Sensorer og hurtigmetoder til fækale indikatorbakterier hvor svært kan det være?

Transkript

1 Nye hurtigmetoder ensorer og hurtigmetoder til fækale indikatorbakterier hvor svært kan det være? Tak til Annette. Bukh Mary Bjerring Rasmussen Margit Paulsen Ann Palmdahl Brønnum Peter, Annette. Bukh og Mary B. Rasmussen ektion for Miljøteknologi Institut for Kemi og Bioteknologi Aalborg Universitet Develop and evaluate luminescence and fluorescence based detection of indicator bacteria ColiBox et kombineret koncept til filtrering og fluorescens baseret påvisning af coliforme bakterier og. coli i vand lide 1 1af 31 lide 2 2af 31 Indikatorbakterier D/IO metoder Fækale indikatorbakterier i drikkevand Coliforme bakterier. Indikator for fremmede bakterier, der ikke normaltfindes i drikkevand.. coli. Indikator for fækale bakterier. Forekomst skyldes eksterne forureningskilder. Intestinale enterokokker. Indikator for fækale bakterier. Kan supplere. coli målinger. Forekomst skyldes eksterne forureningskilder. Grænseværdier Afgang vandværk: <1 / 100 m Indgang ejendom: <1 / 100 m Udfordring: Bakteriologiske D/IO metoder til drikkevand er ofte langsomme, arbejdskrævende og ikke altid entydige.. Hurtigmetoder 6 timer Kort analysetid Følsomhed, pecificitet Traditionelle i metoder 20 timer lide 3 3af 31 lide 4 4af 31 1

2 Udfordringer.. Måleprincip om at finde en nål Mange potentielle detektionsprincipper Mulige targets: generelle eller specifikke enzymer () i bakterier () Fluorescerende eller luminescerende substratanaloger () => måling af Fluorescens og/eller uminescens () () efter tilsætning af enhancer () 1. coli : grundvandsbakterier lide 5 5af 31 lide 6 6af 31 Hurtigmetoder Måleprincip (generelt) ksempler på hurtigmetoder til coliforme bakterier i drikkevand Colilert Colisure Colifast Coliguard Coliight Tecta XplOrer64 Filtrering ( ) Reaktionsmix nhancer Detektion Variable: substrater, co substrater, kinetik, temperatur, ph, buffere, inkubationstid, permeabilisering, signalforstærkere m.m. Og andre. lide 7 7af 31 lide 8 8af 31 2

