ANTISERUM SALMONELLA SEROTYPEBESTEMMELSE AF SALMONELLA

Transkript

1 ANTISERUM SALMONELLA SEROTYPEBESTEMMELSE AF SALMONELLA 1. KLINISK VÆRDI Salmonella er ansvarlig for mange alvorlige infektioner, som er meget forskellige på grund af de mange bagvedliggende serotyper og variationen i de kliniske syndromer, de fremkalder. Salmonella-arten består af to underarter: S. bongori (20 serovarer) og S. enterica (2.415 serovarer). S. enterica-arterne er opdelt i seks underarter: - S. enterica subsp. enterica (I eller 1) - S. enterica subsp. salamae (II eller 2) - S. enterica subsp. arizonae (IIIa eller 3a) - S. enterica subsp. diarizonae (IIIb eller 3b) - S. enterica subsp. houtenae (IV eller 4) - S. enterica subsp. indica (VI eller 6). Serovarer af enterica-underarter (1.435 serovarer) repræsenterer 99,5 % af de isolerede stammer (1). I Kauffmann-White-skemaet (1) klassificeres serovarerne ifølge kombinationen af somatiske antigener (O) og flagellare antigener (H) til Salmonella. Denne antigenetiske formel fastlægges ved hjælp af agglutinationssera (anti-o og anti-h). Gruppe O-betegnelse Gruppe O-serovarer, som blev identificeret først, blev betegnet af bogstaver fra alfabetet, men efterfølgende var det nødvendigt at fortsætte med at bruge numre. Det er nu mere logisk at betegne hver O-gruppe med den karakteristiske O-faktor. Overensstemmelse mellem alfabetisk nomenklatur og karakteristisk O-faktor Gruppes alfabetiske nomenklatur Gruppe O-antigen Gruppes alfabetiske nomenklatur Gruppe O-antigen Gruppes alfabetiske nomenklatur Gruppe O-antigen A 2 I 16 R 40 B 4 J 17 S 41 C1 C2 C3 6, 7, 8 K 18 T 42 D 9 L 21 U 43 E1 E2 3, 10 M 28 V 44 E4 1, 3, 19 N 30 W 45 F 11 O 35 X 47 G1 G2 13 P 38 Y 48 H 6, 14 Q 39 Z FORMÅL Salmonella-antisera (anti-o og anti-h) er beregnet til serologisk identifikation af Salmonella-kulturer til epidemiologiske formål ogmed henblik på diagnosticering ved hjælp af pladeagglutinationsmetoden. 3- PRINCIP Testen er baseret på agglutination, med specifikke antisera (anti-o og anti-h), af bakterier, der besidder de tilsvarende antigener. Disse antisera anskaffes ved vaccination af kaniner med udvalgte stammer af Salmonella. Monovalente sera adsorberes for at øge specificiteten. De bliver membranfiltreret og der tilsættes natriumazid med en koncentration på 0.1 %. 1. Sera til pladeagglutination a) O-sera Polyvalente O-sera til styring af serotypebestemmelse Disse polyvalente O-sera bliver ikke adsorberet. De er designet til at styre serotypebestemmelsen og anbefales grundlæggende til konstatering af Salmonella i madvarer og i omgivelserne. Størstedelen (ca. 98 %) af de Salmonella-bakterier, der optræder hos mennesker og varmblodede dyr, besidder et O-antigen, som svarer til de agglutininer, der findes i OMA- og OMB-sera. 1

