Udover ovennævnte kendes en række andre sygdomme, som virus sættes i forbindelse med. Her kan nævnes Burkitt's lymphoma (en form for lymfekræft), kræft i næse/svælg, AIDS, autoimmunsygdomme og kronisk træthedssyndrom. Formål: Ved hjælp af ELISA-testen skal vi teste fire "hypotetiske" patienter, for mononukleose. Dette gøres ved at undersøge om patienternes "serum" indeholder immunoglobuliner af typen IgG rettet mod Eppstein-Barr virus (antigener). Serum= blodplasma, hvor størkningsfaktorerne er fjernet. Princippet bag fremstilling af ELISA-testen: ELISA testen udføres på en plastikplade med en række små brønde. Princippet er, at man fastklæber antigener fra EBV-virus på brøndens bund og sider. Herefter tilsættes serum med eventuelle antistoffer (IgG) fra patienten. Disse antistoffer vil binde til antigenerne. For at påvise antigen-antistof komplekset tilsættes endnu et antistof. Dette antistof binder til IgG som, når det bindes, aktiverer et enzym. Det aktive enzym kan påvises ved at tilsætte et specielt substrat, som ved reaktion udløser en kraftig farvereaktion. Materialer til forsøget. Varmeskab til inkubering af prøver ved 37 C En plastplade med 8 brønde En automatpipette/mikropipette 0-50 µl og 0-250µL Spidser til pipette Bæger til affald Bægerglas til brugte spidser Bægerglas med 10 ml fosfatbufferopløsning (PBS) 8 Eppendorf rør med prøverne A-H : 46

47 Oversigt over indholdet i prøverne A-H: Rør Indhold Mærket som Kommentar A 0,5mL EBV antigener EBV B 75µL Positiv kontrol + Indeholder IgG C 75µL Donor 1 serum DS1 Serum fra patient D 75µL Donor 2 serum DS2 Serum fra patient E 75µL Donor 3 serum DS3 Serum fra patient F 75µL Donor 4 serum DS4 Serum fra patient G+PBS 0,5mL Sekundær antistof 2'anti Antistof mod IgG +enzym H 0,4mL Substrat substrat Substrat til reaktion med enzym * Til læreren: opløsningerne A-F kan laves i forvejen. Metode: Udførsel af testen trin for trin. OBS DET ER VIGTIGT AT BRUGE RENE SPIDSER HVER GANG. Påsætning af antigener. 1. Start med at mærke brøndene 1-6 (2 brønde er i overskud) 2. Tilsæt 50µL EBV fra rør A til hver af brøndene 1-6 og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. 3. Sug forsigtigt væsken op af brøndene (går til affald). 4. Vask hver brønd en gang med PBS (fosfatbuffer opløsning). Dette gøres ved, forsigtigt, at fylde 250µL PBS i brønden. Fjern herefter væsken og smid den ud (affald). Undgå at spilde i brønden ved siden af. Påsætning af prøver. Tilsæt nu følgende til brøndene 1-6 HUSK AT SKIFTE SPIDSER. brønd µl PBS brønd µl fra rør B brønd µl fra rør C brønd µl fra rør D brønd µl fra rør E brønd µl fra rørf (fosfatbuffer opløsning/neg.kontrol) + (+ positiv kontrol) DS1 DS2 DS3 DS4 47

48 Inkubering af prøverne. Prøverne sættes i varmeskab til inkubering ved 37 C i 15 minutter. Efter inkubering fjernes væsken forsigtigt fra brøndene (HUSK ny spidser) Hver brønd vaskes med 250 µl PBS- se under punkt 4 (under påsætning af antigener) Tilsætning af sekundær antistof. Tilsæt nu 50 µl "2'anti" til alle 6 brønde inkuber prøverne ved 37 C i 15 minutter. Efter inkubering fjernes væsken fra hver brønd med hver sin spids (affald) Hver brønd vaskes med 250 µl PBS- se under punkt 4 (under påsætning af antigener). Tilsætning af substrat. Tilsæt 50 µl "substrat" til alle 6 brønde Inkuber prøverne ved 37 C i 5 minutter. Analyser prøverne ved at iagttage farvereaktion efter ca. 5 minutter. Kommentar til reaktionen mellem de sekundære antistoffer/ enzym og substratet. De sekundære antistoffer (2'anti), som bruges i reaktion er fremstillet ved immunisering med human IgG i kanin eller ged. Efter oprensning kobles enzymet peroxidase på anti-igg (2'anti). Peroxidase omdanner brintoverilte 2 H 2 O 2 2H 2 O + O 2 Peroxidase er et enzym med en meget høj katalytisk aktivitet, idet det kan omdanne 10 6 molekyler per sekund. Substratet som tilsættes prøven består af H 2 O 2 og et stof kaldet ABTS, som har den egenskab, at det i oxyderet tilstand bliver grønt. Når substratet tilsættes begynder peroxidasen straks at nedbryde H 2 O 2 og der dannes herved O 2 som kan oxydere ABTS. ABTS bliver herved grøn. ABTS : azino-diethylbenzthiazoline sulfonate. 48