3 Journal of Applied Microbiology IN ORIGINA ARTIC Characterization and validation of a chemiluminescent assay based on a 1,2-dioxetane for rapid detection of enterococci in cont am inated w ater and comparison w it h standard methods and qpcr A.. Bukh and P. Department of Biot echnology, Chemist ry and nvironment al ngineering, Aalborg Universit y, Aalborg, Denmark Keywords Abstract 1,2-dioxet anes, early warning, f aecal indicator bact eria, qpcr, wast ewater, b-d-glucosidase. Aims: To evaluate the potent ial for using a novel chemiluminescence-based enzyme assay for rapid detection of enterococci in water cont aminated with Correspondence faecal waste. Pet er, Department of Biotechnology, Met hods and Results: The novel assay (ntight) was based on the enzymatic Chemist ry and nvironment al ngineering, hydrolysis of the chemiluminescent 1,2-dioxetane [(4-methoxy-4(3- b-d-glucoside-4-chlorophenyl)]spiro[1,2-dioxetane-3-1,3-tricyclo[7æ3æ1æ0 2,7 ]tridec-2,7-ene] Aalborg Universit y, ohngaardsholmsvej 57, DK-9000 Aalborg, Denmark. -mail: [email protected] speci fic for b-d-glucosidase. The specificity of the proposed ntight assay was charact erized using 26 different nterococcus st rains and 10 bacterial genera : received 15 January 2011, other than nterococcus. With an analysis time of 8 h, the assay was found to revised 13 April 2011 and accept ed 11 be sensitive and specific. Validation experiments were carried out using water May 2011 samples contaminated with raw municipal wastewater in comparison with qpcr and I O standard methods. ntight was successfully applied to detect doi: /j x enterococci in contaminat ed water within 8 h, and the proposed assay correlated well wit h both qpcr and I O standard methods (R 2 >0Æ776). Conclusions: ntight can be applied to rapid and simple detection of viable enter ococci in water contam inated wi th faecal matter. i gni ficance and I mpact of the t udy: The novel ntight assay and qpcr have the potential to be used as methods for early warning (1 7 h) of faecal pollutions in different wat er types. Phillips 2009). These biochemical traits are utilized in Introduction standard methods for determining the microbial water M embers of the nterococcus genus are widely used as quality based on enterococci (IO ; IO indicators of faecal pollution in surface water (Gerba ). The traditional methods for detecting 2009; Bonton et al. 2010; Farnleit ner et al. 2010; Wade enter ococci i n water ar e based on cul ti vati on for at l east et al. 2010), and a correlation between the exposure to h and even longer for confirmation steps. Thelong enterococci and the public healt h risk for swimmers in analysis time does not allow for rapid intervention in case marine and freshwaters has been described (Kay et al. of contaminat ion events, and more rapid tests for the 1994; Wade et al. 2006, 2008, 2010). determination of microbial water quality are needed The enterococci species are cat alase-negative, Grampositi ve cocci that are abl e to grow on medi a contai ni ng vation-dependent methods is the metabolic state of (Fiksdal and Tryland 2008). Another aspect of using culti- bile salts and the selective reagent sodium azide, to enter ococci i n envi r onmental waters. nter ococci ar e able hydrolyse esculin, and possess b-d-glucosidase activity to survive in aquatic matrices for long periods of t ime by (Devriese et al. 1993; Facklam et al. 2002; Fisher and starvation or by entering a viable but nonculturable state ª 2011 The Authors Journal of Applied M icrobiology 111, ª 2011 The ociety for Applied Microbiology 407 Validerede metoder FIBite Chemiluminescens metoder Coliforme og. coli [ Coliight II ] sammeligning g gmed standardmetoder + qpcr (Bukh og 2010; Bukh et al. in prep) nterokokker [ ntight ] sammeligning med standardmetoder + qpcr (Bukh og 2011) Hurtigmetode: FIB ite Target: Fækale indikatorbakterier (FIB) Princip: Fluorescens Analysetid: min Vandvolumen: 1 m >10 Optimeret: substrater, co substrater, kinetik, temperatur, ph, buffere, inkubationstid, permeabilisering, signalforstærkere Fluorescens metoder Journal Fækale indikatorbakterier [ FIB FIB ite ite ] Mikroorganismer (generel) [ ite ] Fingerprint (10 enzymaktiviteter) [ MT ite ] DNA (generel) [ dsdna ] Filtreret prøve + Reaktionsmix + nhancer Fluorescens lide 9 9af 31 lide af 31 FIBite FIBite: Baggrund og følsomhed forurenet med spildevand (laboratorieforsøg) 3,0+3 fra Aalborg, Aarhus og ønderborg vandforsyninger forurenet med spildevand (laboratorieforsøg) (Aalborg) + pildevand FIBite: 1 time MPN: 24 timer Relative Fluorescence Units [RFU] 2,5+3 2,0+3 1,5+3 1,0+3 R² = 0,9851 5,0+2 0, ,0+2. coli iforurenetdrikkevand (MPN) 1 vand filtreret 1 times analyse Konklusion: Muligt at påvise spildevandsforurenet drikkevand svarende til >10. coli 100 m 1 på 1 time (Baggrund) lide af 31 lide af 31 3

4 FIBite: prøvevolumen FIB i Biofilm ffekt af prøvevolumen på påvisning af fækal forurening drikkevand forurenet med spildevand Hurtig påvisning af fækal forurening i biofilm på PX rør + spildevand (1000:1) 0,001 1 filtreret 1 times analyse Konklusion: Baggrundssignal stiger ikke med øget prøvevolumen. Muligt at øge følsomhed ved at filtrere >100 m PX rør med drikkevand forurenet med spildevand lide af 31 lide af 31 Håndholdt detektion Kildesporing Potentiale for håndholdt detektor FIBite kan overføres til håndholdt format uden væsentlig tab af følsomhed Udfordring: Hvor stammer en mikrobiel forureningen fra? dyr eller spildevand? hvor i forsyningen? Mikrobiologiske kildesporing: Markører og forureningsprofiler gp Detektion af spildevandsforurening svarende til >10. coli 100 m 1 nm] Promega håndholdt [n R² = 0, Perkin lmer Plate Reader [nm] Profil/fingeraftryk X 9 Pilotforsøg Profilfor for drikkevand baseret på 10 enzymaktiviteter målt som fluorescens. lide af 31 lide af 31 4

5 Profil Indikatorbakterier 10 parametre (enzymaktiviteter) ksempler på aktivitetsprofiler for drikkevand med og uden mikrobiel forurening (100 m vand) Kimtal (D/IO 6222) Kim (22 C) Mikroorganismer der danner synlige kolonier (CFU) ved 22 C i trypton gærekstrakt agar på 68 ± 4 timer Indikator. Naturlige aerobe mikroorganismer. Forhøjet kimtal tyder på nedsat vandkvalitet og eventuelt vækst. forurenet med spildevand Grænseværdier Afgang vandværk: 50 ml 1 Indgang ejendom: 200 ml 1 Gammelt vand i PX rør >400 kim m lide af 31 lide af 31 ensorer og hurtigmetoder til fækale indikatorbakterier hvor svært kan det være? ektion for Miljøteknologi Institut for Kemi og Bioteknologi Aalborg Universitet lide af 31 5