2 O-sera til bestemmelse af den antigenetiske formel Disse sera er designet til identifikation af gruppe O. De skal bruges i logisk rækkefølge (polyvalent, derefter gruppespecifik monovalent osv.), muligvis som en funktion af bestemte biokemiske kendetegn (f.eks. serotyperne Typhi og Paratyphi A). Sekundære O-faktorer undersøges først på et senere stadium. Eksempel: - faktorerne O:7 og O:8 testes kun, når der observeres agglutination i O:6-, 7- eller 8-serum. - faktor O:15 testes kun, når der observeres agglutination i O:3-, 10- eller 15-serum. Agglutination kun med monovalente O-sera muliggør identifikation af gruppe O Anti-Vi-serum Vi-antigenet er et antigen med en varmefølsom overflade, som kan tilsløre den somatiske, antigenetiske aktivitet. Det viser sig primært for S. typhi-stammer og hurtigere for S. Paratyphi C-stammer. Salmonella-bakterier, der besidder dette antigen, agglutineres ikke af O-antisera. Når en stamme ikke agglutinerer OMA-"blandingen" eller OMB-"blandingen", anbefales det at teste denne stamme med Viserum. Hvis der observeres en positiv reaktion, skal bakteriesuspensionen opvarmes til 100 C i 30 minutter, før testen gentages med polyvalente OMA- og OMB-sera og de tilsvarende monovalente sera. b) H-sera H-sera til styring af serotypebestemmelse På samme måde som specifikke O-sera er H-sera meget nyttige, når du skal identificere meget forskellige serotyper (fødevarebakteriologi, miljøbakteriologi). H-sera til bestemmelse af den antigenetiske formel Disse sera anvendes efter samme logik som O-sera. Eksempel: - De monovalente sera H:2, H:5, H:6 og H:7 anvendes, når der observeres agglutination i polyvalent H1-serum. - De monovalente sera z10 og z15 anvendes, når der observeres agglutination i det polyvalente HE-serum osv. 2. Faseinversionssera Anti-H-faseinversionssera (Sven Gard-metode): Hvis bakteriemængden udgør en jævn fordeling på fase 1 og 2 for H-antigenet, kan de påvises og muliggøre en identifikation af serovaren. Hvis du derimod kun kan identificere den ene af de to faser for H-antigenet, skal specificiteten for anden fase bestemmes ved hjælp af Sven Gard-faseinversionsagar, hvor der tilsættes en dråbe SG-antiserum, som indeholder agglutininet til den fase, der allerede er bestemt. Sven Gard-medium (kode 53431) er et tilstrækkeligt blødt agar, til at en mobil Salmonella-bakterie, som er inokuleret midt på en Petri-plade, kan invadere overfladen på mediet efter inkubation i løbet af en nat. 4- EMBALLAGE Polyvalente og monovalente sera leveres i pipetteflasker à 3 ml (60 tests). O-SERA Polyvalente O-sera til styring af serotypebestemmelse Polyvalente sera Antiserum Salmonella polyvalent OMA Antiserum Salmonella polyvalent OMB Indeholder agglutininer for grupper A, B, D, E, L C, F, G, H Tilsvarende somatiske O-antigen 1, 2,12 + 4, 5,12 + 9,12 + 9,46 + 3,10 + 3,15 + 1,3, , 7 + 6, , , , 14, , 20 Antiserum Salmonella polyvalent OMC I, J, K, M, N, O, P Antiserum Salmonella polyvalent OMC Q, R, S, T, U, V, W Antiserum Salmonella polyvalent OME X, Y, Z, Antiserum Salmonella polyvalent OMF Antiserum Salmonella polyvalent OMG Kode