49 Rapportvejledning: Teori: 1. Beskriv funktionen af de forskellige celler i immunforsvaret. 2. Gør rede for hvordan immunforsvarets hukommelse virker. 3. Gør rede for hvordan et antistof er opbygget Materialer/metode: Skriv kun hvis der er ændringer til øvelsesvejledningen Resultat: Tag et foto af jeres resultater og gør rede for hvilke patienter, der er smittet med mononukleose. Diskussion: 1. Forklar, princippet bag den reaktion man ser, når resultatet af testen er positiv. 2. Forklar, hvorfor kontrolforsøget i brønd 2 giver positivreaktion. 3. Forklar, hvorfor man har et kontrolforsøg, hvor der kun tilsættes PBS. 4. Når man udfører ELISA testen i praksis testes der både for IgM og IgG. Endvidere bestemmer man hvor kraftig farven er. Jo kraftigere farven er, des flere antistoffer har testpersonen i sit blod. Forklar hvordan disse oplysninger kan være med til at klarlægge sygdomsforløbet. 5. Giv eksempler på hvordan smitte generelt kan overføres fra person til person. 6. Hvorfor kan vi kun i nogen tilfælde vaccinere effektivt mod virus infektioner? Fejlkilder: Angiv hvilke fejlkilder der er i forsøget. Konklusion: 49

50 Eksperiment nr.: Mitosen - den almindelige celledeling Rapporten er udført af: I samarbejde med: Dato: Rettet af: 50

51 Øvelsesvejledning: Mitosen - den almindelige celledeling. Relevant baggrundstof: Cellens opbygning, cellens cyklus, den almindelige celledeling - mitosen, de genetiske grundbegreber som: gener, alleler, kromatider og kromosomer. Teori: Der er to former for celledeling, den almindelige celledeling (mitosen) og den celledeling der fører til dannelsen af kønsceller (meiosen). I denne øvelse skal vi beskæftige os med mitosen. Formålet med mitosen er at skabe nye celler, som er identiske med den oprindelige celle. Denne form for celledeling sker i organismen, når den vokser eller i forbindelse med udskiftning af slidte celler. Inden celledelingen kopieres cellens arvemateriale, DNA, det betyder at kromosomerne nu findes i en struktur, som består af to ens DNA strenge også kaldet kromatider. Kromatiderne holdes sammen ved hjælp af et såkaldt centromer. Under celledelingen adskilles kromatiderne og føres til hver sin ende i cellens cytoplasma (cellens pol), herefter deles cellens cytoplasma og der dannes ny membran omkring de to nye celler. Celledelingen består således af tre vigtige trin: Kopiering af arvematerialet (DNA) Adskillelse af de to kopier (kromatiderne) Deling af cellens cytoplasma Formål: I denne øvelse skal man ved hjælp af mikroskopet se og identificere de forskellige faser i mitosen. Der fremstilles et mitose præparat af løgceller i deling eller der kan bruges faste mitosepræparater. Anvend figuren side 3 Materialer: Rødder fra rødløg eller hyacinter i god vækst Objektglas, dækglas 1% orcein i 45% eddikesyre (færdiglavet) Spritbrænder Præparernål Filterpapir Mikroskop Metode: Det er muligt selv at fremstille et mitose præparatet. Dette gøres ved at tage en rodspids i vækst f.eks. fra løg, bønnespirer eller hyacinter. Den yderste spids er rodens vækstzone og her vil der hele tiden være celler i deling fordi roden vokser. Ved at farve rodspidsen med orcein kan man farve cellens DNA og cellens kromosomer bliver på denne måde synlige i mikroskopet. 51

52 Fremstilling af mitosepræparat: 1. Der skæres 1-2 mm af rodspidsen - en rodspids i god vækst kendes på, at den har en mælket zone. 2. Rodspidsen overføres til et objektglas med en dråbe orcein (1% i 45% eddikesyre) og findeles med en præparernål. Herefter lægges et dækglas på så farven ikke fordamper. 3. Præparatet opvarmes til ca. 60 C over en spritflamme (det må ikke koge). Ved opvarmningen bliver cellerne bløde og midtlamellen opløses. 4. Læg nu et stykke filterpapir stramt ud over glasset og bank forsigtigt på dækglasset med enden af præparernålen. Efterfulgt af et kraftigt tryk med tommelfingeren. På denne måde opnår man at sprede cellerne. 5. Cellerne er nu klar til mikroskopet. Brug af mikroskopet: Husk altid at stille skarpt inden der skiftes forstørrelse ellers ødelægger man præparatet og mikroskopet. 1. Fastgør præparatet i klemmen på mikroskopets bord. 2. Vælg den forstørrelsen/objektivet mærket 4x (dette svarer til en forstørrelse på 40x) 52