3 Monovalente sera til bestemmelse af den antigenetiske formel Monovalente sera Gruppe Kode Monovalente sera Gruppe Kode Antiserum Salmonella monovalent O:1, 2 A Antiserum Salmonella monovalent O:3, 10, 15 E1, E Antiserum Salmonella monovalent O:4,5 B Antiserum Salmonella monovalent O: Antiserum Salmonella monovalent O:6,7,8 C Antiserum Salmonella monovalent O:1, 3, 19 E Antiserum Salmonella monovalent O: Antiserum Salmonella monovalent O:11 F Antiserum Salmonella monovalent O: Antiserum Salmonella monovalent O:13, 22, 23 G Antiserum Salmonella monovalent O:9 D Antiserum Salmonella monovalent O:6, 14, Antiserum Salmonella Monovalent Vi (kode 60951) H-SERA Polyvalente sera til styring af serotypebestemmelse Polyvalente sera Tilsvarende flagellart antigen Kode Antiserum Salmonella polyvalent HMA a + b + c + d + i + z10 + z Antiserum Salmonella polyvalent HMB e, h + e, n, x + e, n, z15 +G Antiserum Salmonella polyvalent HMC k + y + z + L + Z4 + r Antiserum Salmonella polyvalent HMD z35 + z36 + z38 + z39 + z41 + z42 + z44 + z Antiserum Salmonella polyvalent HMIII facteurs H des sous-espèces III (Arizona) z52 + z53 + z54 + z55 + z57 + z Polyvalente sera til bestemmelse af den antigenetiske formel Polyvalente sera Kode Antiserum Salmonella polyvalent H1 H1 = 1,2 +1,5 + 1,6 + 1,7 + z Antiserum Salmonella polyvalent HL HL = l, v + l, w + l, z13 + l, z28 + l, z Antiserum Salmonella polyvalent HE HE = e, h + e, n, x + e, n, z Antiserum Salmonella polyvalent HZ4 HZ4 = z4,z23 + z4,z24 + z4,z Antiserum Salmonella polyvalent HG HG = f, g + g, p + g, m, s + g, m + m, t Monovalente sera til bestemmelse af den antigenetiske formel Monovalente sera Kode Antiserum Salmonella monovalent H:r Antiserum Salmonella monovalent H:a Antiserum Salmonella monovalent H:v Antiserum Salmonella monovalent H:b Antiserum Salmonella monovalent H:w Antiserum Salmonella monovalent H:c Antiserum Salmonella monovalent H:x Antiserum Salmonella monovalent H:d Antiserum Salmonella monovalent H:y Antiserum Salmonella monovalent H:g, m Antiserum Salmonella monovalent H:z Antiserum Salmonella monovalent H:g, p Antiserum Salmonella monovalent H: z Antiserum Salmonella monovalent H:h Antiserum Salmonella monovalent H: z Antiserum Salmonella monovalent H:i Antiserum Salmonella monovalent H: Antiserum Salmonella monovalent H:k Antiserum Salmonella monovalent H: Antiserum Salmonella monovalent H:m Antiserum Salmonella monovalent H: Antiserum Salmonella monovalent H:p Antiserum Salmonella monovalent H:

4 Anti-H-faseinversionssera (sven gard-metode) Polyvalente sera Agglutininer Kode Antiserum Salmonella SG1 a + b+ c+ z Antiserum Salmonella SG2 d + i + e, h Antiserum Salmonella SG3 k + y + l, v + l, w + l, z13 + l, z Antiserum Salmonella SG4 r + z Antiserum Salmonella SG5 e, n, x + e, n, z Antiserum Salmonella SG6 1, 2 + 1, 5 + 1, 6 + 1, 7 + z OPBEVARING Seraene er stabileindtil udløbsdatoen på etiketten, hvis de opbevares ved +2 8 C, og der ingen kontamination forekommer (selv i åben tilstand). 6- KRÆVET MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER Glasplade. Plastic- eller platininokulationspodepind. Fysiologisk saltvand. 7- FORHOLDSREGLER FOR BRUG Benyt altid de aktuelle teknikker og følg de gældende forholdsregler med henblik på forebyggelse af mikrobielle risici ved håndtering og bortskaffelse af materialer og biologiske produkter, der er anvendt i agglutinationsreaktionen. Dette serum indeholder < 0,1% natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- eller kobberrør og danne højeksplosive metalazider. Når du fjerner disse reagenser, skal du skylle med rigelige mængder vand for at undgå dannelse af azidaflejringer. Undgå at fortynde reagenserne. 8- PROCEDURE 1) Sera til pladeagglutination Serotypebestemmelse udføres efter identifikation af arterne på en ren, frisk Salmonella-kultur, der er isoleret på ikke-selektivt agarmedium. Udfør en kontroltest på den stamme, du vil teste, i fysiologisk saltvand: Tag en smule af Salmonella-kulturen op med en podepind. Opløs disse bakterier i en dråbe fysiologisk saltvand, og sørg for en ensartet suspension. Der bør ikke kunne observeres agglutination med fysiologisk saltvand. Hvis der observeres agglutination, er der tale om en selvagglutinerende stamme, og du kan ikke udføre testen med antisera. Start med at teste agglutinationen med polyvalente sera og derefter med specifikke sera, der svarer til den blanding, der giver den angivne agglutination (polyvalent O og monovalent O og derefter polyvalent H og monovalent H). Placér 1 dråbe antiserum på pladen. Tag en smule af Salmonella-kulturen op med en podepind (fra kulturens vådeste zone for at konstatere H-antigener). Opløs disse bakterier i antiserumdråben, og sørg for en ensartet suspensionen ved at tilføje bakterier til serum gradvist. Ryst pladen med en forsigtig, drejende bevægelse. Undersøg blandingen ved direkte aflæsning, mens du holder pladen hen over en mørk overflade eller et hulspejl. 2) Faseinversion Tilsæt en dråbe SG-serum, som indeholder agglutininet til den fase, der allerede er bestemt, til smeltet Sven Gard-agar, der er afkølet til omtrent 45 C. Ryst mediet med en drejende bevægelse for at sikre en ensartet blanding af serummet. Hæld det derefter på en Petri-plade. Hvis der stadig er kondenserede vanddråber på overfladen efter solidificeringen, skal du tørre agaren ved at lade låget stå halvt åbent. Inokulér grundigt 3 4 Salmonella-kolonier i midten af Petri-pladen fra en ren, frisk kultur på agarmedium. Inkubér ved 37 C i 18 timer (mens pladens låg vender opad). Søg efter agglutination med anti-h-sera i yderkanten af agarens invasionszone (ifølge den procedure, der er beskrevet ovenfor). 4

5 Eksempel: O:4-, O:5-, H:1- og H:2-antigener blev identificeret i en Salmonella-prøve, som skulle undersøges. SG6-serum (1,2 + 1,5 + 1,7 + z6) anvendes til faseinversion. Den efterfølgende dag angiver agglutination med: - anti-h:i-serum forekomsten af Salmonella typhimurium (O:1, 4, [5], 12 H:i:1.2) - anti-h:b-serum forekomsten af Salmonella paratyphi B (O:1, 4, [5], 12 H:b:1.2). 9- FORTOLKNING AF RESULTATERNE En positiv reaktion viser sig som forekomst af agglutination inden for maksimalt 1 minut. O-agglutination er fin og regelmæssig og meget let at skelne fra eventuelle fragmenter af bakteriekolonier, som ikke er helt emulgerede. Bemærk : Enhver O-agglutinérbar Salmonella-kultur agglutineres straks i ét af de polyvalente sera. Samtidigt kan der observeres mere forsinket og mindre intens agglutination i ét eller flere andre sera. Når en stamme ikke agglutinerer OMA-"blandingen" eller OMB-"blandingen", anbefales det at teste denne stamme med Viserum. S. Typhi i V-form er ikke O-agglutinérbar, når den er levende, og den bliver først O-agglutinérbar efter opvarmning af suspensionen. HMA-, HMB-, HMC- og HMD-sera indeholder ikke O-agglutininer, men O-agglutininerne findes i HM III-serum. Hvis en kultur agglutineres af dette serum, kan du bekræfte H-agglutinationens sande natur ved at tilsætte 1 dråbe HM III-serum til 1 ml bakteriesuspension. Efter 2 timer i et vandbad på 37 C, observeres en fnugagtig agglutination i den stamme, der indeholder et antigen, der svarer til antistoffet i serummet. En stamme, der besidder H:g-faktoren, agglutineres af H:g,m-serum foruden H:g,p-serum. H1-serummet anvendes til at konstatere en stamme med H-antigenet i "uspecifik" fase 2 (1, 2 or 1, 5 eller 1, 7). 10- YDEEVNE FOR TESTEN OG KVALITETSKONTROL Aktiviteten for de polyvalente og monovalente Salmonella-antisera kontrolleres ved hjælp af følgende positive stammer: O-SERA Serum Stamme Antigenetisk struktur OMA Paratyphi A (O:1,2,12 H:a : [1,5]) OMB Newport (O:6,8,20 H:e,h : 1,2 [z67]) OMC Tel Aviv (O:28 H:y : e,n,z15) OMD Champaign (O:39 H:k :1,5) OME Bergen (O: 47, H: i : e,n,z15) OMF Uccle (O: 3,54 H: g,s,t : -) OMG IIIa (Arizona) (O:63 H: g, z51 : -) O:1, 2 Paratyphi A (O:1,2,12 H:a : [1,5]) O:4, 5 Typhimurium (O:1,4,[5],12 H:i :1,2) O:6, 7, 8 Newport (O:6,8,20 H:e,h :1,2 [z67]) O:7 Braenderup (O:6,7,14 H:e,h : e,n,z15) O:8 Blockley (O:6,8 H:k : 1,5) O:9 Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) O:3, 10, 15 London (O:3,10 [15] H:l,v : 1,6) O:15 Strasbourg (O:9,46 H:d : 1,7) O:1, 3, 19 Senftenberg (0:1,3,19 H:g,[s],t : -) O:11 Aberdeen (O:11 H: i : 1,2) O:13, 22, 23 Grumpensis (O:1,13,23 H:d :1,7) O:6, 14, 24 Carrau (O:6,14,[24] H:y :1,7) 5

6 VI-SERA Serum Stamme Antigenetisk struktur Vi Typhi (0:9,12,[Vi] H:d : -) FASEINVERSIONSSERA Serum Stamme Antigenetisk struktur SG 1 Paratyphi A (O:1,2,12 H: a : [1,5]) SG 2 Newport (O:6,8,20 H:e,h :1,2 [z67]) SG 3 Thompson (O:6,7,14 H:k :1,5) SG 4 Heidelberg (O:1,4,[5],12 H: r : 1,2) SG 5 Abortusequi (O:4,12 H: - : e,n,x) SG 6 Typhimurium (O:1,4,[5],12 H: i :1,2) H-SERA Serum Stamme Antigenetisk struktur HMA Paratyphi A (O:1,2,12H: a : [1,5]) HMB Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) HMC Blockley (O:6,8 H: k : 1,5) HMD Fresno (O:9,46H: z38 : -) HM III IIIb (Arizona) (O:65 H: c: z53) H1 Bovismorbificans (O:6,8,20 H: r,[i] : 1,5) HL Livingstone (O:6,7,14 H: d : l,w) HE Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2) HZ4 Dusseldorf (O:6,8 H: z4, z24 : -) HG Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) a Paratyphi A (O:1,2,12 H: a : [1,5]) b Paratyphi B (O:1,4,[5],12 H: b : 1,2) c Paratyphi C (O:6,7,[Vi] H: c: 1,5) d Livingstone (O:6,7,14 H: d : l,w) g, m Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) g, p Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) h Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2 [z67]) i Typhimurium (O:1,4,[5],12 H: i : 1,2) k Blockley (O:6,8 H: k : 1,5) m Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) p Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) r Infantis (O:6,7,14 H: r : 1,5) v London (O:3,10 [15] H: l,v : 1,6) w Meleagridis (O:3,10 [15][15, 34] H: e,h : l,w) x Abony (O:1,4,[5],12,27 H: b : e,n,x) y Carrau (O:6,14,[24] H: y :1,7) z Worthington (O:1,13,23 H: z :l,w) z10 Lexington (O:3,10,[15] [15,34]H: z10 :1,5) z15 Brandenburg (O:1,4,[5],12,27 H:l,v:e,n,z15) 2 Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2 [z67]) 5 Infantis (O:6,7,14 H: r : 1,5) 6 London (O:3,10 [15] H: l,v : 1,6) 7 Carrau (O:6,14,[24] H: y :1,7) 6

7 11- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles ifølge vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialerne til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og markedsføres kun, hvis det opfylder de fastsatte kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for Bio-Rad. 12- BEGRÆNSNINGER FOR BRUG Identifikation af bakteriearterne skal udføres før bestemmelsen af serotypen. Kun en komplet serotypebestemmelse af O- og H-antigenerne muliggør en definitiv serologisk identifikation. 13- DE MEST ALMINDELIGE SEROTYPER De Salmonella-typer, der oftest isoleres, er Salmonella enteritidis og Salmonella typhimurium. Gruppe B (O: 4) O H Abony 1,4,[5],12,27 b e,n,x Agona 1,4,12,27 f,g,s [1,2] Brandenburg 1,4,[5],12,27 l,v e,n,z15 Bredeney 1,4,12,27 l,v 1,7 Coeln 1,4,[5],12 y 1,2 Derby 1,4,[5],12 f,g [1,2] Heidelberg 1,4,[5],12 r 1,2 Indiana 1,4,12 z 1,7 Paratyphi B 1,4,[5],12 b 1,2 Saintpaul 1,4,[5],12 e,h 1,2 Schwarzengrund 1,4,12,27 d 1,7 Stanley 1,4,[5],12,27 d 1,2 Typhimurium 1,4,[5],12 i 1,2 Gruppe E1 - E2 (O: 3, 10-3, 15) Anatum 3,10 [15][15, 34] e,h 1,6 London 3,10 [15] l,v 1,6 Meleagridis 3,10 [15][15, 34] e,h l,w Muenster 3,10 [15][15, 34] e,h 1,5 Groupe E4 (O: 1, 3, 19) Senftenberg 1,3,19 g,[s],t - Gruppe A (O: 1, 2) Paratyphi A 1,2,12 a [1,5] 7

8 Gruppe D1 (O: 9) O H Dublin 1,9,12 [Vi] g,p Enteritidis 1,9,12 g,m - Napoli 1,9,12 l,z13 e,n,x Panama 1,9,12 l,v 1,5 Typhi 9,12,[Vi] d - Gruppe C1 (O: 6, 7) Braenderup 6,7,14 e,h e,n,z15 Infantis 6,7,14 r 1,5 Livingstone 6,7,14 d l,w Mbandaka 6,7,14 z10 e,n,z15 Montevideo 6,7,14 g,m,[p],s [1,2,7] Ohio 6,7,14 b l,w Thompson 6,7,14 k 1,5 Virchow 6,7 r 1,2 Gruppe C2 - C3 (O: 6, 8) Blockley 6,8 k 1,5 Bovismorbificans 6,8,20 r,[i] 1,5 Goldcoast 6,8 r l,w Hadar 6,8 z10 e,n,x Kottbus 6,8 e,h 1,5 Litchfield 6,8 l,v 1,2 Muenchen 6,8 d 1,2 [z67] Newport 6,8,20 e,h 1,2 [z67] Understregede O-faktorer (f.eks. 1, 4, 12): faktorer, hvis forekomst er forbundet med bakteriofagkonversion. De forekommer kun, når kulturen er lysogeniceret af det tilsvarende konversionsfag. Faktorere vist i parentes (f.eks. 9, 12, [Vi]): kromosomdefineret faktor, der kan forekomme eller udeblive uden betydning for serotypediagnosticeringen. 14- REFERENCER 1. POPOFF M. Y., LE MINOR L., 1997, Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 7 th revision. WHO collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /08 8